周益帆 楊瀅 盧會(huì)敏 王靜 劉松青 王芳

摘 要： 為了探討堿法提取羊肚菌多糖的工藝條件并測(cè)定其抗氧化活性，該研究以四川北川羊肚菌為原料，采用堿法提取羊肚菌多糖，利用苯酚-硫酸法對(duì)羊肚菌多糖得率進(jìn)行測(cè)定，并通過(guò)單因素探討提取溫度（70、80、90、100 ℃）、提取時(shí)間（2、4、6、8 h）、堿液濃度（0.4、0.6、0.8、1.0 mol·L-1）、料液比（1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 g·mL-1）對(duì)羊肚菌多糖得率的影響，同時(shí)采用正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝，對(duì)其抗氧化活性進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明：在提取溫度90 ℃、提取時(shí)間5 h、堿液濃度0.7 mol·L-1、料液比1∶20（g·mL-1）條件下得到的羊肚菌多糖得率為5.39%。羊肚菌多糖具有較強(qiáng)的清除DPPH自由基、羥自由基、超氧陰離子的能力和較好的還原能力，其IC50分別為0.468、0.208、0.022、0.014 mg·mL-1，抗氧化能力依次為還原能力>超氧陰離子清除能力>羥自由基清除能力>DPPH自由基清除能力。優(yōu)化后的羊肚菌多糖提取工藝合理、可行，且羊肚菌多糖具有較強(qiáng)的抗氧化活性。

關(guān)鍵詞： 羊肚菌， 多糖， 堿提法， 工藝優(yōu)化， 抗氧化活性

中圖分類號(hào)： Q946 ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A ?文章編號(hào)： 1000-3142（2019）07-0887-09

Abstract： The alkali extraction method of polysaccharide from Morchella was optimized and its antioxidant activity was studied. Morchella in Beichuan County of Sichuan Province was selected as raw material， adopting alkali extraction method to extract polysaccharide， and then the polysaccharide extraction content was determined by phenol-sulfuric acid method. The extraction process of the polysaccharide was studied by single factor experiment and orthogonal experiment， which controlled extraction temperature （70， 80， 90， 100 ℃）， extraction time （2， 4， 6， 8 h）， alkali concentration （0.4， 0.6， 0.8， 0.6 mol·L-1）， solid-liquid ratio （1∶15， 1∶20， 1， 25∶30 g·mL-1）. Those antioxidant activities of polysaccharide were also assayed. The results of the optimal extraction conditions were as follows： Extraction temperature was 90 ℃， extraction time 5 h， concentration of alkali concentration 0.7 mol·L-1 and solid-liquid ratio 1∶20 g·mL-1， the maximum yield of polysaccharide was 5.39%. The polysaccharide of Morchella had a powerful scavenge DPPH free radicals， hydroxyl radicals， superoxide anions， as well as the good reduction capacity， whose IC50 were 0.468， 0.208， 0.022， 0.014 mg·mL-1， respectively. The polysaccharide of Morchella antioxidant capacity was arranged successively reduction capacity > superoxide anion > scavenging capacity > DPPH free radical scavenging capacity. The optimized extraction process of polysaccharide from Morchella was reasonable， feasible and had strong antioxidant activity.

Key words： Morchella， polysaccharide， alkali extraction method， technology optimization， antioxidant activity

羊肚菌是珍稀的野生食（藥）用菌之一，屬于真菌界子囊菌門(mén)子囊菌綱盤(pán)菌目羊肚菌科羊肚菌屬，因其形似羊肚而得名（趙琪等，2010）。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，羊肚菌多糖具有抗疲勞（Guo， 2015）、抗腫瘤（陳彥等，2008）、抗氧化（Zi et al.， 2018）等作用，且在一定程度上能夠減輕癌癥患者放療、化療引起的毒副作用（李娟等，2005）。因此，羊肚菌在醫(yī)學(xué)界和保健食品界倍受關(guān)注。已報(bào)道的羊肚菌多糖提取方法主要有酶提取法（Zhao et al.， 2018）、水提醇沉法（劉浪浪等，2009）、微波-超聲提取法（黃生全等，2010）等，以上提取方法均以破壞細(xì)胞壁為前提，促使多糖的溶出。但是，羊肚菌多糖存在于細(xì)胞壁中的小纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)基質(zhì)內(nèi)（李蔚，2008），大多與其蛋白質(zhì)結(jié)合在一起，測(cè)量其多糖得率時(shí)需要掩蔽蛋白質(zhì)的影響，使整個(gè)提取工藝流程變得復(fù)雜、費(fèi)時(shí)。任嘉興等（2018）、畢博和于榮利（2016）研究表明，水提醇沉法提取羊肚菌多糖的得率分別為4.24%、2.25%。吉仙枝和陳瑋（2007）研究表明，堿提法提取食用菌多糖的得率比水提法高約6倍。NaOH作為一種強(qiáng)堿，在一定濃度下能夠有效破除細(xì)胞壁，促使多糖-蛋白質(zhì)間的鍵裂解以及多糖溶出（孫玉軍等，2010）。因此，堿法提取羊肚菌多糖能提高多糖得率，且其提取工藝流程簡(jiǎn)單、高效。

目前，大多數(shù)抗氧化劑是人工合成品，對(duì)人們的健康有一定的威脅。天然抗氧化劑具有安全、無(wú)毒的特點(diǎn)，引起了人們的廣泛關(guān)注，尋找高效天然抗氧化劑已成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。研究已發(fā)現(xiàn)靈芝多糖（張志軍等，2011）、茶樹(shù)菇多糖（余萍等，2009）、梭柄松孢菇多糖（劉蒙蒙等，2013）、木耳多糖（孔沛筠等，2018）、鮑魚(yú)內(nèi)臟多糖（陳勝軍等，2019）等具有良好的抗氧化活性，而有關(guān)四川羊肚菌多糖抗氧化活性的研究報(bào)告甚是局限，開(kāi)展四川北川羊肚菌多糖抗氧性活性的研究顯得尤為重要。本研究對(duì)羊肚菌多糖提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，采用苯酚-硫酸法對(duì)羊肚菌多糖含量進(jìn)行測(cè)定，考察了提取溫度、提取時(shí)間、堿液濃度、料液比對(duì)羊肚菌多糖得率的影響，通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)對(duì)堿提工藝進(jìn)行優(yōu)化，測(cè)定其體外抗氧化活性，旨在為四川北川羊肚菌的開(kāi)發(fā)利用提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

材料：羊肚菌（由四川北川神農(nóng)有限責(zé)任公司提供，產(chǎn)地為四川北川）。試劑：2，4，6三吡啶基三嗪（TPTZ）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-2Na）、鄰苯三酚（PR）、鹽酸、過(guò)氧化氫、水楊酸、無(wú)水乙醇、苯酚、濃硫酸、NaOH，以上試劑均為分析純，購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器和設(shè)備

UV5000紫外分光光度計(jì)，安徽皖儀科技股份有限公司;SC-3610低速離心機(jī)，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司;DHG-9030A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海申光儀器儀表有限公司;HWS12恒溫水浴鍋，上海一恒科技有限公司;JA3003精密電子天平，上海良平儀器儀表有限公司;FK-A組織搗碎機(jī)，江蘇金壇市金城國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠;pHSJ-4F上海雷磁精密酸度計(jì)，儀電科學(xué)儀器股份有限公司;HC-2062離心機(jī)，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司;JH-ZLS-3真空旋轉(zhuǎn)濃縮儀，上海申光儀器儀表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 堿法提取羊肚菌多糖工藝流程 羊肚菌粉末→過(guò)篩→精確稱取1 g粉末→堿液提取→離心（1 000 r·min-1，5 min）→濾液→重復(fù)提取→合并濾液→真空減壓濃縮（至原體積1/3）→加入3倍體積95%乙醇（陳丹紅，2010）→4 ℃過(guò)夜醇沉（溶液中的多糖可被乙醇沉降下來(lái)）（薛雅茹等，2017）→離心（同上）→沉淀→干燥→溶解→測(cè)定吸光度。

1.3.2 羊肚菌多糖含量的測(cè)定 采用硫酸-苯酚法（Chu et al.， 2018）對(duì)羊肚菌多糖得率進(jìn)行測(cè)定：精密稱取105 ℃干燥至恒重的無(wú)水葡萄糖純品20 mg，置于100 mL容量瓶中超純水定容作為標(biāo)準(zhǔn)溶液，精密吸取2、4、6、8、10 mL分別置于100 mL容量瓶中定容，分別取1 mL葡萄糖溶液，隨后再加入0.5 mL 5%苯酚溶液，搖勻，再加入2.5 mL濃硫酸，混勻，于40 ℃水浴鍋中保溫30 min后，在490 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。

以葡萄糖含量（mg·mL-1）作為橫坐標(biāo)，以吸光度值作為縱坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為y=0.015 6x+0.000 4，R2=0.999 7。由線性回歸方程計(jì)算羊肚菌樣品中多糖得率。羊肚菌多糖得率=（多糖濃度×多糖體積×稀釋倍數(shù)）/羊肚菌干重×100%。

1.3.3 羊肚菌多糖堿法提取的單因素及正交試驗(yàn)優(yōu)化

1.3.3.1 多糖堿法提取的單因素試驗(yàn) 在保持其他條件不變的情況下，分別以不同的提取溫度（70、80、90、100 ℃）、提取時(shí)間（2、4、6、8 h）、堿液濃度（0.4、0.6、0.8、1.0 mol·L-1）和料液比（1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 g·mL-1）為單因素，考察各因素對(duì)羊肚菌多糖得率的影響。

1.3.3.2 多糖堿法提取正交試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以提取溫度、提取時(shí)間、堿液濃度、料液比為試驗(yàn)因素，依次用A、B、C、D表示，并以1、2、3分別代表各自的低、中、高水平，以羊肚菌多糖得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)確定最佳工藝參數(shù)。正交試驗(yàn)因素及水平編碼見(jiàn)表1。

1.3.4 羊肚菌多糖抗氧化活性研究

1.3.4.1 多糖的精制 利用Sevage法（郝博慧等，2011）除去粗多糖中蛋白質(zhì)。向粗多糖溶液中加入3倍體積的Sevage試劑（正丁醇∶氯仿=1∶5），充分振蕩7 ～ 8 min，于4 000 r·min-1下離心5 min，靜置10 min，吸取上清液，重復(fù)上述操作，直至無(wú)白色中間層。合并上清液，向其中加入3倍體積乙醇置于4 ℃冰箱過(guò)夜，離心，取沉淀，烘干備用。

1.3.4.2 多糖清除DPPH自由基能力的測(cè)定 參照Li et al.（2012）的方法，用95%乙醇稀釋羊肚菌多糖樣品，進(jìn)行清除DPPH自由基能力的測(cè)定，重復(fù)3次，以Vc作陽(yáng)性對(duì)照。

1.3.4.3 多糖羥自由基清除能力的測(cè)定 參照文獻(xiàn)（李順?lè)宓龋?008），用水楊酸法對(duì)羥自由基進(jìn)行測(cè)定，重復(fù)3次，以Vc作陽(yáng)性對(duì)照。

1.3.4.4 多糖超氧陰離子清除能力的測(cè)定 參照文獻(xiàn)（尹巧汕，2012），改進(jìn)如下：以鄰苯三酚自氧化法測(cè)定羊肚菌多糖對(duì)超氧陰離子的清除率，稀釋多糖溶液至0.025、0.05、0.075、0.1 mg·mL-1，于25 ℃恒溫水浴20 min，再加入相同處理的鄰苯三酚溶液，空白實(shí)驗(yàn)做相同處理，5 min內(nèi)每隔30 s測(cè)定一次吸光度。重復(fù)3次，以Vc作陽(yáng)性對(duì)照。

1.3.4.5 多糖鐵離子還原能力的測(cè)定 參照文獻(xiàn)Benzie & Strain（1996）的方法，取不同濃度梯度的FeSO4溶液，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線;取樣品濃度分別為0.025、0.05、0.075、0.1 mg·mL-1的溶液，參照參考文獻(xiàn)進(jìn)行試驗(yàn)。重復(fù)3次，以Vc作陽(yáng)性對(duì)照。

1.3.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 所有試驗(yàn)均重復(fù)進(jìn)行3次，試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（x ±sx）表示，用SPSS 20.0軟件計(jì)算各抗氧化指標(biāo)的IC50值。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取羊肚菌多糖的單因素試驗(yàn)

2.1.1 提取溫度對(duì)羊肚菌多糖得率的影響 圖1顯示，在70～90 ℃時(shí)，隨著提取溫度的升高，羊肚菌多糖得率持續(xù)增加，在提取溫度達(dá)到90 ℃時(shí)，羊肚菌多糖得率達(dá)到最高，為3.85%;超過(guò)90 ℃后，得率略微下降。這是由于提取溫度對(duì)羊肚菌細(xì)胞破壞程度（向東等，2004）和多糖分子運(yùn)動(dòng)（胡琴漢等，2018）有一定影響，在一定范圍內(nèi)，溫度越高，破壞程度和運(yùn)動(dòng)速度越大，越有利于多糖的溶出。而溫度過(guò)高可能會(huì)破壞多糖結(jié)構(gòu)，造成多糖得率的下降。綜合考慮，選擇90 ℃為最佳提取溫度。

2.1.2 提取時(shí)間對(duì)羊肚菌多糖得率的影響 圖2顯示，羊肚菌多糖得率隨提取時(shí)間的增加而增加。在2～4 h時(shí)羊肚菌多糖得率持續(xù)遞增。在提取時(shí)間達(dá)到4 h時(shí)，羊肚菌多糖得率最高，達(dá)4.98%;提取時(shí)間達(dá)到4 h之后，隨提取時(shí)間增加，多糖得率增幅不大，多糖溶出達(dá)到最大值（劉繼超等，2018）。因此，選擇4 h為最佳提取時(shí)間。

2.1.3 堿液濃度對(duì)羊肚菌多糖得率的影響 圖3顯示，羊肚菌多糖得率隨堿液濃度的增加呈先增大后降低的趨勢(shì)，堿液濃度在0.8 mol·L-1時(shí)，多糖得率最高，達(dá)到5.08%，之后隨著堿液濃度的增大而平緩下降。可能是堿液在一定濃度范圍內(nèi)能顯著提高胞內(nèi)外滲透壓差，增大細(xì)胞間距，使得羊肚菌組織變得疏松，讓多糖溶出更充分、快速（蔣玉梅等，2017）。但羊肚菌多糖在高濃度堿液中可能會(huì)降解，濃度過(guò)大，反而對(duì)多糖提取不利（王志剛等，2007）。因此，選擇0.8 mol·L-1為最佳堿液濃度。

2.1.4 料液比對(duì)羊肚菌多糖得率的影響 圖4顯示，在料液比為1∶15 ～ 1∶20（g·mL-1）的范圍內(nèi)，多糖得率隨料液比增大而增加，當(dāng)料液比為1∶20（g·mL-1）時(shí)，得率最大，為5.03%，在料液比為1∶20～1∶30（g·mL-1）的范圍內(nèi)，羊肚菌多糖得率增幅變化不大，多糖溶出達(dá)到最大值。在一定范圍內(nèi)，增加溶劑量會(huì)增大體系中固相和液相的接觸面積，從而提高多糖浸出的可能性，使多糖的得率提高（任嘉興等，2018）。因此，選擇1∶20（g·mL-1）為最佳料液比。

2.2 正交設(shè)計(jì)結(jié)果與分析

基于單因素試驗(yàn)，影響堿法提取羊肚菌多糖得率的因素有提取溫度、提取時(shí)間、堿液濃度、料液比，采用正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2極差分析可知，影響羊肚菌多糖得率的因素按其影響程度的大小排列分別為B>D>C>A，最佳提取條件為A2B3C2D2，即提取溫度90 ℃，提取時(shí)間5 h，堿液濃度0.7 mol·L-1，料液比1∶20（g·mL-1）。當(dāng)提取次數(shù)為2次時(shí)，在此條件下，多糖得率為5.39%。

2.3 羊肚菌抗氧化活性測(cè)定

2.3.1 DPPH自由基清除能力 DPPH自由基是一種穩(wěn)定的自由基，一般用來(lái)對(duì)抗氧化成分的體外抗氧化性進(jìn)行評(píng)價(jià)，清除率越大表明其抗氧化能力越強(qiáng)（于靜等，2018）。圖5結(jié)果表明，在羊肚菌多糖濃度0.025～0.100 mg·mL-1范圍內(nèi)，隨著羊肚菌多糖濃度增加，清除DPPH的能力增強(qiáng)，即清除率與多糖濃度存在量效關(guān)系。在多糖濃度為0.100 mg·mL-1時(shí)，羊肚菌多糖和Vc對(duì)DPPH自由基清除率分別達(dá)到66.32%和40.22%，雖然羊肚菌多糖對(duì)DPPH清除率弱于Vc，但羊肚菌多糖仍然表現(xiàn)出較強(qiáng)的清除DPPH自由基的能力。

IC50值為清除50%自由基所需多糖濃度（徐小偉等，2013）。IC50值越小，其對(duì)應(yīng)樣品的抗氧化活性越強(qiáng)（李敏等，2015）。羊肚菌多糖清除DPPH自由基的IC50為0.468 mg·mL-1。梭柄松孢菇多糖（劉蒙蒙等，2013）和木耳多糖（孔沛筠等，2018）的IC50分別為3.27、1.47 mg·mL-1。這表明羊肚菌多糖具有較好的DPPH自由基的清除能力。

2.3.2 羥自由基清除能力 羥自由基是一種強(qiáng)氧化劑，其清除率是物質(zhì)抗氧化作用的重要指標(biāo)（金鳴等，1996）。圖6結(jié)果表明，羊肚菌多糖濃度在0.025～0.100 mg·mL-1范圍內(nèi)，隨著羊肚菌多糖濃度的增加，清除羥自由基的能力增強(qiáng)，即清除率與多糖濃度存在量效關(guān)系。在多糖濃度為0.100 mg·mL-1時(shí)，羊肚菌多糖和Vc對(duì)羥自由基的清除率分別達(dá)到44.28%和85.69%，雖然羊肚菌多糖對(duì)DPPH的清除率弱于Vc，但羊肚菌多糖仍然表現(xiàn)出較強(qiáng)的清除羥自由基的能力。

羊肚菌多糖的IC50為0.208 mg·mL-1。李方亮等（2011）研究發(fā)現(xiàn)香菇多糖和褐蘑菇多糖的IC50值分別為0.703、0.320 mg·mL-1，說(shuō)明羊肚菌多糖具有較好的清除羥自由基的能力。

2.3.3 超氧陰離子清除能力 超氧陰離子自由基可以經(jīng)過(guò)一系列反應(yīng)生成其他的氧自由基，引起脂質(zhì)過(guò)氧化，導(dǎo)致細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的改變（楊少輝等，2010）。因此，通過(guò)對(duì)超氧陰離子自由基的清除也能達(dá)到抗氧化作用。圖7結(jié)果表明，羊肚菌多糖和Vc對(duì)超氧陰離子都有一定的清除能力，在羊肚菌多糖濃度0.025～0.100 mg·mL-1范圍內(nèi)，隨著羊肚菌多糖濃度的增加，清除超氧陰離子的能力增強(qiáng)，即清除超氧陰離子的能力與多糖濃度存在量效關(guān)系。在濃度為0.100 mg·mL-1時(shí)，羊肚菌多糖和Vc對(duì)超氧陰離子的清除率分別達(dá)到65.92%和85.19%，兩者清除超氧陰離子的能力比較接近，表明羊肚菌多糖有較強(qiáng)的清除超氧陰離子的能力。

羊肚菌多糖對(duì)超氧陰離子的清除率為65.93%，其IC50=0.022 mg·mL-1。經(jīng)報(bào)道，茶樹(shù)菇多糖的IC50為1.282 mg·mL-1（余萍等，2009），對(duì)于超氧陰離子清除能力來(lái)說(shuō)，羊肚菌多糖和Vc的清除率是相近的，但遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于茶樹(shù)菇多糖的清除能力。說(shuō)明羊肚菌多糖具有很好的清除超氧陰離子的能力。

2.3.4 鐵離子的還原能力 FRAP法是測(cè)定物質(zhì)還原能力的一種方法，它可以用來(lái)反映樣品的總抗氧化活性，其值越大，說(shuō)明抗氧化活性越強(qiáng)（盛冉等，2018）。圖8結(jié)果表明，隨著羊肚菌多糖濃度的增加，多糖對(duì)鐵離子的還原能力呈線性關(guān)系緩慢增加，與Vc相比，羊肚菌多糖的還原能力較低。

IC50表示樣品還原能力達(dá)到50%時(shí)所需要的多糖濃度（劉蒙蒙等，2013）。通過(guò)線性擬合得出，羊肚菌多糖的IC50為0.014 mg·mL-1。經(jīng)劉蒙蒙等（2013）報(bào)道，梭柄松孢菇的還原能力的IC50為0.58 mg·mL-1，兩者比較，羊肚菌多糖的還原能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于梭柄松孢菇多糖。

3 結(jié)論

通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)，優(yōu)化了堿法提取羊肚菌多糖的工藝條件，即加入20倍體積的0.7 mol·L-1 NaOH溶液在90 ℃下提取5 h，經(jīng)兩次提取，多糖得率達(dá)到5.39%。本研究通過(guò)研究羊肚菌多糖清除DPPH自由基、羥基自由基和超氧陰離子的能力以及鐵離子的還原能力，發(fā)現(xiàn)其抗氧化能力依次為還原能力>超氧陰離子清除能力>羥自由基清除能力>DPPH自由基清除能力，以Vc為對(duì)照，羊肚菌多糖的抗氧化能力均低于Vc，但其IC50值顯著高于其他食用菌多糖，說(shuō)明羊肚菌多糖具有較好的抗氧化活性。

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