吳娟 歐志榮 李昭蓉 趙謀明

摘?要：【目的】詳細(xì)探討了不同醇沉條件制備的羊棲菜多糖組分的單糖組成、平均分子量、結(jié)構(gòu)及其抗氧化特性?！痉椒ā客ㄟ^稀酸提取法制備羊棲菜提取液，用不同濃度的乙醇沉淀制備羊棲菜多糖組分。利用柱前衍生-反相高效液相色譜、凝膠滲透色譜與多角度激光光散射聯(lián)用、傅里葉變換紅外光譜、紫外分光光度計(jì)、掃描電子顯微鏡以及哈克MARS III型流變儀等技術(shù)手段，分析了多糖組分的基本成分、單糖組成、平均分子量、有機(jī)官能團(tuán)、空間構(gòu)象、表觀形貌及流變學(xué)特性。此外，進(jìn)一步研究了各多糖組分的氧自由基吸收能力以及DPPH·和ABTS·的清除能力。【結(jié)果】SFP-50和SFP-70具有高的總糖、硫酸基及糖醛酸含量;5種多糖組分均由甘露糖、葡萄糖、葡萄糖醛酸、半乳糖、阿拉伯糖和巖藻糖組成，但占比均不相同，其中巖藻糖占比都最高，約為50%;SFP-40、SFP-50、SFP-60、SFP-70和SFP-80的平均分子量分別為97.63、90.51、97.19、81.52及90.93 kDa;流變試驗(yàn)表明羊棲菜多糖溶液屬于非牛頓流體，表現(xiàn)為固體彈性性質(zhì);掃描電鏡圖像揭示羊棲菜多糖組分表面呈凹凸不平、疏松多孔的褶皺結(jié)構(gòu);抗氧化特性分析結(jié)果表明羊棲菜多糖組分具有一定的氧自由基吸收能力以及DPPH·和ABTS·的清除能力，且不同體積分?jǐn)?shù)乙醇醇沉?xí)绊懫淇寡趸匦浴！窘Y(jié)論】不同體積分?jǐn)?shù)乙醇醇沉?xí)绊懷驐硕嗵堑睦砘再|(zhì)、單糖組成和平均分子量，但不改變其構(gòu)象、微觀結(jié)構(gòu)及流變學(xué)性質(zhì)，對其抗氧化活性也有一定的影響。

關(guān)鍵詞：羊棲菜;多糖;結(jié)構(gòu)表征;抗氧化活性

中圖分類號：R 284.2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：1008-0384（2019）07-842-10

Abstract： 【Objective】The polysaccharides extracted from Sargassum fusiforme with different ethanol volume ?were studied. 【Method】 Polysaccharides were extracted from S.fusiforme ?using an acid solution， then precipitated with different volume fractions of ethanol. The resulting extract was analyzed for its physicochemical properties， monosaccharide composition， molecular weight， structural characteristics， functional group identification， spatial conformation， apparent morphology， and rheological properties using ultraviolet spectrophotometer， precolumn derivatization-reverse-phase high performance liquid chromatography， GPC-MALLs， FT-IR， SEM， and Huck MARS III rheometer. The antioxidant activity of the extracts， including the oxygen radical absorption capacity and DPPH· ?and ABTS· ?scavenging ability， were determined. 【Result】Extracts， SFP-50 and SFP-70， were found to contain higher contents of sugar， sulfate and uronic acid than the other samples. All 5 extracts contained mannose， glucose， glucuronic acid， galactose， arabinose， and fucose but differed in ratio， with fucose being the highest at about 50% of them combined. The molecular weights of SFP-40， SFP-50， SFP-60， SFP-70， and SFP-80 were estimated to be 97.63， 90.51， 97.19， 81.52， and 90.93 kDa， respectively. The Congo red assay showed that the polysaccharides had a triple helical structure. The solution of the extracts was ?non-Newtonian fluid with elasticity. The scanning electron microscopy images showed an uneven， loose and porous surface. All samples had varying degrees of oxygen radical absorption capacity and DPPH· ?and ABTS· ?scavenging ability. 【Conclusion】The volume fraction employed for the ethanol precipitation affected the physicochemical properties， monosaccharide composition， and molecular weight as well as the antioxidant activity， but not the conformation， microstructure or rheological properties， of the polysaccharides obtained.

Key words： Sargassum fusiforme; polysaccharides; structural characterization; antioxidant activity

0?引言

【研究意義】羊棲菜Sargassum fusiforme，別名鹿角尖、海菜牙、羊奶子、海大麥等，主要分布于我國浙江、福建、廣東淺海，在山東、遼寧等地也有分布，并在浙江及福建沿海等地大規(guī)模栽培，資源豐富，價(jià)格低廉，是一種具有廣闊開發(fā)前景的海洋生物資源[1]，其食療保健功效在《神農(nóng)本草經(jīng)》及《本草綱目》中均有記載。羊棲菜的總糖含量大約占羊棲菜干重的40%，其中以褐藻膠（一般指褐藻酸）和褐藻糖膠（又稱褐藻多糖硫酸酯、巖藻聚糖硫酸酯或巖藻糖膠）為主的多糖占羊棲菜干重的16%～25%。多糖是羊棲菜的主要化學(xué)成分之一，也是羊棲菜藥理及保健功效發(fā)揮的主要原因?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】研究表明，羊棲菜多糖具有抗炎、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗高脂血癥和抗氧化活性等多種功能活性[2-6]。季宇彬等[7]研究發(fā)現(xiàn)羊棲菜多糖能夠顯著降低小鼠脂質(zhì)過氧化物水平以及提高過氧化氫酶及超氧化物歧化酶的酶活。陳金星等[8]利用大腸癌lovo細(xì)胞及RKO細(xì)胞模型研究了羊棲菜多糖的抗腫瘤活性，結(jié)果表明羊棲菜多糖能夠顯著抑制腫瘤細(xì)胞增殖，并有一定的劑量依賴性。王揚(yáng)等[9]發(fā)現(xiàn)羊棲菜多糖對小鼠胸腺T淋巴細(xì)胞的增殖具有劑量依賴效應(yīng)。于竹芹等[10]利用高血糖模型小鼠研究了羊棲菜多糖的降血糖活性，發(fā)現(xiàn)羊棲菜可能通過提高小鼠體內(nèi)抗氧化酶活，降低小鼠體內(nèi)丙二醛和NO的含量，從而發(fā)揮良好的降血糖功效。近年來，國內(nèi)外對羊棲菜多糖的研究主要集中在提取方法對其結(jié)構(gòu)與生物功能的影響，提取工藝參數(shù)（溫度、料液比、時(shí)間等）的優(yōu)化，生物活性中心的分離以及利用體外或體內(nèi)評價(jià)方法研究其生物活性。【本研究切入點(diǎn)】已有文獻(xiàn)報(bào)道了稀酸提取的羊棲菜多糖具有更好的抗氧化特性，但不同體積分?jǐn)?shù)乙醇醇沉的羊棲菜多糖的結(jié)構(gòu)及其抗氧化活性的比較研究未有文獻(xiàn)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】探討不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇醇沉制備的羊棲菜多糖的理化性質(zhì)、分子量分布、單糖組成、結(jié)構(gòu)及其抗氧化活性。為進(jìn)一步高效開發(fā)利用羊棲菜這一海洋生物資源提供理論依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?材料與試劑

羊棲菜，購于山東青島。

水溶性VE（Trolox）、1， 1′-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2， 2′-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS），購于美國Sigma公司;其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純，購于廣州精科化玻儀器公司。

1.2?儀器與設(shè)備

微型旋渦混合儀，滬西分析儀器公司;Sorvall ST16R高速冷凍離心機(jī)、全波長掃描多功能讀數(shù)儀，美國Thermo Fisher Scientific公司;752N紫外-可見分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司;哈克MARS III流變儀，德國Thermo-Scientific公司;冷凍干燥機(jī)，美國LABCONCO公司。

1.3?試驗(yàn)方法

1.3.1?羊棲菜多糖的提取

采用稀酸提取法提取羊棲菜多糖，參考Gao等[11]方法，并做了一些修改。將羊棲菜沖洗干凈，用無水乙醇浸泡24 h，晾干、粉碎。稱取一定量羊棲菜干粉按1∶20的料液比加入去離子水，用1 mol·L-1的鹽酸溶液將pH調(diào)為2.5，在60℃下提取2 h，期間用攪拌器不斷攪拌，過濾取其濾液，濾渣再次提取，過濾，合并兩次濾液，離心（10 000 r·min-1，20 min）取上清液，真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，濃縮物分別加無水乙醇至乙醇終體積分?jǐn)?shù)為40%、50%、60%、70%及80%，4℃醇沉24 h，離心（10 000 r·min-1，20 min）取沉淀，加水復(fù)溶，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇，冷凍干燥獲得羊棲菜多糖，分別標(biāo)記為SFP-40、SFP-50、SFP-60、SFP-70和SFP-80。

1.3.2?羊棲菜多糖的理化性質(zhì)測定

通過苯酚-硫酸法測總糖含量，以巖藻糖為標(biāo)準(zhǔn)[12];通過考馬斯亮藍(lán)法測總蛋白含量，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)[13];通過咔唑-比色法測糖醛酸含量，以半乳糖醛酸為標(biāo)準(zhǔn)[14];通過硫酸鋇比濁法測硫酸基含量，以硫酸鉀為標(biāo)準(zhǔn)[15]。

1.3.3?羊棲菜多糖的分子量及單糖組成測定

羊棲菜多糖分子量的測定參考Liu等[16]的方法，并做一些修改。羊棲菜多糖樣品配制成1 mg·mL-1溶液，過0.45 μm濾膜后測定。在測量之前，用1 mg·mL-1的牛血清白蛋白溶液對儀器進(jìn)行校準(zhǔn)。色譜柱：Ultrahydragel Guard（40 mm×6 mm）、Ultrahydrogel 2000（300 mm×7.5 mm）和Ultrahydrogel1000（300 mm×7.5 mm）串聯(lián);流動相：100 mmol·L-1 NaNO3（含0.05%的Na3N）;流速：0.5 mL·min-1;檢測器：示差折光檢測器、多角度光散射檢測器和紫外檢測器，柱溫：30℃;進(jìn)樣量：50 μL。使用ASTRA軟件計(jì)算MW。

羊棲菜多糖單糖組成分析方法參考戴軍等[17]的方法，并作出一些修改。分別配制1 mg·mL-1的各單糖標(biāo)品（D-葡萄糖、D-阿拉伯糖、D-葡萄糖醛酸、D-半乳糖、甘露糖、L-巖藻糖和L-鼠李糖），取50 μL標(biāo)準(zhǔn)單糖，加入50 μL 0.6 mol·L-1 NaOH溶液和100 μL 0.5 mol·L-1的PMP甲醇溶液后于70℃衍生化反應(yīng)100 min;冷卻后加100 μL 0.3 mol·L-1的鹽酸，加水1.7 mL;再加入2 mL氯仿萃取、離心（2 000 r·min-1，5 min）、去除有機(jī)相，反復(fù)萃取5次;取水相過0.22 μm微孔濾膜，待HPLC進(jìn)樣分析。配制各單糖濃度均為1 mg·mL-1的混合標(biāo)品，與標(biāo)準(zhǔn)單糖進(jìn)行相同的處理，待HPLC進(jìn)樣分析。取1 mL 10 mg·mL-1的羊棲菜多糖溶液，加入1 mL 4 mol·L-1三氟乙酸（TFA），封口，110℃下水解8 h;冷卻后加入400 μL甲醇溶解，減壓旋蒸至干，重復(fù)6次;然后和標(biāo)準(zhǔn)單糖進(jìn)行同樣的處理，待HPLC進(jìn)樣分析。

色譜條件：色譜柱為：AgilentEclipse XDB-C18，4.6×250 mm，5 μm;流動相：0.02 mol·L-1磷酸鹽緩沖液（pH 6.7）-乙腈（85∶15，v/v）;柱溫：30℃;檢測波長：250 nm;流速：1 mL·min-1;進(jìn)樣體積：10 μL。

1.3.4?傅里葉變換紅外光譜分析（FT-IR）

將多糖樣品與KBr粉末研磨均勻，壓成1 mm的薄片，用Bruker VERTEX 33光譜儀記錄樣品的紅外吸收值，掃描范圍為400～4 000 cm-1。

1.3.5?剛果紅試驗(yàn)

參考Chen等[18]方法，并作出一些修改。取1 mg·mL-1的羊棲菜多糖溶液2.0 mL與100 μmol·L-1的剛果紅溶液2.0 mL混合，分別加入1 mol·L-1 NaOH溶液使體系中NaOH的最終濃度分別為0、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol·L-1。以1 mg·mL-1的凝膠多糖溶液為陽性對照，室溫下放置10 min后，在220～600 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行全波長掃描，記錄不同濃度NaOH條件下的最大吸收波長。以NaOH濃度為橫坐標(biāo)，最大吸收波長為縱坐標(biāo)作圖。

1.3.6?掃描電鏡分析

將冷凍干燥后的羊棲菜多糖用離子濺射鍍膜法制備電鏡樣品，置于掃描電鏡的樣品室中掃描分析，調(diào)節(jié)加速電壓5.0 kV，放大倍數(shù)500倍，用隨機(jī)工作站進(jìn)行拍攝，觀察多糖表面的形態(tài)。

1.3.7?流變特性分析

配制10 mg·mL-1的羊棲菜多糖水溶液，采用哈克MARS III型流變儀測定羊棲菜多糖溶液的剪切流變曲線和頻率掃描下的振蕩流變特性;其中，剪切流變所用轉(zhuǎn)子為C60/1° Ti，振蕩流變的轉(zhuǎn)子為P60 Ti L，板間距設(shè)定為0.052 mm。剪切流變測定條件為：剪切速率范圍為0.1～150 s-1，測定溫度25℃。振蕩流變條件為：應(yīng)力 0.01 Pa，測定溫度25℃，振蕩頻率范圍為0.01～1.00 Hz。每個(gè)樣品重復(fù)測定3次，結(jié)果取平均值。

1.3.8?氧自由基吸收能力（ORAC）測定

ORAC的測定參考林戀竹等[19]的方法，并進(jìn)行一些修改。用75 mmol·L-1磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）配制1 mg·mL-1的羊棲菜多糖溶液。將20 μL樣品溶液或20 μL Trolox標(biāo)準(zhǔn)品加入96孔板的孔中，空白組加入20 μL PBS，然后加入120 μL 70 nmol·L-1熒光素鈉。將混合物混勻并在37℃下預(yù)孵育15 min后，迅速向每個(gè)孔中加入60 μL 40 mmol·L-1 AAPH。在激發(fā)波長485 nm，發(fā)射波長520 nm下進(jìn)行連續(xù)測定，每2 min測定1次熒光強(qiáng)度，共讀61次。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。將所測的點(diǎn)連成一條曲線并計(jì)算曲線下面積，AUC表示曲線下的面積。公式如下：

AUC=0.5（f0+fn）+f1+f2+f3+…+fn-1;

Net AUC=AUC樣-AUC空白

以Trolox濃度為橫坐標(biāo)，Net AUC為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。ORAC值表示為每克樣品的平均μmol Trolox當(dāng)量（TE）。

1.3.9?DPPH·清除率

DPPH·的測定參考Li等[20]的方法，并進(jìn)行了一些修改。配制濃度分別為0.125、0.25、0.5、1.0、2.0 mg·mL-1的羊棲菜多糖溶液。取2 mL樣品溶液（空白組用2 mL無水乙醇）加入到2 mL 0.2 mol·L-1 DPPH·溶液中（溶液用無水乙醇配制）。其中對照組加入2 mL的樣品溶液和2 mL的無水乙醇。將混合物在室溫下避光保存30 min。無水乙醇為空白，使用可見分光光度計(jì)在517 nm下測量其吸光度。DPPH·的清除率表示為：

DPPH·清除率（%）=[1-（A樣品-A對照）/A空白]×100

其中A空白指空白組的吸光度;A樣品指樣品組的吸光度;A對照指樣品空白組的吸光度。

1.3.10?ABTS·清除率

ABTS·清除率試驗(yàn)參考趙謀明等[21]的方法，經(jīng)過一些修改。用5 mL ABTS（7 mmol·L-1）和5 mL過硫酸鉀（2.45 mmol·L-1）反應(yīng)來制備ABTS·溶液。將混合物在室溫下避光保存16 h。在測定之前，用50 mmol·L-1磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）稀釋ABTS·溶液，使其在734 nm處的吸光度為0.70±0.02。取50 μL的樣品液至酶標(biāo)板中（空白組取等量的PBS），30℃保溫3 min，再迅速加入150 μL ABTS·，搖勻，30℃反應(yīng)6 min，于734 nm處測量其吸光度。ABTS·清除率的計(jì)算公式如下：

ABTS·清除率（%）=[（1-A樣品）/A空白]×100

其中A空白指空白組的吸光度，A樣品指樣品組的吸光度。

1.4?數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)重復(fù)3次，所有數(shù)據(jù)均用平均值±SD表示。使用SPSS 24.0軟件的方差分析方法進(jìn)行數(shù)據(jù)顯著性分析，P<0.05表示差異顯著。

2?結(jié)果與分析

2.1?羊棲菜多糖的理化性質(zhì)分析

羊棲菜多糖的理化性質(zhì)測定結(jié)果如表1所示，總糖含量分別為SPF-40（69.71±2.72）%、SFP-50（78.24±1.90）%、SFP-60（71.73±2.55）%、SFP-70（74.70±2.62）%和SFP-80（68.48±1.87）%。稀酸提取的羊棲菜多糖的蛋白含量較低，各多糖組分間總蛋白含量無顯著性差異（P>0.05）。大量研究報(bào)道表明，藻類多糖大多含有硫酸基團(tuán)，且硫酸基團(tuán)的含量與其功能活性密切相關(guān)[22]，5種羊棲菜多糖的硫酸基含量依次為（1.67±0.65）%、（7.05±1.02）%、（4.62±0.93）%、（7.18±1.76）%和（4.23±0.56）%，其中SFP-50及SFP-70的硫酸基團(tuán)含量顯著高于其他3種多糖組分。糖醛酸的測定結(jié)果顯示，SFP-50及SFP-70的糖醛酸含量顯著高于SPF-60和SPF-80。說明醇沉條件對羊棲菜多糖的總糖、硫酸基團(tuán)及糖醛酸含量影響顯著。

2.2?羊棲菜多糖的分子量及單糖組成分析

不同體積分?jǐn)?shù)乙醇醇沉得到的羊棲菜多糖的分子量和單糖組成如表2所示，各羊棲菜多糖組分的單糖組成比較豐富，都含有甘露糖、葡萄糖、葡萄糖醛酸、半乳糖、阿拉伯糖及巖藻糖，但各單糖所占比例不同。其中，巖藻糖所占比例最高，約為50%;甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖的含量也比較高，約為10%;此外，SFP-60、SFP-70、SFP-80含有少量的鼠李糖。SFP-40、SFP-50、SFP-60、SFP-70和SFP-80的平均分子量分別是97.63、90.51、97.19、81.52及90.93 kDa。

2.3?紅外光譜分析

SFP-40、SFP-50、SFP-60、SFP-70及SFP-80的紅外光譜圖如圖1所示，主要吸收譜帶基本相同，說明其主要有機(jī)官能團(tuán)相似。3 212 cm-1處的寬峰是由于多糖中羥基的伸縮振動引起的。2 919 cm-1處的吸收是由于C-H 鍵的伸縮振動。1 743 cm-1和 1 616 cm-1的吸收峰為酯化羰基（C=O）和羧基（COO-）的特征峰，說明SFP中存在乙?；蛱侨┧醄23]。1 422 cm-1為C-H的彎曲振動。1 026、1 096、1 134 cm-13個(gè)位置出現(xiàn)的吸收峰表示SFP的糖環(huán)構(gòu)型為吡喃型[23]，是糖苷鍵C-O-C的非對稱的振動峰。1 247和808 cm-1處的吸收歸因于S=O和C-O-S的伸縮振動[24]。

2.4?構(gòu)象分析

剛果紅是一種可與具有三股螺旋鏈構(gòu)象的多糖形成絡(luò)合物的酸性染料。與剛果紅相比，絡(luò)合物的最大吸收波長發(fā)生紅移，當(dāng)NaOH濃度大于某個(gè)濃度時(shí)，其最大吸收波長會急劇下降。本研究利用剛果紅試驗(yàn)對羊棲菜多糖的構(gòu)象進(jìn)行分析，用具有典型三螺旋結(jié)構(gòu)的凝膠多糖作對照。剛果紅試驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，當(dāng)NaOH濃度為0時(shí)，與剛果紅相比，樣品的最大吸收波長紅移，表明樣品與剛果紅絡(luò)合，當(dāng)NaOH濃度為0.05 mol·L-1時(shí)，SFP-40、SFP-50、SFP-60、SFP-70及SFP-80的最大吸收波長突然降低，表明稀酸提取的羊棲菜多糖均具有三螺旋結(jié)構(gòu)，但不同體積分?jǐn)?shù)乙醇醇沉不會改變其三螺旋構(gòu)象。研究發(fā)現(xiàn)， 與多糖的初級結(jié)構(gòu)相比，多糖特定的空間構(gòu)象對其生物活性的影響更大， 如具有抗腫瘤活性的香菇多糖呈三股螺旋結(jié)構(gòu)[25]。

2.5?掃描電鏡（SEM）分析

掃描電鏡可用于觀察多糖等生物大分子的微觀形貌。不同體積分?jǐn)?shù)乙醇沉淀制備的羊棲菜多糖的掃描電鏡圖如圖3所示，試驗(yàn)結(jié)果表明：酸提取的羊棲菜多糖表面均呈現(xiàn)不規(guī)則的幾何外形，表面呈凹凸不平、疏松多孔的褶皺結(jié)構(gòu)，說明多糖分子間相互存在排斥力， 分子間吸引力較為弱小。

2.6?流變學(xué)特性分析

在25℃的條件下測試羊棲菜多糖溶液的剪切流變和振蕩流變曲線，結(jié)果如圖4所示。在剪切速率范圍0.1～150 s-1內(nèi)，羊棲菜多糖的表觀黏度隨著剪切速率的升高而逐漸降低，最后趨于穩(wěn)定，呈現(xiàn)典型的假塑性流體剪切變稀的特性，屬于非牛頓流體。溶液的黏度隨著剪切速率的增加而降低的現(xiàn)象稱為“剪切稀化”，這主要是因?yàn)榧羟兴俾实脑黾訒淖兎肿娱g的交互作用，使分子間的阻力變小，從而使黏度降低[26]。不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇醇沉得到的羊棲菜多糖的表觀黏度隨剪切速率的變化一致，說明不同體積分?jǐn)?shù)乙醇醇沉得到的羊棲菜多糖溶液的流變學(xué)性質(zhì)類似，即醇沉?xí)r乙醇的體積分?jǐn)?shù)不會改變羊棲菜多糖的流變學(xué)性質(zhì)。動態(tài)黏彈性行為測定結(jié)果表明，SFP-40、SFP-50、SFP-60、SFP-70及SFP-80的儲能模量G′和損耗模量G″與頻率之間的關(guān)系呈現(xiàn)相同的規(guī)律，G′>G″，表明不同體積分?jǐn)?shù)乙醇醇沉的羊棲菜多糖均表現(xiàn)固體彈性行為，乙醇沉淀的體積分?jǐn)?shù)不影響羊棲菜多糖的黏彈性行為。

2.7?抗氧化活性分析

2.7.1?ORAC分析

氧自由基吸收能力（ORAC）基于氫原子轉(zhuǎn)移（HAT）機(jī)制，廣泛應(yīng)用于評價(jià)各種物質(zhì)的抗氧化活性[27]。在偶氮類化合物偶氮二異丁脒鹽酸鹽（AAPH）的過氧自由基攻擊下，熒光素鈉的熒光特性逐漸消失?？寡趸缘奈镔|(zhì)對過氧自由基的清除能力通常與氧自由基作用下熒光衰減曲線的延遲曲線面積（熒光自然衰減曲線下面積減去熒光衰減曲線下面積）直接相關(guān)，結(jié)果以Trolox當(dāng)量來表示。不同體積分?jǐn)?shù)乙醇制備得到的羊棲菜多糖的氧自由基吸收能力結(jié)果如圖5所示，SFP-40和SFP-50的ORAC值分別為（33.73±2.13）、（38.39±1.11） μmol Trolox·g-1，SFP-60、SFP-70、SFP-80顯著高于SFP-40和SFP-50，其中SFP-80的ORAC值最大，為（52.57±0.06） μmol Trolox·g-1，顯著高于其他4種醇沉組分（P<0.05）。結(jié)果表明不同體積分?jǐn)?shù)醇沉?xí)绊懷驐硕嗵堑腛RAC值，且隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，ORAC值也增大。

2.7.2?DPPH·清除率

DPPH·在醇溶液中顯穩(wěn)定的紫色，在517 nm處有強(qiáng)吸收，抗氧化劑存在時(shí)，其單電子與之配對而使溶液顏色變淺，吸光度降低，被廣泛用于評價(jià)抗氧劑清除自由基的能力[28]。不同體積分?jǐn)?shù)乙醇沉淀的羊棲菜多糖的DPPH·清除能力如圖6所示，DPPH·清除率隨著SFP濃度的增加而增加，當(dāng)羊棲菜多糖濃度較低時(shí)（<0.25 mg·mL-1），SFP-40表現(xiàn)出較強(qiáng)的DPPH·清除率，而SFP-60表現(xiàn)出較弱的DPPH·清除率。當(dāng)羊棲菜多糖質(zhì)量濃度為2.0 mg·mL-1時(shí)，不同體積分?jǐn)?shù)乙醇醇沉對羊棲菜多糖的DPPH·的清除率影響較大，其中，SFP-50的自由基清除能力顯著高于其他體積分?jǐn)?shù)醇沉的羊棲菜多糖，達(dá)到了（68.70±3.37）%。

2.7.3?ABTS·的清除率

由圖7可以看出，羊棲菜多糖對ABTS·均具有一定的清除能力，且隨著多糖溶液濃度的增加而增加。在所測濃度范圍內(nèi)，SFP-80的ABTS·的清除率顯著高于SFP-40的ABTS·清除率（P<0.05）。當(dāng)羊棲菜多糖質(zhì)量濃度為2.0 mg·mL-1時(shí)，SFP-40、SFP-50、SFP-60、SFP-70及SFP-80的ABTS·的清除率分別為52.60%、55.56%、57.27%、58.12%和57.93%。

3?討論與結(jié)論

現(xiàn)代研究表明：羊棲菜中富含微量元素及氨基酸，同時(shí)還含有豐富的多糖、甾醇、萜類物質(zhì)等，是天然的保健食品。新鮮的羊棲菜肥厚多汁，營養(yǎng)成分豐富，采集后可直接食用，具有非常高的食療價(jià)值[6]。研究表明其具有抗氧化、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫力以及降血糖血脂等多重保健功效[29]，極具開發(fā)應(yīng)用前景。本研究采用酸提醇沉法制備羊棲菜多糖，提取過程中未用Sevage法除蛋白，避免了有機(jī)試劑在此過程中對羊棲菜多糖結(jié)構(gòu)及功能活性的影響。

分別用體積分?jǐn)?shù)為40%、50%、60%、70%和80%的乙醇醇沉得到SFP-40、SFP-50、SFP-60、SFP-70和SFP-80等5種羊棲菜多糖，其中，SFP-50的總糖和糖醛酸含量最高，且總糖含量顯著高于其他體積分?jǐn)?shù)醇沉的羊棲菜多糖;酸提取的羊棲菜多糖中總蛋白含量均較低，且各多糖組分間無顯著性差異。羊棲菜多糖均由甘露糖、葡萄糖、葡萄糖醛酸、半乳糖、阿拉伯糖及巖藻糖組成，但各單糖所占比例不同。其中，巖藻糖所占比例最高，約為50%;甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖的含量也比較高，約為10%;且SFP-60、SFP-70、SFP-80含有少量的鼠李糖，其單糖組成與Wu等[30]研究報(bào)道的結(jié)果大致相同，但其所占比例有所不同的原因可能是提取方法不同。SFP-40、SFP-50、SFP-60、SFP-70和SFP-80的平均分子量分別是97.63、90.51、97.19、81.52及90.93 kDa，分子量小于Sun等[31]水提法制備的羊棲菜多糖的分子量，可能是因?yàn)橄∷崽崛苟嗵墙到狻?/p>

剛果紅試驗(yàn)顯示了羊棲菜多糖具有三螺旋結(jié)構(gòu)。流變測試表明羊棲菜多糖是一種非牛頓流體，表現(xiàn)為固態(tài)彈性行為，不同體積分?jǐn)?shù)醇沉不改變其流變學(xué)性質(zhì)?？寡趸钚匝芯勘砻鱋RAC值大小依次為SFP-80>SFP-60（SFP-70）>SFP-50（SFP-40），其中SFP-80的ORAC值最大，為（52.57±0.06）μmol Trolox·g-1;隨著多糖濃度的增大，多糖的DPPH·和ABTS·的清除率不斷增大。多糖質(zhì)量濃度為2.0 mg·mL-1時(shí)，SFP-40、SFP-50、SFP-60、SFP-70和SFP-80的DPPH·清除率分別為55.02%、68.70%、53.93%、56.34%及47.06%，ABTS·的清除率分別為52.60%、55.56%、57.27%、58.12 %和57.93%，說明不同體積分?jǐn)?shù)乙醇醇沉?xí)绊懷驐硕嗵堑目寡趸匦浴?/p>

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（責(zé)任編輯：黃愛萍）