簡(jiǎn)東琴 曾令江 楊穎舫 楊春賢

摘要：【目的】克隆南方紅豆杉的2-C-甲基-D-赤蘚醇-4-磷酸胱氨酰轉(zhuǎn)移酶（MCT）基因（TcMCT），分析其功能，并檢測(cè)組織表達(dá)特異性，為深入研究TcMCT基因在紫杉醇生物合成中的作用機(jī)制提供理論依據(jù)?！痉椒ā坎捎胏DNA末端快速擴(kuò)增（RACE）技術(shù)獲得TcMCT基因的cDNA全長(zhǎng)序列，對(duì)其編碼蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析及亞細(xì)胞定位，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)TcMCT基因的組織表達(dá)模式，并在大腸桿菌中超表達(dá)該基因以驗(yàn)證其功能。【結(jié)果】克隆獲得的TcMCT基因cDNA序列全長(zhǎng)為1293 bp，開(kāi)放閱讀框（ORF）為942 bp，編碼313個(gè)氨基酸。TcMCT蛋白與其他植物MCT蛋白中均含保守的MEP結(jié)合位點(diǎn)和CTP結(jié)合位點(diǎn)，但在N端氨基酸序列保守性較差，其中與同為裸子植物銀杏GbMCT蛋白的親緣關(guān)系最近，氨基酸序列的相似性為59.3%。TcMCT蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)與AtMCT蛋白相似，均屬于同源二聚體。TcMCT蛋白N端含84個(gè)氨基酸殘基的質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽，且以Arg88作為切割位點(diǎn)，定位于葉綠體中。TcMCT基因在南方紅豆杉不同組織中均有表達(dá)，在綠色樹(shù)皮中的相對(duì)表達(dá)量顯著高于其他組織（P<0.05，下同），且在老葉和嫩葉中的相對(duì)表達(dá)量顯著高于莖和根，在莖和根中的表達(dá)量極少甚至不表達(dá)。大腸桿菌中超表達(dá)TcMCT基因可促進(jìn)β-胡蘿卜素大量積累?！窘Y(jié)論】不同物種MCT氨基酸序列具有較高的保守性，TcMCT基因具有明顯的組織表達(dá)特異性，可調(diào)控萜類物質(zhì)如β-胡蘿卜素等的生物合成，推測(cè)其在紫杉醇生物合成中發(fā)揮重要調(diào)控作用。

關(guān)鍵詞： 南方紅豆杉;2-C-甲基-D-赤蘚醇-4-磷酸胱氨酰轉(zhuǎn)移酶（MCT）;生物信息學(xué)分析;功能驗(yàn)證;紫杉醇

0 引言

【研究意義】南方紅豆杉（Taxus chinensis）為我國(guó)特有種，其樹(shù)形美觀，木質(zhì)優(yōu)良，富含紫杉醇，是罕見(jiàn)的一樹(shù)三用樹(shù)種（吳繼剛，2015）。臨床研究發(fā)現(xiàn)，紫杉醇在治療乳腺癌、卵巢癌和肺癌等方面療效顯著，是一種高效新型的抗癌藥物（Armstrong et al.，2006;Miller et al.，2007;Rezazadeh et al.，2016;Oudin et al.，2017）。此外，紫杉醇可提高植物抵抗真菌的能力（Soliman et al.，2015）。異戊烯焦磷酸（IPP）是紫杉醇、胡蘿卜素等萜類化合物生物合成的重要前體物質(zhì)，而2-C-甲基-D-赤蘚醇-4-磷酸胱氨酰轉(zhuǎn)移酶（MCT）不僅是參與IPP合成的關(guān)鍵酶，還是萜類物質(zhì)生物合成MEP途徑中的關(guān)鍵酶之一（Rohdich et al.，1999;Croteau et al.，2006）。因此，克隆TcMCT基因，并分析其生物學(xué)功能，對(duì)提高紅豆杉紫杉醇含量具有重要意義，同時(shí)可為南方紅豆杉分子育種提供理論依據(jù)。【前人研究進(jìn)展】MCT參與4-二磷酸胞苷-2-C-甲基赤蘚糖醇（CDP-ME）的合成。Rohdich等（1999）將帶有14C標(biāo)記的CDP-ME轉(zhuǎn)入辣椒，結(jié)果發(fā)現(xiàn)帶有14C標(biāo)記的CDP-ME在辣椒質(zhì)體中參與類胡蘿卜素生物合成，說(shuō)明MCT在萜類化合物生物合成過(guò)程中發(fā)揮重要作用。迄今為止，已從擬南芥（Rohdich et al.，2000）、杜仲（劉攀峰，2012）、胡黃連（鄭玉娟等，2014）、雷公藤（董宇茹等，2015;宋雅迪等，2018）、青蒿（張曼等，2016）和卷葉貝母（張?zhí)鹛鸬龋?018）等被子植物中克隆獲得MCT基因，但關(guān)于其功能鑒定的研究報(bào)道較少。Rohdich等（2000）研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥AtMCT蛋白的N端含有質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列，與MEP途徑定位于質(zhì)體相吻合，通過(guò)抑制AtMCT基因的表達(dá)能下調(diào)貝殼杉烯的生物合成。董宇茹等（2015）、宋雅迪等（2018）研究發(fā)現(xiàn)，雷公藤TwMCT基因?qū)儆贛CT基因家族成員，且受茉莉酸甲酯（MeJA）誘導(dǎo)表達(dá)，通過(guò)RNAi技術(shù)抑制雷公藤TwMCT基因表達(dá)后，植株中的雷公藤甲素和雷公藤紅素含量顯著下降。張曼等（2016）從青蒿中克隆獲得AaMCT基因cDNA序列，該基因編碼蛋白定位于葉綠體中，且在青蒿分泌型腺體中特異性表達(dá)，將其轉(zhuǎn)入擬南芥中超表達(dá)后能顯著促進(jìn)葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素等萜類化合物合成。由此可見(jiàn)，在被子植物中，不同物種的MCT基因均對(duì)萜類化合物合成具有重要調(diào)控作用。目前，在裸子植物中僅銀杏MCT基因的相關(guān)研究被報(bào)道。Kim等（2006）首次從銀杏中克隆得到GbMCT基因，并通過(guò)煙草細(xì)胞葉綠體熒光染色試驗(yàn)證明GbMCT蛋白N端含88個(gè)氨基酸的質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽。【本研究切入點(diǎn)】至今，鮮見(jiàn)有關(guān)南方紅豆杉中紫杉醇生物合成途徑中關(guān)鍵酶基因MCT的研究報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】采用cDNA末端快速擴(kuò)增（RACE）技術(shù)從南方紅豆杉中克隆TcMCT基因的cDNA序列全長(zhǎng)，對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)其組織表達(dá)特性，并在大腸桿菌中超表達(dá)該基因以驗(yàn)證其功能，以期從分子水平探討MCT基因在萜類化合物合成中的作用，為紫杉醇生物合成研究提供候選功能基因。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

供試的3株南方紅豆杉均由西南大學(xué)實(shí)驗(yàn)基地提供，樹(shù)齡為4年，長(zhǎng)勢(shì)基本一致，由西藏農(nóng)牧學(xué)院蘭小中教授鑒定為T. media Rehd. var. mairei Lemee et Levl。本氏煙草種子、大腸桿菌DH5α和XL1-Blue均由西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保存提供。pAC-BETA和pTrc-AtIPI質(zhì)粒由馬里蘭大學(xué)的Francis X Cunningham博士惠贈(zèng)。主要試劑：植物RNA提取試劑盒和FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒均購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司，BD SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit購(gòu)自美國(guó)CLONTECH公司;RNA PCR Kit（AMV） Ver.3.0、3'-Full RACE Core Set試劑盒和SYBR Premix Ex Taq II（Perfect Real Time）購(gòu)于日本TaKaRa公司。主要儀器設(shè)備：Centrifuge 5417R冷凍離心機(jī)（Eppendorf，德國(guó)）、DYY-8C電泳儀（北京市六一儀器廠）、梯度PCR儀（Bio-Rad，美國(guó)）和LSM700激光共聚焦顯微鏡（ZEISS，德國(guó)）等。

1. 2 RNA提取及cDNA合成

將南方紅豆杉植株從土中連根拔出，收集主根中段部，剝?nèi)【G色樹(shù)皮，采集所有的新葉（當(dāng)年新生葉）和老葉（多年生葉），分別將這些組織置于液氮中速凍，用于提取總RNA。使用HITACHI3010分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度，按照植物RNA提取試劑盒說(shuō)明提取南方紅豆杉各組織RNA，并參照RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0試劑盒說(shuō)明合成cDNA第一鏈。

1. 3 TcMCT基因cDNA全長(zhǎng)序列克隆

根據(jù)NCBI已公布的擬南芥（Arabidopsis thalia-na）、銀杏（Ginkgo biloba）等物種MCT基因的核苷酸序列，利用Vector NTI 8.0進(jìn)行多重序列比對(duì)，選取最保守核苷酸序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物（表1）。以南方紅豆杉綠色樹(shù)皮cDNA為模板，PCR擴(kuò)增TcMCT基因的核心片段。反應(yīng)體系：10×PCR Buffer 5.0 μL，25 mmol/L MgCl2 3.0 μL，10 mmol/L dNTP 1.0 μL，10 μmol/L TCMCT-F和TCMCT-R游引物各1.0 μL，cDNA模板1.0 μL，2.5 U Taq DNA聚合酶0.5 μL，ddH2O補(bǔ)足至50.0 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃ 45 s，61 ℃（每個(gè)循環(huán)降低0.5 ℃）45 s，進(jìn)行20個(gè)循環(huán);94 ℃ 45 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，進(jìn)行25個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。

根據(jù)3'-Full RACE Core Set試劑盒說(shuō)明獲得3' RACE-Ready cDNA，并以此為模板PCR擴(kuò)增TcMCT基因的3'端序列。3'端序列第1次擴(kuò)增反應(yīng)體系：10×PCR Buffer 5.00 μL，25 mmol/L MgCl2 3.00 μL，10 mmol/L dNTP 1.00 μL，10 μmol/L TcMCT3-1和M13引物各1.00 μL，3'RACE-Ready cDNA 1.00 μL，Ex TaqTM HS 0.25 μL，ddH2O補(bǔ)足至50.00 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。3'端序列第2次擴(kuò)增反應(yīng)體系：10×PCR Buffer 5.00 μL，25 mmol/L MgCl2 3.00 μL，10 mmol/L dNTP 1.00 μL，10 μmol/L TcMCT3-2和 M13引物各0.50 μL，第1次擴(kuò)增產(chǎn)物50倍稀釋液1.00 μL，Ex TaqTM HS 0.25 μL，ddH2O補(bǔ)足至50.00 μL。第2次擴(kuò)增程序與第1次擴(kuò)增程序相同。根據(jù)BD SMARTTM RACE cDNA Amplification試劑盒說(shuō)明獲得5'RACE-Ready cDNA，并以此為模板PCR擴(kuò)增TcMCT基因的5'端序列。5'端序列第1次擴(kuò)增反應(yīng)體系：10×BD Advantage2 PCR Buffer 2.5 μL，50×BD Advantage2 Polymerase Mix 0.5 μL，10 mmol/L dNTP 0.5 μL，10 μmol/L TcMCT5-1引物1.0 μL，10 μmol/L UPM引物（Long和Short）2.5 μL，5'RACE-Ready cDNA 1.5 μL，PCR-Grade Water補(bǔ)足至25.0 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性1 min;94 ℃ 30 s，68 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸8 min。第2次擴(kuò)增反應(yīng)體系：10×BD Advantage2 PCR Buffer 5.0 μL，50×BD Advantage2 Polymerase Mix 1.0 μL，10 mmol/L dNTP 1.0 μL，10 μmol/L TcMCT5-2和NUP引物1.0 μL，第1次擴(kuò)增產(chǎn)物50倍稀釋液1.0 μL，PCR-Grade Water補(bǔ)足至50.0 μL。第2次擴(kuò)增程序與第1次擴(kuò)增程序相同。

TcMCT基因核心片段及3'端和5'端序列的PCR產(chǎn)物均用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察分析并拍照記錄，切膠回收目的片段后分別連接至pMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，菌液PCR驗(yàn)證后挑取陽(yáng)性克隆送至上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

將以上測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接獲得TcMCT基因cDNA全長(zhǎng)序列，以此設(shè)計(jì)獲得TcMCT基因cDNA全長(zhǎng)序列的PCR特異性引物（TcMCT-F1和TcMCT-R1）（表1），并利用南方紅豆杉綠色樹(shù)皮cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系：10×PCR Buffer 5.0 μL，25 mmol/L MgCl2 3.0 μL，10 mmol/L dNTP 1.0 μL，10 μmol/L TcMCT-F1和TcMCT-R1引物各1.0 μL，cDNA模板1.0 μL，2.5 U Taq DNA聚合酶0.5 μL，ddH2O補(bǔ)足至50.0 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸1 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察分析并拍照記錄，切膠回收目的片段后連接至pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，菌液PCR驗(yàn)證后挑取陽(yáng)性克隆送至上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1. 4 生物信息學(xué)分析

使用Vector NTI 8.0分析TcMCT基因編碼區(qū)序列，并將其翻譯成氨基酸序列，利用NCBI中的BLASTp和CluxtalX進(jìn)行氨基酸序列多重比對(duì)，利用ExPASy預(yù)測(cè)蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量和理論等電點(diǎn)（pI），利用SWISS-MODEL對(duì)蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行同源建模，利用MEGA 4.1的鄰位相聯(lián)法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。

1. 5 亞細(xì)胞定位

使用ChloroP分析TcMCT蛋白的質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列（Xiao et al.，2009），根據(jù)編碼質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的核苷酸序列（TP）設(shè)計(jì)其PCR擴(kuò)增特異性引物（TcMCT-SF和TcMCT-SR）（表1），將該序列與植物表達(dá)載體pCAMBIA1300-GFP連接以構(gòu)建重組質(zhì)粒pCAMBIA1300-TP-GFP。根據(jù)Yoo等（2007）的方法制備煙草原生質(zhì)體。在聚乙二醇（PEG）介導(dǎo)下分別將pCAMBIA1300-TP-GFP和pCAMBIA1300-GFP（陰性對(duì)照）轉(zhuǎn)至化煙草原生質(zhì)體中，使用LSM700激光共聚焦顯微鏡觀察綠色熒光蛋白（GFP）在細(xì)胞中的定位情況（Suire et al.，2000）。

1. 6 qRT-RCR檢測(cè)

按照植物RNA提取試劑盒說(shuō)明分別提取南方紅豆杉根、莖、老葉、嫩葉和綠色樹(shù)皮的總RNA，使用HITACHI3010分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度，并用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其質(zhì)量。將質(zhì)量好的總RNA按FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒說(shuō)明去除gDNA并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。將cDNA用RNase-Free ddH2O稀釋20倍后用作模板，按照SYBR Premix Ex Taq II（Perfect Real Time）試劑盒說(shuō)明進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。反應(yīng)體系：2×SYBR Premix Ex Taq II 10.0 μL，10 μmol/L qTcMCT-F和qTcMCT-R引物（表1）各1.0 μL，cDNA模板1.0 μL，RNase Free H2O補(bǔ)足至20.0 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃ 15 s，55 ℃ 15 s，68 ℃ 15 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。以18S作為內(nèi)參基因，采用2-??Ct計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。其中，每個(gè)樣品重復(fù)3次，統(tǒng)計(jì)分析用 t 檢驗(yàn)。

1. 7 功能互補(bǔ)驗(yàn)證

大腸桿菌體內(nèi)的MEP途徑能提供β-胡蘿卜素前體分子IPP和二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP），但缺失從前體分子到β-胡蘿卜素合成途徑中的4個(gè)酶基因：香葉基香葉基焦磷酸酶（crtE）、八氫番茄紅素合成酶（crtB）、八氫番茄紅素脫飽和酶（crtI）和番茄紅素環(huán)化酶（crtY），因此，大腸桿菌不能合成β-胡蘿卜素。若將上述4個(gè)基因重組至pAC-BETA質(zhì)粒上，轉(zhuǎn)入大腸桿菌中即可在其體內(nèi)構(gòu)建β-胡蘿卜素途徑，但無(wú)法大量積累β-胡蘿卜素，因此，大腸桿菌菌落呈白色。將pTrc-AtIPI質(zhì)粒與pAC-BETA共轉(zhuǎn)化大腸桿菌，因大腸桿菌體內(nèi)超表達(dá)擬南芥IPI基因（AtIPI，IPI為IPP異構(gòu)酶）能促進(jìn)β-胡蘿卜素積累，故菌落呈現(xiàn)橘黃色（Gao et al.，2006）?；谏鲜鲈?，參照劉萬(wàn)宏（2008）的方法，設(shè)計(jì)擴(kuò)增TcMCT基因編碼區(qū)的引物（pTcMCT-F和pTcMCT-R），將PCR擴(kuò)增獲得的TcMCT基因編碼區(qū)序列替換pTrc-AtIPI質(zhì)粒上的AtIPI基因即可獲得pTrc-TcMCT重組質(zhì)粒。以pTrc-TcMCT與pAC-BETA共轉(zhuǎn)染大腸桿菌XL1-Blue后涂布于含氯霉素和氨芐霉素的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，篩選出陽(yáng)性克隆。此外，構(gòu)建擬南芥pTrc-AtMCT重組質(zhì)粒（構(gòu)建方法同上），將其與pAC-BETA共轉(zhuǎn)染大腸桿菌XL1-Blue后涂布于含氯霉素和氨芐霉素的LB固體培養(yǎng)基上，用作陽(yáng)性對(duì)照。以大腸桿菌XL1-Blue、pAC-BETA轉(zhuǎn)染大腸桿菌XL1-Blue、pTrc-TcMCT轉(zhuǎn)染大腸桿菌XL1-Blue及pTrc與pAC-BETA共轉(zhuǎn)染大腸桿菌為陰性對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2. 1 TcMCT基因cDNA全長(zhǎng)序列克隆及序列分析結(jié)果

PCR擴(kuò)增獲得的TcMCT基因（GenBank登錄號(hào)為KC110615.1）cDNA全長(zhǎng)序列為1293 bp（圖1），其中，5'端非翻譯區(qū)為58 bp，3'端非翻譯區(qū)為293 bp，開(kāi)放閱讀框（ORF）為942 bp，編碼313個(gè)氨基酸（圖2）。

2. 2 TcMCT蛋白的生物信息學(xué)分析結(jié)果

ExPASy預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，TcMCT蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量為34.3 kD，pI為8.96。將TcMCT（AGP04988.1）與銀杏GbMCT（AAZ80386.1）、青蒿AaMCT（KU 365210.1）、擬南芥AtMCT（NP_565286.1）和丹參SmMCT（AEZ55666.1）進(jìn)行氨基酸序列多重比對(duì)分析，結(jié)果（圖3）顯示，TcMCT蛋白與其他植物MCT蛋白中均含有保守的MEP結(jié)合位點(diǎn)和CTP結(jié)合位點(diǎn)，但在N端氨基酸序列保守性較差。系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果（圖4）顯示，MCT蛋白可分為五大類群，即雙子葉植物、單子葉植物、裸子植物、藻類植物和菌類，各類群物種的MCT蛋白親緣關(guān)系最近，其中，TcMCT蛋白與同為裸子植物的銀杏GbMCT蛋白的親緣關(guān)系最近，氨基酸序列的相似性為59.3%。通過(guò)蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)的同源性建模發(fā)現(xiàn)，TcMCT與AtMCT蛋白均屬于同源二聚體（圖5），且CTP結(jié)合位點(diǎn)位置相似，分別為Arg103～Lys110和Arg91～Lys98，MEP結(jié)合位點(diǎn)位置也相似，分別為Arg240～Lys296和Arg228～Lys284，表明二者可能具有相似的生物學(xué)功能。

2. 3 TcMCT蛋白的亞細(xì)胞定位結(jié)果

ChloroP預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，TcMCT蛋白的N端含有84個(gè)氨基酸殘基的質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽（圖2黑色下劃線），且以Arg88作為切割位點(diǎn)，與AtMCT轉(zhuǎn)運(yùn)肽切割位點(diǎn)相同（Xiao et al.，2009）。將含TcMCT蛋白質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽編碼核苷酸序列（TP）的重組質(zhì)粒pCAMBIA1300-TP-GFP轉(zhuǎn)化至煙草原生質(zhì)體中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TcMCT蛋白的質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽和GFP融合蛋白在488 nm波長(zhǎng)激發(fā)光下發(fā)射綠色熒光（圖6-A），煙草葉綠體在555 nm波長(zhǎng)激發(fā)光下發(fā)射紅色熒光（圖6-B），且兩種熒光能完全重疊呈黃色熒光（圖6-C），表明TcMCT蛋白定位于葉綠體中。

2. 4 TcMCT基因的組織表達(dá)特性分析結(jié)果

從圖7可知，TcMCT基因在南方紅豆杉不同組織中均有表達(dá)，但表達(dá)水平存在明顯差異，TcMCT基因在綠色樹(shù)皮中的相對(duì)表達(dá)量顯著高于其他組織（P<0.05，下同），且在老葉和嫩葉中的相對(duì)表達(dá)量顯著高于莖和根，在莖和根中的表達(dá)量極少甚至不表達(dá)，說(shuō)明TcMCT基因在南方紅豆杉中的表達(dá)具有組織特異性。

2. 5 TcMCT基因功能驗(yàn)證結(jié)果

將pTrc-TcMCT與pAC-BETA共轉(zhuǎn)染大腸桿菌XL1-Blue后涂布于含氯霉素和氨芐霉素的LB固體培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)2 d，陽(yáng)性克隆呈橘黃色，挑取陽(yáng)性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)后涂布于含0.1 mmol/L IPTG、氯霉素和氨芐霉素的LB固體培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)2 d后發(fā)現(xiàn)菌落仍呈橘黃色。該結(jié)果與陽(yáng)性對(duì)照（pTrc-AtMCT與pAC-BETA共轉(zhuǎn)染大腸桿菌XL1-Blue）中的結(jié)果一致。陰性對(duì)照中，僅pTrc和pAC-BETA共轉(zhuǎn)染的大腸桿菌能在雙抗LB固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，但菌體顏色呈白色，其原因是無(wú)MCT基因表達(dá)或表達(dá)量過(guò)低，無(wú)法合成β-胡蘿卜素?？梢?jiàn)，大腸桿菌中超表達(dá)TcMCT基因可促進(jìn)β-胡蘿卜素大量積累，推測(cè)TcMCT與AtMCT基因?qū)祁惢衔锏暮铣砂l(fā)揮相似的生物學(xué)功能（Rohdich et al.，2006）。

3 討論

本研究利用同源克隆技術(shù)從南方紅豆杉綠色樹(shù)皮中克隆獲得TcMCT基因cDNA全長(zhǎng)序列，其編碼蛋白N端含84個(gè)氨基酸殘基的質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽，以Arg88為切割位點(diǎn)，與擬南芥AtMCT蛋白的切割位點(diǎn)相同（Rohdich et al.，2000;Xiao et al.，2009）。此外，TcMCT蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)與AtMCT蛋白相似，均為同源二聚體，且MEP結(jié)合位點(diǎn)和CTP結(jié)合位點(diǎn)位置也相似，推測(cè)TcMCT蛋白具有與AtMCT蛋白一樣的催化活性（Rohdich et al.，2000）。本研究亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示，TcMCT蛋白定位于葉綠體中，與同為裸子植物的銀杏GbMCT轉(zhuǎn)運(yùn)肽定位情況（Kim et al.，2006）一致，也與紫杉醇前體合成定位于質(zhì)體（Eisenreich et al.，1996）和MEP途徑定位于質(zhì)體（Botella-Pavia et al.，2004;Kim et al.，2006）的事實(shí)相符，暗示裸子植物MCT蛋白氨基酸序列的保守性較高，具有相似的生物學(xué)功能。

紫杉醇和青蒿素等萜烯物質(zhì)的生物合成途徑包括MEP途徑（Towler and Weathers，2007;陸錦池等，2009）。其中，青蒿素的生物合成及積累主要場(chǎng)所為青蒿分泌型腺毛（Olofsson et al.，2012）。張曼等（2016）也曾研究發(fā)現(xiàn)，AaMCT基因在青蒿分泌型腺毛中高表達(dá)，在其他組織中低表達(dá)。紫杉醇在紅豆杉屬植物樹(shù)皮中合成并積累（Ang et al.，2012;Zheng et al.，2016）。劉萬(wàn)宏（2008）研究發(fā)現(xiàn)，曼地亞紅豆杉TmMECT基因在曼地亞紅豆杉綠色樹(shù)皮中的表達(dá)量較高，但在根和莖中的表達(dá)量較低。由此可見(jiàn)，不同物種的MCT基因組織表達(dá)特異性與其萜烯生物合成部位相吻合。本研究也發(fā)現(xiàn)，TcMCT基因在南方紅豆杉綠色樹(shù)皮中的表達(dá)量最高，說(shuō)明紫杉醇生物合成主要發(fā)生在南方紅豆杉綠色樹(shù)皮中。Liu等（2009）、王輝等（2018）研究發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌中超表達(dá)紫杉醇生物合成中MEP途徑的基因能促進(jìn)β-胡蘿卜素的積累，菌落呈橘黃色。本研究將pAC-BETA和pTrc-TcMCT共轉(zhuǎn)染大腸桿菌XL1-Blue后發(fā)現(xiàn)，菌落也呈橘黃色，表明大腸桿菌中超表達(dá)TcMCT基因可促進(jìn)β-胡蘿卜素大量積累，與上述前人研究結(jié)果一致?？梢?jiàn)，TcMCT基因在宿主菌中高效表達(dá)，推動(dòng)萜類代謝向β-胡蘿卜素合成方向的流動(dòng)，促進(jìn)萜類化合物β-胡蘿卜素積累，進(jìn)一步證實(shí)MCT催化MEP和CDP合成CDP-ME的過(guò)程對(duì)于萜類物質(zhì)的生物合成至關(guān)重要。在今后可通過(guò)構(gòu)建TcMCT超表達(dá)載體獲得超表達(dá)TcMCT基因的南方紅豆杉轉(zhuǎn)基因株系，進(jìn)一步研究MCT在紫杉醇生物合成途徑中的分子機(jī)制，為探究紫杉醇生物合成調(diào)控提供新的候選基因。

4 結(jié)論

不同物種的MCT氨基酸序列具有較高保守性，TcMCT基因具有明顯的組織表達(dá)特異性，可調(diào)控萜類物質(zhì)如β-胡蘿卜素等的生物合成，推測(cè)TcMCT基因在紫杉醇生物合成中發(fā)揮重要調(diào)控作用。

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（責(zé)任編輯 陳 燕）