張超 付三雄 周小嬰 唐容 黃莎 楊克相 戚存扣

摘要：【目的】克隆甘藍型油菜的甘油-3-磷酸脫氫酶（GPDH）基因（BnGPDH），分析其表達特性并構建植物過表達載體，為研究該基因在油菜種子三酰甘油（TAG）合成和積累中的作用機制提供理論參考?！痉椒ā恳愿仕{型油菜H105為材料，采用同源克隆技術克隆與At3G07690同源的BnGPDH基因，對其進行生物信息學分析，利用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測BnGPDH基因在甘藍型油菜不同組織[根、莖、葉、蕾、花及花后（DAF）7、14、21、30和40 d角果皮和種子]及高、低油含量自交系角果皮和種子中的表達情況，并將克隆獲得的BnGPDH基因連接至攜帶napin啟動子的pCAMBIA1390-NAPIN載體上構建植物過表達載體?！窘Y果】克隆獲得的BnGPDHc2-1和BnGPDHc2-2基因編碼區(qū)（CDS）長度均為1338 bp，編碼445個氨基酸，其編碼蛋白僅有5個氨基酸差異，均具有NAD_Gly3P_dh_N和NAD_? Gly3P_dh_C結構域，定位于細胞質，分別與白菜細胞質型GPDH蛋白（XP_009147040.1）和甘藍細胞質型GPDH蛋白（XP_013585317.1）的氨基酸序列具有較高相似度，對應的相似度為100.00%和99.78%，且二者與雙子葉植物GPDH蛋白親緣關系較近，與單子葉植物GPDH蛋白親緣關系較遠。BnGPDHc2-1和BnGPDHc2-2基因在甘藍型油菜不同組織中均有表達，且表達模式總體上相似，在21DAF和30DAF種子中的表達量顯著高于其他組織部位（P<0.05，下同），表明21DAF和30DAF是油菜種子TAG合成和積累的高峰期，但在角果生長發(fā)育不同時期這2個基因的表達略有不同，且在莖、蕾、種子（7DAF、21DAF、30DAF和40DAF）和角果皮（7DAF和40DAF）中，BnGPDHc2-1基因的表達量均顯著高于BnGPDHc2-2基因，而在14DAF角果皮中BnGPDHc2-2基因的表達量顯著高于BnGPDHc2-1基因。21DAF種子中BnGPDHc2-1基因在3個高油含量自交系中的表達量顯著高于3個低油含量自交系，BnGPDHc2-2基因在高油含量自交系IL130和IL594中的表達量顯著高于3個低油含量自交系;在30DAF種子中，BnGPDHc2-1和BnGPDHc2-2在3個高油含量自交系中的表達量均顯著高于3個低油含量自交系。將BnGPDHc2-1和BnGPDHc2-2基因分別連接至攜帶napin啟動子的pCAMBIA1390-NAPIN載體上可成功構建獲得植物過表達載體。【結論】BnGPDHc2-1和BnGPDHc2-2基因在甘藍型油菜不同發(fā)育期角果中行使的功能存在一定分化，在進化過程中可能分別來源于白菜基因組和甘藍基因組，但均在甘藍型油菜種子TAG合成和積累發(fā)揮重要調控作用。因此，構建的植物過表達載體可用于BnGPDH基因功能分析及油菜種子油含量基因工程改良研究。

關鍵詞： 甘藍型油菜;甘油-3-磷酸脫氫酶（GPDH）;表達特性;生物信息學;植物過表達載體

0 引言

【研究意義】甘藍型油菜（Brassica napus L.）是全球廣泛種植的主要油料作物之一，提高其種子油脂含量是一個重要的育種目標（王漢中和殷艷，2014）。油脂的主要成分為三酰甘油（TAG），是3-磷酸甘油（G3P）和?；o酶A（acyl-CoA）在一系列酶促作用下聚合形成的產物。研究發(fā)現(xiàn)，促進acyl-CoA和G3P合成可提高TAG含量（Baud and Lepiniec，2010）。其中，G3P是由甘油-3-磷酸脫氫酶（GPDH或GPD）以糖酵解的中間產物磷酸二羥丙酮（DHAP）為底物催化合成，GPDH是調控G3P合成途徑的關鍵酶（Eastmond，2004）。因此，克隆BnGPDH基因，明確其表達特性，并構建植物過表達載體對油菜種子油脂含量的遺傳改良具有重要意義。【前人研究進展】目前，有關GPDH基因的相關研究報道較多。在酵母中，GPD1和GPD2是甘油合成的限制因子（Remize et al.，2001），其中，沉默GPD1基因表達會導致GPDH活性降低20%，甘油合成量降低19%（He et al.，2014）;在衣藻中，沉默GPD2基因表達會導致其在缺氮條件下TAG合成量減少（Morales-Sánchez et al.，2017），但衣藻超量表達酵母GPD1基因會導致其TAG含量增加67.5%（Wang et al.，2018）。對于高等植物，如甘藍型油菜過量表達酵母胞質GPDH基因會導致其種子中的TAG合成量增加40%，且DHAP迅速減少（Vigeolas et al.，2007）;亞麻芥植株中被轉入AtDGAT1和酵母胞質型GPD1共表達載體后其種子油含量比野生型提高13%（Chhikara et al.，2017）。上述研究表明，GPDH基因在TAG合成中發(fā)揮重要調控作用。【本研究切入點】目前，鮮見克隆甘藍型油菜GPDH基因（BnGPDH），并分析其表達特性與種子TAG積累相關性的研究報道?！緮M解決的關鍵問題】以甘藍型油菜H105為材料，利用同源克隆技術克隆At3G07690同源基因BnGPDH，對其進行生物信息學分析，并采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測其組織表達特性及在高、低油含量自交系在TAG積累高峰期角果皮和種子中的表達量，最后構建BnGPDH基因的植物過表達載體，為研究該基因在油菜種子油分積累中的分子調控機制提供理論參考。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試甘藍型油菜H105及攜帶甘藍型油菜napin啟動子的pCAMBIA1390-NAPIN載體（簡稱pC1300-N）均由江蘇省農業(yè)科學院經濟作物研究所提供。高油含量自交系IL1130、IL474、IL594及低油含量自交系IL134、IL202、IL525由貴州省油料科學研究所提供。主要試劑：pEASY-T1載體和大腸桿菌感受態(tài)細胞購自北京全式金生物技術有限公司;EZ-10 DNAaway RNA提取試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司;快速質粒小提試劑盒和瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司;PrimeScriptTM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit、限制性內切酶、T4連接酶、PrimeScriptTM RT rea-gent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）和SYBR? Premix Ex TaqTM II（Tli RNaseH Plus）試劑盒等購自寶日醫(yī)生物技術（北京）有限公司。

1. 2 樣品采集

甘藍型油菜H105種植于貴州省油料科學研究所貴陽實驗田，于盛花期標記開放的花朵，并采集根、莖、葉、蕾、花等組織，于角果期采集花后7 d（7DAF）、14 d（14DAF）、21 d（21DAF）、30 d（30DAF）和40 d（40DAF）的角果皮和種子，采集樣品后液氮速凍， -80 ℃保存，用于qRT-PCR檢測。

1. 3 RNA提取及cDNA合成

參照EZ-10 DNAaway RNA提取試劑盒說明提取樣品總RNA，并用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，用Nanodrop 2000超微量分光光度計測定其濃度。根據PrimeScript? II 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒說明以葉片RNA為模板反轉錄合成cDNA，用于BnGPDH基因克隆。參照PrimeScript? RT Reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）試劑盒說明以各組織RNA為模板反轉錄合成cDNA，用于qRT-PCR檢測。

1. 4 引物設計

將At3G07690基因序列與Brassica Database（http：//brassicadb.org/brad/）中的甘藍型油菜基因組序列進行比對，獲取與At3G07690同源的BnGPDH基因序列，設計其編碼區(qū)（CDS）的特異擴增引物P1和P2（表1），并在引物5'端分別添加BamH I和EcoR I酶切位點（下劃線處）。根據克隆得到的BnGPDH基因序列設計qRT-PCR引物（P3/P4和P5/P6），內參基因引物根據BnUBC21（EV086936）序列設計（表1）。引物委托上海英駿生物技術有限公司合成。

1. 5 基因克隆

以甘藍型油菜H105葉片cDNA為模板、P1和P2為引物克隆BnGPDH基因。PCR反應體系按照Ex Taq說明配制。擴增程序：94 ℃預變性4 min，94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，進行30個循環(huán);72 ℃延伸10 min。PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后切膠回收預期大小（1338 bp）的基因片段，連接到pEASY-T1載體后轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞，菌液PCR鑒定陽性菌株送至北京六合華大基因有限公司進行測序。

1. 6 生物信息學分析

利用DNAMAN對測序結果進行整理，并將測序結果提交至Brassica Database中與甘藍型油菜參考基因組序列進行比對分析。利用ProtParam預測編碼蛋白的理化性質;利用SMART預測蛋白的保守結構域;利用SWISS-MODEL預測蛋白的三級結構;利用TBpred預測蛋白的亞細胞定位。從NCBI下載不同物種GPDH蛋白序列，以MEGA 6.0的ClustalW進行序列分析，并采用鄰接法（NJ）構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，參數(shù)設置bootstrap重復1000次，用FigTree處理系統(tǒng)發(fā)育進化樹圖像。

1. 7 qRT-PCR檢測

以不同組織的cDNA為模板，按照SYBR? Premix Ex TaqTM II（Tli RNaseH Plus）試劑盒的說明配制反應體系，在CFX96 Real-Time PCR Detection System上檢測基因相對表達量。擴增程序：95 ℃預變性120 s;95 ℃ 10 s，60 ℃ 35 s，進行40個循環(huán)。以BnUBC21為內參基因，采用2?ΔΔCt的方法計算相對表達量（Livak and Schmittgen，2001），3次生物學重復。

1. 8 種子特異表達的過表達載體構建

用BamH I和EcoR I雙酶切陽性克隆質粒pEASY-T1-BnGPDHc2-1和pEASY-T1-BnGPDHc2-2及pC1390-N載體，切膠回收BnGPDHc2-1和BnGPDHc2-2基因片段和線性化的pC1390-N載體后，分別用T4連接酶16 ℃過夜連接，并轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞，菌液PCR鑒定出陽性克隆菌株后提取其重組質粒，雙酶切鑒定重組質粒，并送至北京六合華大基因有限公司測序。

1. 9 統(tǒng)計分析

采用Excel 2013進行數(shù)據整理及作圖，以SPSS 22.0進行差異顯著性分析，使用Photoshop CS 6.0輔助制圖。

2 結果與分析

2. 1 BnGPDH基因克隆結果

如圖1所示，PCR產物長度約1300 bp，與預期結果（1338 bp）相符。測序結果顯示，PCR產物有2條BnGPDH基因序列，與At3G07690的同源性均較高，分別為83.65%和83.51%，CDS全長均為1338 bp，其中一條與甘藍型油菜參考基因組中轉錄本GSBRNA2 T00059510001（BnaA05g29950D）的核苷酸序列相似度為99.93%，編碼的氨基酸序列完全一致，命名為BnGPDHc2-1基因;另一條與轉錄本GSBRNA2T000389 61001（BnaC05g44270D）的核苷酸序列相似度為99.85%，編碼的氨基酸序列完全一致，命名為BnGPDHc2-2基因。BnGPDHc2-1和BnGPDHc2-2蛋白僅有5個氨基酸差異（圖2），氨基酸序列相似度為98.88%。

2. 2 BnGPDH蛋白生物信息學分析結果

BnGPDHc2-1蛋白由445個氨基酸組成，分子量約49.958 kD，理論等電點（pI）為6.50，分子式為C2247H3584N604O645S18，負電荷氨基酸殘基（Asp+Glu）和正電荷氨基酸殘基（Arg+Lys）分別為56和54個。BnGPDHc2-2由445個氨基酸組成，分子量約50.095 kD，pI為6.49，分子式為C2249H3587N605O647S20，負電荷氨基酸殘基（Asp+Glu）和正電荷氨基酸殘基（Arg+Lys）分別為56和54個。蛋白質的保守結構域分析結果顯示，BnGPDHc2-1和BnGPDHc2-2蛋白具有相似的結構，均具有NAD_Gly3P_dh_N和NAD_Gly3P_dh_C結構域（圖2）。亞細胞定位結果顯示，BnGPDHc2-1和BnGPDHc2-2蛋白均定位于細胞質中。以2pla.1.A（GPDH1類似蛋白）為模板對BnGPDHc2-1和BnGPDHc2-2蛋白進行同源建模，其三級結構如圖3所示，BnGPDHc2-1和BnGPDHc2-2與2pla.1.A三級結構的一致性分別為30.82%和30.49%。可見，克隆獲得的BnGPDHc2-1和BnGPDHc2-2基因為細胞質型GPDH基因。

2. 3 系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析結果

由圖4可知，25個物種GPDH蛋白可分為五大類，其中，BnGPDHc2-1和BnGPDHc2-2與擬南芥（Arabidopsis thaliana，XP_002882544.1）、亞麻芥（Camelina sativa，XP_010464410.1）、蘿卜（Raphanus sativus，XP_018491080.1）、甘藍（Brassica oleracea，XP_01358317.1）、白菜（B. rapa，XP_009147040.1）及甘藍型油菜品種中雙11（XP_013750519.1）的GPDH蛋白氨基酸序列相似度均在93.00%以上，共處在第Ⅲ類，且BnGPDHc2-1與白菜細胞質型GPDH蛋白（XP_009147040.1）的氨基酸序列相似度為100.00%，而BnGPDHc2-2與甘藍細胞質型GPDH蛋白（XP_013585317.1）的氨基酸序列相似度為99.78%，由此推測BnGPDHc2-1基因來源于白菜基因組，而BnGPDHc2-2基因來源于甘藍基因組。此外，BnGPDHc2-1和BnGPDHc2-2蛋白與第I、II和IV類中各物種GPDH蛋白的氨基酸序列相似度均在80.00%以上，說明GPDH蛋白在種屬間保守性較高，但與第V類成員的氨基酸序列相似度均低于80.00%，說明BnGPDH蛋白與雙子葉植物GPDH蛋白親緣關系較近，與單子葉植物GPDH蛋白親緣關系較遠。

2. 4 BnGPDH基因在高油含量自交系中的組織表達特性分析結果

由圖5所知，BnGPDHc2-1和BnGPDHc2-2基因在高油含量自交系各組織部位均有表達，且表達模式總體上相似，在21DAF和30DAF種子中表達量顯著高于其他組織（P<0.05，下同），蕾和7DAF角果皮中表達量次之，在花中的表達量較低?？梢姡@2個基因在種子油分積累高峰時期表達最活躍，21DAF和30DAF是油菜種子TAG合成和積累的高峰期。在油菜角果生長發(fā)育的不同時期，BnGPDHc2-1和BnGPDHc2-2基因的表達略有不同：BnGPDHc2-1在14DAF種子中的表達量顯著低于7DAF種子，而BnGPDHc2-2基因在14DAF和7DAF種子中的表達量差異不顯著（P>0.05，下同）;BnGPDHc2-1基因在7DAF角果皮中的表達量顯著高于14DAF、21DAF、30DAF和40DAF角果皮中的表達量，而BnGPDHc2-2基因在7DAF和14DAF角果皮中的表達量顯著高于21DAF、30DAF和40DAF。此外，在莖、蕾、7DAF種子、21DAF種子、30DAF種子、40DAF種子、7DAF角果皮和40DAF角果皮等組織中，BnGPDHc2-1基因的表達量均顯著高于BnGPDHc2-2基因，而在14DAF角果皮中BnGPDHc2-2基因的表達量顯著高于BnGPDHc2-1基因，說明BnGPDHc2-1和BnGPDHc2-2基因在不同發(fā)育期角果中行使的功能存在一定分化。

2. 5 BnGPDH基因在高、低油含量自交系角果皮和種子中的表達分析結果

由于21DAF和30DAF是油菜種子TAG合成和積累的高峰期，因此，本研究系統(tǒng)分析這2個時期BnGPDH基因在高油含量自交系（IL130、IL474和IL594）及低油含量自交系（IL134、IL202和IL525）角果皮和種子中的表達情況，結果如圖6所示。21DAF角果皮中BnGPDHc2-1和BnGPDHc2-2基因在高油含量自交系IL130中的表達量顯著高于低油含量自交系IL202，且這2個自交系均顯著高于其他4個自交系，30DAF角果皮中BnGPDHc2-1和BnGPDHc2-2基因在高油含量自交系IL130中的表達量均顯著高于其他5個自交系。21DAF種子中BnGPDHc2-1基因在3個高油含量自交系中的表達量顯著高于3個低油含量自交系，BnGPDHc2-2基因在高油含量自交系IL130和IL594中的表達量顯著高于3個低油含量自交系;在30DAF種子中BnGPDHc2-1和BnGPDHc2-2基因在3個高油含量自交系中的表達量均顯著高于3個低油含量自交系。可見，BnGPDHc2-1和BnGPDHc2-2基因可能在油菜種子TAG積累中發(fā)揮重要作用。

2. 5 植物過表達載體構建結果

將BnGPDHc2-1和BnGPDHc2-2基因CDS片段分別連接至pC1390-N載體上而構建重組質粒pC1390-N-BnGPDHc2-1和pC1390-N-BnGPDHc2-2，再轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞，菌液PCR鑒定出陽性克隆菌株，提取其重組質粒，并用BamH I和EcoR I進行雙酶切，結果發(fā)現(xiàn)，雙酶切產物中含一段約1300 kb的片段，與目標基因片段大?。?338 bp）基本相符（圖7中2和5泳道所示），用Hind III和EcoR I雙酶切重組質?？色@得約2400 bp的片段（圖7中3和6泳道所示），表明目標基因成功連接至攜帶napin啟動子的植物過表達載體上。

3 討論

GPDH在植物種子TAG合成過程中發(fā)揮重要作用（Vigeolas and Geigenberger，2004;Vigeolas et al.，2007;Chhikara et al.，2017）。近年來，已從蓖麻（弭憲杰等，2011）、水稻（余霞等，2017）、玉米（Zhao et al.，2019）、甘藍型油菜（胡軍，2013;劉少鋒等，2017a）等作物中克隆獲得GPDH基因，但鮮見與At3G07690同源的BnGPDH基因相關研究報道。本研究從甘藍型油菜H105中克隆獲得BnGPDHc2-1和BnGPDHc2-2基因，二者編碼蛋白的氨基酸序列、理化特性、保守結構域、亞細胞定位和三級結構均高度相似，其中，且BnGPDHc2-1與白菜細胞質型GPDH蛋白（XP_009147040.1）的氨基酸序列相似度為100.00%，而BnGPDHc2-2與甘藍細胞質型GPDH蛋白（XP_013585317.1）的氨基酸序列相似度為99.78%，推測甘藍型油菜（AACC，2n=38）是由白菜（AA，2n=20）和甘藍（CC，2n=18）經自然雜交聚合而成，因此甘藍型油菜基因組是白菜和甘藍2個物種基因組的疊加。

本研究發(fā)現(xiàn)，BnGPDHc2-1和BnGPDHc2-2基因在油菜種子TAG合成和積累的高峰期（21DAF和30DAF）中表達量最高，與劉少鋒等（2017b）的研究結果一致，表明該時期BnGPDH基因高效表達可提高油菜種子中TAG合成和積累量。BnGPDHc2-1和BnGPDHc2-2基因在蕾和角果發(fā)育前期（7DAF）的角果皮中高表達，水稻OsGPDH1基因在生殖發(fā)育時期的劍葉中高表達（余霞等，2017），推測BnGPDH基因可能還與植物的生長發(fā)育相關。本研究還發(fā)現(xiàn)，BnGPDHc2-1和BnGPDHc2-2基因在花中的表達量較低，與胡軍（2013）的研究結果不同，其原因可能是本研究克隆的BnGPDH基因與胡軍（2013）克隆的BnGPDHc1基因不同。此外，BnGPDHc2-1和BnGPDHc2-2基因在高油含量自交系30DAF種子中的表達量顯著高于低油含量自交系，與Fu等（2009）、張超（2012）、Lu等（2018）的研究結果基本一致，表明本研究克隆獲得的BnGPDHc2-1和BnGPDHc2-2基因可能是調控油菜種子TAG合成和積累的關鍵候選基因。

本研究克隆獲得的BnGPDHc2-1和BnGPDHc2-2基因編碼蛋白的氨基酸序列高度相似，僅存在5個氨基酸序列差異，且表達模式總體上相似，但BnGPDHc2-1基因在莖、蕾、7DAF種子、21DAF種子、30DAF種子、40DAF種子、7DAF角果皮和40DAF角果皮等組織中的表達量顯著高于BnGPDHc2-2基因，在14DAF角果皮中BnGPDHc2-2基因的表達水平顯著高于BnGPDHc2-1基因，說明這2個基因在不同發(fā)育期角果中行使的功能存在一定分化。此外，BnGPDHc2-1和BnGPDHc2-2基因在21DAF和30DAF種子中表達量顯著高于其他組織，說明二者均具有種子優(yōu)勢表達的特性，為進一步研究其生物學功能，需構建種子特異表達載體。但采用傳統(tǒng)的CaMV35S啟動子可能無法準確研究BnGPDH基因在種子TAG合成中的作用。甘藍型油菜的napin啟動子具有種子特異表達的特性（譚小力等，2005;周曉嬰等，2012），現(xiàn)已廣泛應用種子特異表達載體構建（鄒敏等，2012;張超等，2014）。因此，本研究分別構建了BnGPDHc2-1和BnGPDHc2-2基因種子特異表達的植物過表達載體，將用于甘藍型油菜的遺傳轉化，從而進一步開展BnGPDH基因功能分析及油菜種子油含量的基因工程改良研究。

4 結論

BnGPDHc2-1和BnGPDHc2-2基因在不同發(fā)育時期角果中行使的功能存在一定分化，在進化過程中可能分別來源于白菜基因組和甘藍基因組，但均在甘藍型油菜種子TAG合成和積累中發(fā)揮重要調控作用。因此，構建BnGPDH基因的植物過表達載體可用于其基因功能分析及油菜種子油含量基因工程改良研究。

參考文獻：

胡軍. 2013. 三磷酸甘油脫氫酶基因和甘油代謝對擬南芥種子油含量與根系發(fā)育的影響[D]. 武漢：華中農業(yè)大學. [Hu J. 2013. Effects of GPDH genes and metabolism on Arabidopsis seed oil content and root development[D]. Wuhan：Huazhong Agricultural University.]

劉少鋒，汪慧慧，鄔克彬，熊興華. 2017a. 甘藍型油菜GPDH基因克隆及其生物信息學分析[J]. 華北農學報，32（2）：109-116. [Liu S F，Wang H H，Wu K B，Xiong X H. 2017a. Cloning and bioinformatics analysis of GPDH in rapeseed[J]. Acta Agriculturae Boreali-Sinica，32（2）：109-116.]

劉少鋒，刑蔓，汪慧慧，鄔克彬，官春云，肖鋼，熊興華. 2017b. 甘藍型油菜甘油三磷酸脫氫酶（BnaGPDH）基因的克隆與表達[J]. 植物生理學報，53（9）：1772-1780. [Liu S F，Xing M，Wang H H，Wu K B，Guan C Y，Xiao G，Xiong X H. 2017b. Molecular cloning and expression profile of BnaGPDH gene in Brassica napus[J]. Plant Physiology Journal，53（9）：1772-1780.]

弭憲杰，徐榮華，劉愛忠，吳丁，田波. 2011. 蓖麻三磷酸甘油脫氫酶基因（RcGPDH）的克隆及功能分析[J]. 中國油料作物學報，33（5）：451-458. [Mi X J，Xu R H，Liu A Z，Wu D，Tian B. 2011. Cloning and characterization of glycerol-3-phosphate dehydrogenase gene（RcGPDH） from castor bean[J]. Chinese Journal of Oil Crop Sciences，33（5）：451-458.]

譚小力，張志燕，伍娟，李家洋. 2005. 油菜種子特異表達啟動子NAPIN的功能鑒定[J]. 中國油料作物學報，27（4）：85-88. [Tan X L，Zhang Z Y，Wu J，Li J Y. 2005. Function identification of a seed specific promotor from rapeseed[J]. Chinese Journal of Oil Crop Sciences，27（4）：85-88.]

王漢中，殷艷. 2014. 我國油料產業(yè)形勢分析與發(fā)展對策建議[J]. 中國油料作物學報，36（3）：414-421. [Wang H Z，Yin Y. 2014. Analysis and strategy for oil crop industry in China[J]. Chinese Journal of Oil Crop Sciences，36（3）：414-421.]

余霞，余舜武，李天菲，張余，陳守俊，陳晨，李佳，胡頌平. 2017. 水稻OsGPDH1的克隆與功能鑒定[J]. 核農學報，31（5）：829-836. [Yu X，Yu X W，Li T F，Zhang Y，Chen S J，Chen C，Li J，Hu S P. 2017. Cloning and functional identification of OsGPDH1 in rice[J]. Journal of Nuclear Agricultural Sciences，31（5）：829-836.]

張超. 2012. 油菜甘油-3-磷酸脫氫酶基因的克隆及功能研究[D]. 南京：南京農業(yè)大學. [Zhang C. 2012. Cloning and functional research of glycerol-3-phosphate dehydrogenase gene from Brassica napus L.[D]. Nanjing：Nanjing Agricultural University.]

張超，付三雄，陳松，李大雄，戚存扣. 2014. 甘藍型油菜種子中G3PDH基因特異性表達的ihpRNA載體構建[J]. 貴州農業(yè)科學，42（9）：29-34. [Zhang C，F(xiàn)u S X，Chen S，Li D X，Qi C K. 2014. Construction a seed-specific expre-ssion ihpRNA vector targeting the G3PDH gene of Bra-ssica napus L.[J]. Guizhou Agricultural Sciences，42（9）：29-34.]

周曉嬰，申愛娟，張潔夫，浦惠明，龍衛(wèi)華，胡茂龍，陳鋒，付三雄，顧慧，陳松，戚存扣. 2012. RNAi沉默轉基因油菜fad2基因表達的種子特異性分析[J]. 分子植物育種，10（3）：305-310. [Zhou X Y，Shen A J，Zhang J F，Pu H M，Long W H，Hu M L，Chen F，F(xiàn)u S X，Gu H，Chen S，Qi C K. 2012. Analysis of seed-specificity of RNAi silen-cing the fad2 gene expression of transgenic rape seed（Brassica napus）[J]. Molecular Plant Breeding，10（3）：305-310.]

鄒敏，唐佳佳，宋洪元. 2012. 油菜種子特異啟動子Napin控制外源EGFP基因在芥菜中的表達[J]. 中國蔬菜，（14）：18-22. [Zou M，Tang J J，Song H Y. 2012. Expression of EGFP gene controlled by rape seed-specific Napin promoter in transgenic mustard[J]. China Vegetables，（14）：18-22.]

Baud S，Lepiniec L. 2010. Physiological and developmental regulation of seed oil production[J]. Progress in Lipid Research，49（3）：235-249.

Chhikara S，Abdullah H M，Akbari P，Schnell D，Dhankher O P. 2017. Engineering Camelina sativa（L.） crantz for enhanced oil and seed yields by combining diacylglycerol acyltransferase1 and glycerol-3-phosphate dehydrogenase expression[J]. Plant Biotechnology Journal，16（5）：1034-1045.

Eastmond P J. 2004. Glycerol-insensitive Arabidopsis mutants：gli1 seedlings lack glycerol kinase，accumulate gly-cerol and are more resistant to abiotic stress[J]. The Plant Journal，37（4）：617-625.

Fu S X，Cheng H，Qi C K. 2009. Microarray analysis of gene expression in seeds of Brassica napus planted in Nanjing（altitude：8.9 m），Xining（altitude：2261.2 m） and Lhasa（altitude：3658 m） with different oil content[J]. Molecular Biology Reports，36（8）：2375-2386.

He W J，Ye S C，Xue T，Xu S Y，Li W Y，Lu J H，Cao L Y，Ye B Y，Chen Y Q. 2014. Silencing the glycerol-3-phosphate dehydrogenase gene in Saccharomyces cerevisiae results in more ethanol being produced and less glycerol[J]. Biotechnology Letters，36（3）：523-529.

Livak K J，Schmittgen T D. 2001. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2（-Delta Delta C（T）） method[J]. Methods，25（4）：402-408.

Lu S P，Sturtevant D，Aziz M，Jin C，Li Q，Chapman K D，Guo L. 2018. Spatial analysis of lipid metabolites and expressed genes reveals tissue-specific heterogeneity of lipid metabolism in high- and low-oil Brassica napus L. seeds[J]. The Plant Journal，94（6）：915-932.

Morales-Sánchez D，Kim Y，Terng E L，Peterson L，Cerutti H. 2017. A multidomain enzyme，with glycerol-3-phosphate dehydrogenase and phosphatase activities，is involved in a chloroplastic pathway for glycerol synthesis in Chlamydomonas reinhardtii[J]. The Plant Journal，90（6）：1079-1092.

Remize F，Barnavon L，Dequin S. 2001. Glycerol export and glycerol-3-phosphate dehydrogenase，but not glycerol phosphatase，are rate limiting for glycerol production in Sa-ccharomyces cerevisiae[J]. Metabolic Engineering，3（4）：301-312.

Vigeolas H，Geigenberger P. 2004. Increased levels of glycerol-3-phosphate lead to a stimulation of flux into triacylglycerol synthesis after supplying glycerol to developing seeds of Brassica napus L. in planta[J]. Planta，219（5）：827-835.

Vigeolas H，Waldeck P，Zank T，Geigenberger P. 2007. Increasing seed oil content in oil-seed rape（Brassica napus L.） by over-expression of a yeast glycerol-3-phosphate dehydrogenase under the control of a seed-specific promoter[J]. Plant Biotechnology Journal，5（3）：431-441.

Wang C，Li Y，Lu J，Deng X，Li H，Hu Z. 2018. Effect of overexpression of LPAAT and GPD1 on lipid synthesis and composition in green microalga Chlamydomonas rein-hardtii[J]. Journal of Applied Phycology，30（3）：1711-1719.

Zhao Y，Liu M，Lin H，Li X，Wang F，Yan B，Wei J P，Zhao C J，Li Z T，Xu J Y. 2019. A cytosolic NAD+-dependent GPDH from maize（ZmGPDH1） is involved in confe-rring salt and osmotic stress tolerance[J]. BMC Plant Bio-logy，19（1）：16.

（責任編輯 陳 燕）