夏玲 梁昕景 王學(xué)林 楊小鋒

摘要：【目的】?jī)?yōu)化甜瓜半粒干種子DNA提取方法，為甜瓜相關(guān)分子研究提供技術(shù)支持?！痉椒ā恳蕴鸸习肓８煞N子為材料，比較改良CTAB法、SDS法、高鹽低pH法和尿素法4種提取方法的DNA提取效果，并對(duì)改良CTAB法中的提取液CTAB濃度、裂解時(shí)間、苯酚抽提次數(shù)等進(jìn)行優(yōu)化，以瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)分別檢測(cè)DNA的質(zhì)量和純度。最后通過(guò)SSR分析驗(yàn)證優(yōu)化后改良CTAB法提取DNA的效果?！窘Y(jié)果】4種提取方法中，改良CTAB法提取的DNA提取率最高，且DNA質(zhì)量和純度均高于其他提取方法。優(yōu)化得到改良CTAB法的最佳提取條件為：提取液CTAB濃度2%，裂解時(shí)間20 min，苯酚抽提1次[先用苯酚/氯仿/異戊醇（25∶24∶1）抽提1次，再用氯仿/異戊醇（24∶1）抽提 1次]。在此條件下，提取的甜瓜半粒干種子DNA質(zhì)量和純度較好，以此為模板進(jìn)行SSR分子標(biāo)記分析時(shí)，電泳條帶穩(wěn)定、清晰，基本無(wú)雜帶，可清楚區(qū)分品種間的差異?！窘Y(jié)論】?jī)?yōu)化后的改良CTAB法提取甜瓜半粒干種子DNA效果較好，可滿足甜瓜種子分子標(biāo)記和遺傳多樣性分析等分子實(shí)驗(yàn)需求。

關(guān)鍵詞： 甜瓜;干種子;DNA提取;CTAB法;優(yōu)化

0 引言

【研究意義】甜瓜屬于葫蘆科（Cucurbitaceae）黃瓜屬（Cucumis）一年生草本植物，是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物之一。近年來(lái)，隨著分子育種技術(shù)的發(fā)展，甜瓜分子育種日益受到廣大研究者的關(guān)注。DNA提取是分子育種和分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)，其質(zhì)量和純度對(duì)要求較高的分子實(shí)驗(yàn)具有重要影響（王振東等，2008;陳汝等，2017）。同時(shí)，高質(zhì)量的DNA是基因克隆及SRAP、RAPD、AFLP等分子標(biāo)記技術(shù)的前提條件。因此，優(yōu)化DNA提取方法對(duì)提高研究結(jié)果的準(zhǔn)確性具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，有關(guān)甜瓜不同組織基因組DNA提取方法的研究報(bào)道較多。陳金體和王曉峰（2007）采用CTAB法提取甜瓜幼苗的DNA，從DNA分子水平對(duì)甜瓜純度進(jìn)行鑒定。李菊芬等（2008a）采用尿素提取法提取甜瓜子葉的DNA，從DNA分子水平對(duì)甜瓜雜種的純度進(jìn)行鑒定。馬海財(cái)?shù)龋?010）采用改良CTAB法提取甜瓜幼嫩葉片DNA，并構(gòu)建甜瓜后代群體的DNA遺傳圖譜。李超等（2017）采用改良CTAB法提取甜瓜葉片DNA，從DNA分子水平對(duì)甜瓜新品種純度和真實(shí)性進(jìn)行鑒定研究。趙光偉等（2017）采用CTAB法提取甜瓜品種眾天翠雪葉片DNA，從DNA分子水平進(jìn)行品種純度鑒定等。以上研究主要采用幼苗、子葉、嫩葉等為材料，需經(jīng)過(guò)浸種、催芽、育苗等前期處理過(guò)程，不但周期長(zhǎng)，而且提取方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，工作效率較低。至今，僅李菊芬等（2008a）研究發(fā)現(xiàn)，以甜瓜干種子為材料可提取到質(zhì)量較好的DNA?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】以甜瓜半粒干種子為材料，無(wú)需育苗，隨時(shí)可提取其DNA，不僅節(jié)省育苗時(shí)間、減少投入成本，還不傷及種胚，種子仍保持活力可育成苗用于后續(xù)試驗(yàn)，具有簡(jiǎn)便、快速、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)，但目前鮮見(jiàn)對(duì)甜瓜半粒干種子DNA提取方法進(jìn)行優(yōu)化的研究報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】以甜瓜半粒干種子為材料，比較改良CTAB法、SDS法、高鹽低pH法和尿素法4種方法提取DNA的效果，并對(duì)改良CTAB法中的提取液CTAB濃度、裂解時(shí)間、苯酚抽提次數(shù)等進(jìn)行優(yōu)化，以瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA的質(zhì)量和純度，最后通過(guò)SSR分析驗(yàn)證優(yōu)化后改良CTAB法提取DNA的效果，為甜瓜分子育種輔助標(biāo)記開(kāi)發(fā)、種質(zhì)資源遺傳多樣性研究、種子純度鑒定等分子生物學(xué)研究提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

供試材料為甜瓜品種金蜜六號(hào)的半粒干種子，由三亞市南繁科學(xué)技術(shù)研究院保存提供。CTAB、SDS、尿素、乙酸、蛋白酶K、乙醇、異丙醇、Tris飽和酚、氯仿/異戊醇（24∶1）、異丙醇、6×Loading Buffer、TE、DL2000 DNA Marker和瓊脂糖等均購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司。主要儀器設(shè)備：高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf中國(guó)有限公司）、BiometraTAdvanced PCR儀（德國(guó)耶拿分析儀器股份公司）、Speed mix研磨儀（德國(guó)耶拿分析儀器股份有限公司）、超微量核酸蛋白測(cè)定儀（德國(guó)耶拿分析儀器股份有限公司）和瓊脂糖凝膠電泳儀設(shè)備（北京六一生物科技有限公司）等。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 樣品預(yù)處理 用已消毒的剪刀剪取甜瓜干種子的胚乳部分（約為種子的1/2處），去除種殼后備用。

1. 2. 2 不同提取方法比較試驗(yàn) 采用改良CTAB法、SDS法、高鹽低pH法和尿素法4種方法提取甜瓜半粒干種子DNA。改良CTAB法：參照董永軍等（2017）的改良CTAB法，稍作改動(dòng)，具體步驟：取準(zhǔn)備好的樣品放入2 mL離心管，放入直徑8 mm的鋼珠，并加入1 mL CTAB提取液，用研磨儀研磨1～2 min。向研磨好的樣品中加入20 ng/mL蛋白酶K 5 μL，然后置于65 ℃水浴鍋中水浴30 min（期間不斷振蕩離心管）。取出離心管，冷卻至室溫，加入等體積的酚/氯仿/異戊醇（25∶24∶1），顛倒混勻，靜置5 min，12000 r/min離心12 min。取上清液，加入等體積的氯仿/異戊醇（24∶1）輕緩顛倒混勻，靜置5 min，12000 r/min離心12 min。取上清液，加入等體積的-20 ℃預(yù)冷異丙醇，輕緩顛倒混勻，于-20 ℃冰箱放置30 min以上，10000 r/min離心6 min后棄上清液。用70%乙醇洗滌沉淀2～3次，置于通風(fēng)櫥風(fēng)干后溶于30 μL TE中備用。加入終濃度50 μg/mL的RNase，37 ℃保溫30 min。最后將DNA樣品置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩DS法參照彭鎖堂等（2002）的研究方法進(jìn)行操作，高鹽低pH法參照楊萍等（2004）、楊恩等（2005）的研究方法進(jìn)行操作，尿素法參照李菊芬等（2008b）的研究方法進(jìn)行操作。最后檢測(cè)DNA的質(zhì)量和純度。

1. 2. 3 改良CTAB法提取甜瓜半粒種子DNA的優(yōu)化試驗(yàn)

1. 2. 3. 1 裂解時(shí)間優(yōu)化 采用2% CTAB提取液提取甜瓜半粒干種子DNA，先用苯酚/氯仿/異戊醇（體積比25∶24∶1）抽提1次，再用氯仿/異戊醇（體積比24∶1）抽提1次，裂解時(shí)間設(shè)為10、20和30 min，其他條件同1.2.2。最后檢測(cè)DNA的質(zhì)量和純度。

1. 2. 3. 2 CTAB提取液濃度優(yōu)化 分別用1%、2%和3% CTAB提取液提取甜瓜半粒干種子DNA，裂解時(shí)間30 min，先用苯酚/氯仿/異戊醇（體積比25∶24∶1）抽提1次，再用氯仿/異戊醇（體積比24∶1）抽提1次，其他條件同1.2.2。最后檢測(cè)DNA提取質(zhì)量和純度。

1. 2. 3. 3 苯酚抽提次數(shù)優(yōu)化 用2% CTAB提取液提取甜瓜半粒干種子DNA，裂解時(shí)間30 min，抽提方法設(shè)以下3種：苯酚抽提0次，即僅用氯仿/異戊醇（體積比24∶1）抽提1次;苯酚抽提1次，即先用苯酚/氯仿/異戊醇（體積比25∶24∶1）抽提1次，再用氯仿/異戊醇（體積比24∶1）抽提1次;苯酚抽提2次，即先用苯酚/氯仿/異戊醇（體積比25∶24∶1）抽提2次，再用氯仿/異戊醇（體積比24∶1）抽提1次，其他條件同1.2.2。最后檢測(cè)DNA提取質(zhì)量和純度。

1. 2. 4 DNA提取質(zhì)量和純度檢測(cè)

1. 2. 4. 1 紫外分光光度法檢測(cè) 取2 μL DNA提取液，利用超微量核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定DNA的質(zhì)量濃度（ng/μL）及純度（在260、280和230 nm波長(zhǎng)處的吸光值），DNA含量（mg）=質(zhì)量濃度×50×10-6;DNA提取率（mg/g）=DNA含量/半粒種子干重。DNA質(zhì)量判定方法：純DNA的OD260/OD280≈1.8，當(dāng)OD260/OD280為1.8～2.0時(shí)屬于正常范圍，<1.8說(shuō)明有蛋白質(zhì)污染，>2.0說(shuō)明有RNA污染;OD260/OD230>2.0，說(shuō)明無(wú)多糖、酚類(lèi)和小分子雜質(zhì)污染。

1. 2. 4. 2 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) 提取的DNA用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)（120 V，25 min），并用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行觀察拍照。

1. 2. 5 SSR分析驗(yàn)證優(yōu)化后改良CTAB法提取DNA的效果 采優(yōu)化后的CTAB法提取8個(gè)甜瓜品種半粒干種子DNA，以其作為模板進(jìn)行SSR分子標(biāo)記分析，TJ10-F（5'-ACGAGGAAAACGCAAAATCA-3'）和TJ10-R（5'-TGACGTGGACGACATTTTT-3'）引物為甜瓜的SSR核心引物（宋海斌等，2012）。PCR反應(yīng)體系20.0 μL：10×Buffer（含Mg2+）2.0 μL，dNTP 2.0 μL，TJ10F和TJ10-R引物各1.0 μL，Taq DNA聚合酶0.2 μL，DNA模板2.0 μL ddH2O補(bǔ)足至20.0 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)（120 V，25 min），并用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行觀察拍照。

2 結(jié)果與分析

2. 1 不同提取方法的比較結(jié)果

以改良CTAB法、SDS法、高鹽低pH法和尿素法分別提取甜瓜半粒干種子DNA，并用紫外分光光度計(jì)和瓊脂糖電泳檢測(cè)DNA提取效果，結(jié)果如圖1和圖2所示。利用4種提取方法均能獲得甜瓜半粒干種子DNA，DNA條帶干凈，無(wú)明顯的RNA和蛋白污染，其中，改良CTAB法的DNA提取率最高，為0.053 mg/g，且DNA條帶最亮，其次是SDS法，高鹽低pH法的DNA提取率最低，僅為0.024 mg/g，DNA條帶較弱。4種提取方法提取的DNA OD260/OD280為1.83～2.10，其中SDS法和改良CTAB法提取的DNA OD260/OD280更接近1.80，表明這2種提取方法提取的DNA純度較高。僅改良CTAB法提取的DNA OD260/OD230>2.0，其他3種方法均小于2.00，說(shuō)明SDS法和尿素法提取的DNA被酚類(lèi)、多糖和小分子雜質(zhì)污染。綜上所述，改良CTAB法為提取甜瓜半粒于種子DNA的最佳方法。

2. 2 裂解時(shí)間對(duì)改良CTAB法DNA提取效果的影響

由圖3可知，改良CTAB法DNA提取率隨裂解時(shí)間增加呈先升高后降低的變化趨勢(shì)，即裂解時(shí)間為20 min時(shí)DNA提取率達(dá)最大值，其原因是細(xì)胞裂解釋放DNA是一個(gè)緩慢溶出的過(guò)程，時(shí)間的延長(zhǎng)有助于DNA溶出，但超過(guò)一定時(shí)間后樣品DNA不再溶出，即使裂解時(shí)間繼續(xù)增加，DNA提取率也不再升高。不同的裂解時(shí)間對(duì)提取的DNA質(zhì)量同樣影響較大，當(dāng)裂解時(shí)間為10和20 min時(shí)，提取的DNA質(zhì)量無(wú)明顯差異，OD260/OD280和OD260/OD230均在正常范圍內(nèi)，且DNA條帶清晰，無(wú)明顯拖尾現(xiàn)象，但裂解時(shí)間為20 min時(shí)，DNA條帶更亮（圖4）。當(dāng)裂解時(shí)間為30 min時(shí)，提取的DNA質(zhì)量明顯下降，OD260/OD280達(dá)2.10，說(shuō)明其被RNA污染，OD260/OD230為1.75，說(shuō)明其被酚類(lèi)、多糖和小分子雜質(zhì)污染，其電泳圖（圖4）也表現(xiàn)出該問(wèn)題。綜上所述，采用改良CTAB法提取甜瓜半粒干種子DNA時(shí)，最佳裂解時(shí)間為20 min。

2. 3 CTAB提取液濃度對(duì)DNA提取效果的影響

由圖5和圖6可知，隨CTAB提取液濃度的增加，DNA提取率呈先增加后降低的變化趨勢(shì)，即2% CTAB提取液的DNA提取率達(dá)最大值，且DNA條帶最亮，分布集中，無(wú)拖尾現(xiàn)象，OD260/OD280為1.85，OD260/OD230為2.11，而另外兩個(gè)CTAB提取液濃度提取的DNA OD260/OD230均小于2.00;3% CTAB提取液的DNA提取率略有降低，且DNA的質(zhì)量和純度均降低，OD260/OD280為1.78，OD260/OD230為1.63。綜上所述，1%和3% CTAB提取液提取的甜瓜半粒干種子DNA易被多酚、糖類(lèi)和小分子雜質(zhì)污染，2% CTAB提取液提取甜瓜半粒干種子DNA的效果最佳。

2. 4 苯酚抽提次數(shù)對(duì)改良CTAB法DNA提取效果的影響

由圖7和圖8可看出，隨著苯酚抽提次數(shù)的增加，改良CTAB法DNA提取率明顯降低，當(dāng)用苯酚抽提2次時(shí)，提取的DNA質(zhì)量較好，OD260/OD280為1.85，OD260/OD230為2.05，但DNA提取率僅為0.041 mg/g;而未經(jīng)苯酚抽提時(shí)，雖然DNA提取率最高，但DNA質(zhì)量較差，OD260/OD280為2.23，OD260/OD230為1.07，說(shuō)明被較多的蛋白、多糖和酚類(lèi)物質(zhì)污染。由圖8也可看出，不用苯酚抽提時(shí)，提取DNA條帶最亮，但有明顯拖帶，而用苯酚抽提過(guò)1次或2次的DNA條帶表現(xiàn)較集中，拖尾少。因此，從實(shí)際操作和成本綜合考慮出發(fā)，DNA最佳抽提方式為先用苯酚/氯仿/異戊醇抽提1次，再用氯仿/異戊醇抽提1次。

2. 5 優(yōu)化后的改良CTAB法提取DNA質(zhì)量驗(yàn)證結(jié)果

以優(yōu)化后的改良CTAB法提取甜瓜半粒干種子DNA，以此為模板進(jìn)行SSR分子標(biāo)記分析，結(jié)果如圖9所示。電泳條帶穩(wěn)定、清晰、基本無(wú)雜帶，可清楚區(qū)分品種間的差異，表明從優(yōu)化后的改良CTAB法提取甜瓜半粒干種子DNA中能擴(kuò)增得到穩(wěn)定的譜帶，完全滿足SSR分子標(biāo)記分析的要求。

3 討論

前人研究多以甜瓜幼苗、子葉、嫩葉等為材料提取基因組DNA（陳金體和王曉峰，2007;馬海財(cái)?shù)龋?010;李超等，2017）。本研究以半粒干種子為材料提取甜瓜基因組DNA，結(jié)果表明，改良CTAB法的提取效果優(yōu)于SDS法、高鹽低pH法和尿素法，與李菊芬等（2008a）研究認(rèn)為尿素法提取甜瓜種子DNA最佳的結(jié)論不一致。本研究中，改良CTAB法和尿素法均能提取獲得較好的DNA，但尿素法提取的DNA被苯酚、多糖和小分子雜質(zhì)污染，且DNA提取率相對(duì)較低。目前，CTAB法已廣泛應(yīng)用于提取大豆（姚丹等，2009）、水稻（李炫麗等，2011;王惠等，2013）、小麥（丁海燕和丁晨，2016）、玉米（董永軍，2017）等作物種子DNA，提取效果較好。

本研究通過(guò)分析改良CTAB法中CTAB提取液濃度對(duì)DNA提取效果的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CTAB提取液濃度不宜過(guò)高，否則會(huì)明顯影響DNA的質(zhì)量，與姚丹等（2009）的研究結(jié)論一致，其原因可能是CTAB具有較強(qiáng)去污能力，其溶解細(xì)胞膜后結(jié)合核酸，并與蛋白和多聚糖形成復(fù)合物，使核酸更容易分離，但若樣品量較少，過(guò)高濃度的CTAB不易去污，造成DNA提取質(zhì)量下降。因此，適宜的CTAB提取液濃度對(duì)提取高質(zhì)量的DNA非常重要。

DNA提取過(guò)程中水浴裂解時(shí)間對(duì)DNA的釋放至關(guān)重要，裂解時(shí)間過(guò)短，DNA釋放不完全導(dǎo)致難以獲得DNA;但時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)增加DNA降解的風(fēng)險(xiǎn)。本研究通過(guò)分析不同裂解時(shí)間對(duì)改良CTAB法DNA提取效果的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，裂解時(shí)間為20 min時(shí)DNA提取率最高，且DNA條帶清晰，無(wú)明顯的拖尾現(xiàn)象，說(shuō)明采用改良CTAB法提取甜瓜半粒干種子DNA時(shí)，最佳裂解時(shí)間為20 min，比以甜瓜幼苗、子葉、嫩葉等為材料的裂解時(shí)間短（陳金體和王曉峰，2007;馬海財(cái)?shù)龋?010;李超等，2017），其原因可能是本研究以半粒干種子為材料提取的DNA較少，所以所需的時(shí)間較少。

本研究?jī)H初步優(yōu)化改良CTAB法提取甜瓜半粒干種子DNA的相關(guān)影響因素，為了保證后續(xù)甜瓜分子標(biāo)記分析的順利開(kāi)展，還應(yīng)根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)要求做進(jìn)一步改進(jìn)，有效提高DNA質(zhì)量，為甜瓜分子育種研究打下基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

優(yōu)化后的改良CTAB法提取甜瓜半粒干種子DNA效果較好，可滿足甜瓜種子分子標(biāo)記和遺傳多樣性分析等分子實(shí)驗(yàn)需求。

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（責(zé)任編輯 陳 燕）