馬曉楠 張玲 王娜偉 鄭舒月 趙賀杰 趙思婷 張妮 馬寧寧

摘要：單克隆抗體（mAbs）是一種復(fù)雜的大分子蛋白，存在不穩(wěn)定性現(xiàn)象。本文回顧了與單克隆抗體不穩(wěn)定性相關(guān)的機(jī)制以及影響其穩(wěn)定性的參數(shù)和條件（包括蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、濃度、溫度和光照等），然后提出了用于理化穩(wěn)定性和生物穩(wěn)定性研究的不同分析方法，為單抗類藥物在臨床使用中達(dá)到更穩(wěn)定的效果提供了一定的實(shí)際指導(dǎo)意義。

關(guān)鍵詞：單克隆抗體;蛋白質(zhì);穩(wěn)定性研究

【中圖分類號】R-01【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A【文章編號】2107-2306（2019）05-148-02

1.前言

自從1986年第一種單克隆抗體藥物Muromonab通過FDA的批準(zhǔn)進(jìn)入市場以來，單抗已經(jīng)成為生物制藥領(lǐng)域中最重要的組成部分。單抗類藥物因其研發(fā)周期長、投入成本高，在專利期內(nèi)受到保護(hù)，一旦專利期到，就會有許多其他公司加入到開發(fā)和生產(chǎn)的行列中23。

治療性抗體在利用CHO等哺乳動物細(xì)胞進(jìn)行生產(chǎn)的過程中由于多種參數(shù)可能出現(xiàn)的變化，最終也可能引起重組蛋白的改變，如無法使用完全相同的細(xì)胞株克隆，培養(yǎng)條件和使用輔料的變化、長期培養(yǎng)過程中細(xì)胞株遺傳信息的不穩(wěn)定性等，再加上抗體這樣的復(fù)雜蛋白不可避免地具有微異質(zhì)性和不同的翻譯后修飾，都使得要對蛋白穩(wěn)定性進(jìn)行評估成為一個(gè)復(fù)雜的過程。

本文首先描述了影響單克隆抗體穩(wěn)定性的相關(guān)機(jī)制與因素，然后列出了用于研究穩(wěn)定性的不同分析方法，旨在為單克隆抗體的生產(chǎn)與臨床應(yīng)用提供具有實(shí)際指導(dǎo)意義的信息。

2.單抗的不穩(wěn)定性機(jī)制

蛋白質(zhì)降解可能由多種不同機(jī)制引起，通常分為化學(xué)不穩(wěn)定性和物理不穩(wěn)定性。這些不穩(wěn)定性并非單獨(dú)存在，而是緊密關(guān)聯(lián)——化學(xué)反應(yīng)可能導(dǎo)致物理不穩(wěn)定性，而物理不穩(wěn)定性也會縮小能相互作用的殘基之間的距離，進(jìn)而影響其化學(xué)性質(zhì)。

2.1化學(xué)不穩(wěn)定性

氧化，如二硫鍵的形成，是發(fā)生在抗體分子中最常見的化學(xué)反應(yīng)之一。它既可以由氧化劑（如過氧化物、光或金屬）的存在導(dǎo)致，也可以自發(fā)產(chǎn)生。有一些殘基很容易被氧化，包括蛋氨酸、組氨酸和半胱氨酸殘基，二硫鍵的形成就是半胱氨酸氧化的結(jié)果之一。

蛋白質(zhì)的另一個(gè)主要化學(xué)降解過程是脫酰胺化（天冬酰胺與谷氨酰胺）18。當(dāng)該過程發(fā)生在天冬酰胺時(shí)，琥珀酰亞胺中間體能夠自發(fā)水解生成天冬氨酸或異天冬氨酸5。單克隆抗體也可能在二硫鍵或肽鏈上發(fā)生裂解。二硫鍵斷裂可導(dǎo)致抗體的片段化（如單鏈抗體）。肽鍵的斷裂可由酶或非酶機(jī)制引發(fā)并形成不同性質(zhì)和大小的低分子量片段，鉸鏈區(qū)域也很容易發(fā)生切割13。

單克隆抗體化學(xué)修飾的影響在很大程度上取決于修飾發(fā)生的位置7。例如，F(xiàn)c片段中的脫酰胺作用可能影響很小，而如果位于Fab片段的CDR中，則可能導(dǎo)致結(jié)合親和力和單抗效力的降低7。氧化也可能產(chǎn)生同樣的結(jié)果，如果位于Fc片段，可能降低與FcRn和巨噬細(xì)胞的結(jié)合親和力2。此外，一些研究表明，化學(xué)不穩(wěn)定性會導(dǎo)致構(gòu)象的改變和聚集12。例如Burkitt等人的研究顯示，蛋氨酸氧化易使二級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性降低3。

2.2物理不穩(wěn)定

蛋白質(zhì)的變性是指蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)通過去折疊而喪失。這既可能是由于先前描述的化學(xué)不穩(wěn)定性，也可能由環(huán)境條件，如極端溫度或pH值造成。聚集是主要的物理不穩(wěn)定性10，由最初的天然蛋白質(zhì)組裝成高分子量多聚體。聚集體由弱的非特異性鍵（范德華力、氫鍵、疏水性和靜電相互作用）組成，一級結(jié)構(gòu)并不發(fā)生變化16。結(jié)果可導(dǎo)致可溶性或不溶性沉淀聚合物的形成。聚集往往是不可逆的，特別是在后期，聚集物往往含有高水平的非天然構(gòu)象的蛋白質(zhì)6.。

3.穩(wěn)定性的影響因素

3.1蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)

蛋白質(zhì)的各級結(jié)構(gòu)都能對其穩(wěn)定性產(chǎn)生影響。氨基酸序列對決定蛋白質(zhì)是否容易聚集具有重要作用。例如，CDR的低等電點(diǎn)似乎通過增強(qiáng)單克隆抗體之間的靜電相互作用來促進(jìn)可溶性多聚體的形成，而CDR的高等電點(diǎn)則優(yōu)先導(dǎo)致不溶性聚集體的形成，特別是在與帶負(fù)電荷的表面接觸時(shí)8。

mAb序列和結(jié)構(gòu)的細(xì)微變化也會顯著影響其在不同壓力條件下的穩(wěn)定性。Pisupati等人在一項(xiàng)強(qiáng)制降解研究中比較了英夫利昔單抗（Remicade?）和其生物類似物（Remsima?）的性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)盡管產(chǎn)品的外形和制造工藝存在細(xì)微差異，但初級序列是影響穩(wěn)定性的主要因素19。此外，殘基上的黏附物（如聚糖），特別是易聚集的黏附物，可能會降低整個(gè)mAb的聚集趨勢17。三級結(jié)構(gòu)對聚集也有巨大的影響，這取決于展開的程度，因?yàn)橐恍┭芯勘砻鳎糠终归_的蛋白質(zhì)比天然和完全展開的蛋白質(zhì)更容易發(fā)生聚集6。

3.2蛋白質(zhì)濃度

高蛋白濃度已被證明會影響聚集。較高的蛋白質(zhì)濃度似乎也會增加溶液的黏度，而溶液本身可能通過增強(qiáng)蛋白質(zhì)之間的相互作用和自我結(jié)合來增加蛋白質(zhì)的聚集潛能21，22。考慮到皮下給藥需要高濃度的單克隆抗體，這種依賴濃度的聚集趨勢是一個(gè)被日益關(guān)注的問題。

3.3溫度

高溫可以擾亂天然蛋白質(zhì)的構(gòu)象，促進(jìn)聚集現(xiàn)象的出現(xiàn)，提高蛋白質(zhì)的聚合速率6，甚至導(dǎo)致不可逆的構(gòu)象變化16。

低溫可能引起蛋白質(zhì)變性，特別是在冷凍和凍融循環(huán)過程中，這與多種壓力因素（結(jié)晶導(dǎo)致的緩沖液pH值下降、溶質(zhì)分子低溫濃縮、水冰界面形成等）的組合有關(guān)，從而影響蛋白質(zhì)的膠體和構(gòu)象穩(wěn)定性14。

3.4光

mAb藥物在制備過程中的許多階段都會暴露在光下。例如，生產(chǎn)過程中，通常用柱層析法純化，然后（短暫地）暴露于檢測器的紫外線下，在儲存和患者給藥期間是其主要暴露于光的階段。蛋白質(zhì)，尤其是它們的芳香殘基，對光非常敏感，通過光氧化和氧自由基的形成誘導(dǎo)光降解，或者出現(xiàn)斷裂和交聯(lián)11。含有大量芳香殘基（尤其是色氨酸殘基）的抗體對這種現(xiàn)象特別敏感，由此證實(shí)了紫外線比白光的影響更大。液體形式似乎也比凍干形式更敏感9。不僅是單抗，配方中的輔料也可能發(fā)生光降解。多聚物的光降解通過自發(fā)氧化作用發(fā)生，并可導(dǎo)致過氧化物的形成，從而加劇氧化過程4，15，。

4.單抗穩(wěn)定性的研究方法

單抗藥物的穩(wěn)定性是一個(gè)比小分子藥物更復(fù)雜的問題，不能僅僅根據(jù)穩(wěn)定的濃度或沒有降解產(chǎn)物來定義，還必須包括對不穩(wěn)定性臨界點(diǎn)的完整評估20。應(yīng)包括三個(gè)主要方面的評估：（1）物理穩(wěn)定性：研究聚合、分裂以及抗體結(jié)構(gòu);（2）化學(xué)穩(wěn)定性：檢測是否出現(xiàn)化學(xué)退化（如之前所述）;（3）生物穩(wěn)定性：證實(shí)單抗在達(dá)到其理化穩(wěn)定性時(shí)能夠保持其生物活性。這是一項(xiàng)具有挑戰(zhàn)性的工作，因?yàn)椴煌臏y定評估方法可能會導(dǎo)致不一致的結(jié)果，例如在聚合測定過程中由不同技術(shù)度量范圍導(dǎo)致的測量結(jié)果不同16。

ICH生物技術(shù)產(chǎn)品穩(wěn)定性評價(jià)指南給出了生物活性測定、分子實(shí)體分析和純度分析（降解產(chǎn)物定量檢測）。其他參數(shù)也應(yīng)監(jiān)測（例如視覺外觀、pH值等）。藥品評價(jià)應(yīng)至少對3個(gè)不同批次進(jìn)行20。歐洲已經(jīng)發(fā)表了關(guān)于抗癌藥物穩(wěn)定性研究的共識，特別是關(guān)于蛋白質(zhì)藥物，包括單克隆抗體1。為了研究物理不穩(wěn)定性，應(yīng)該使用幾種正交技術(shù)，至少包括比濁法和SEC，但也推薦其他技術(shù)，如圓二色譜。為了研究化學(xué)不穩(wěn)定性，至少使用3種分離技術(shù)，推薦使用離子交換色譜、SEC和肽圖分析。生物穩(wěn)定性應(yīng)采用免疫或細(xì)胞毒性測定法進(jìn)行評估，但僅作為一種補(bǔ)充試驗(yàn)，其結(jié)果不應(yīng)被視為總體穩(wěn)定性的自我證據(jù)，因?yàn)橄嗤纳锘钚圆⒉灰馕吨麄€(gè)結(jié)構(gòu)的完全一致1。

綜上所述，了解并建立對單抗藥物穩(wěn)定性評價(jià)的機(jī)制對于其在臨床使用中達(dá)到更穩(wěn)定的效果具有重要的實(shí)踐指導(dǎo)意義。

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