薛淑一 李明春 苗青 周煜

中圖分類號 R965；R735.7 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2019）05-0601-07

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.05.06

摘 要 目的：研究白頭翁皂苷B4（AB4）對肝癌細(xì)胞Huh-7及其荷瘤裸鼠腫瘤的抑制作用及機(jī)制。方法：將Huh-7細(xì)胞分為AB4給藥組、陰性對照組（等體積培養(yǎng)液）、陽性對照組（5-氟尿嘧啶50 μmol/L），運(yùn)用MTT法檢測0、3、6、12、25、50、100、200、400、800、 1 600 μmol/L AB4作用Huh-7細(xì)胞12、24、36、48 h的增殖抑制率，計(jì)算半數(shù)抑制濃度（IC50）；克隆形成試驗(yàn)評估50 μmol/L AB4作用Huh-7細(xì)胞24 h的克隆細(xì)胞數(shù)；膜聯(lián)蛋白Ⅴ-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶（Annexin Ⅴ-FITC/PI）染色檢測50 μmol/L AB4作用Huh-7細(xì)胞24 h的細(xì)胞凋亡率；Western blot法檢測50 μmol/L AB4作用Huh-7細(xì)胞24 h后B細(xì)胞淋巴瘤2（Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）、胱天蛋白酶3（Caspase-3）、活化胱天蛋白酶3（Cleaved Caspase-3）、活化多腺苷二磷酸核糖聚合酶（Cleaved PARP）等凋亡蛋白的表達(dá)。將荷瘤裸鼠隨機(jī)分為陰性對照組（生理鹽水）、陽性對照組（5-氟尿嘧啶50 mg/kg）和AB4低、中、高劑量組（25、50、100 mg/kg），每組3只，每天腹腔注射相應(yīng)藥物1次，連續(xù)19 d，觀察裸鼠腫瘤生長情況，計(jì)算抑瘤率；蘇木精-伊紅（HE）染色觀察腫瘤細(xì)胞形態(tài)變化。結(jié)果：AB4對Huh-7細(xì)胞的增殖抑制率隨給藥濃度的增加而增加，但50 μmol/L后增加不明顯，隨作用時間的延長而增加，但作用24 h后增加不明顯，AB4的IC50為（56.76±1.756） μmol/L。與陰性對照組比較，50 μmol/L AB4作用Huh-7細(xì)胞24 h的克隆細(xì)胞數(shù)明顯減少、Bcl-2蛋白表達(dá)明顯減弱（P<0.05），細(xì)胞凋亡率和Bax、Caspase-3、Cleaved Caspase-3、Cleaved PARP蛋白表達(dá)均明顯增加（P<0.05或P<0.01），且與陽性對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與陰性對照組比較，AB4低、中、高劑量組和陽性對照組荷瘤裸鼠的瘤體積明顯減小（P<0.05），腫瘤細(xì)胞輪廓逐漸模糊，出現(xiàn)核固縮、核質(zhì)不清晰、核碎裂現(xiàn)象，其抑瘤率分別為25.93%、39.15%、46.26%、42.83%。結(jié)論：AB4對Huh-7細(xì)胞及其荷瘤裸鼠均有抑制作用，其機(jī)制可能與上調(diào)Bax/Bcl-2比例、活化Caspase-3、裂解PARP、誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡有關(guān)。

關(guān)鍵詞 白頭翁皂苷B4；肝癌細(xì)胞Huh-7；荷瘤裸鼠；抑制作用；機(jī)制

Inhibitory Effects and Mechanism of Anemoside B4 on Hepatocellular Carcinoma Huh-7 Cells and Tumor- bearing Nude Mice

XUE Shuyi1，2，LI Mingchun2，MIAO Qing2，ZHOU Yu2，3（1.Dept. of Pharmacology， School of Pharmacy， Qingdao University， Shandong Qingdao 266021， China；2.Dept. of Pharmacy， No. 971 Hospital of the Navy of PLA， Shandong Qingdao 266071， China；3.College of Pharmacy， Dalian Medical University， Liaoning Dalian 116044， China）

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the anti-tumor effect of anemoside B4 （AB4） on hepatocellular carcinoma Huh-7 and tumor-bearing nude mice and its mechanism. METHODS： Huh-7 cells were divided into AB4 treatment group， negative control group （constant volume of culture medium） and positive control group （5-fluorouracil 50 μmol/L）. The inhibitory rate of Huh-7 cell proliferation was tested by MTT after treated with 0， 3， 6， 12， 25， 50， 100， 200， 400， 800， 1 600 μmol/L AB4 for 12， 24， 36， 48 h； IC50 were calculated. The number of clone cells was evaluated by clone formation tests after Huh-7 cells were treated with 50 μmol/L AB4 for 24 h. The apoptosis rate of Huh-7 cells was tested by Annexin Ⅴ-FITC/PI double staining after treated with 50 μmol/L AB4 for 24 h. The expression of apoptotic proteins such as Bcl-2， Bax， Caspase-3， Cleaved Caspase-3 and Cleaved PARP were tested by Western blot after Huh-7 cells were treated with 50 μmol/L AB4 for 24 h. Tumor-bearing nude mice were randomly divided into negative control group （normal saline）， positive control group （5-fluorouracil 50 mg/kg）， AB4 lwo-dose， medium-dose and high-dose groups （25， 50， 100 mg/kg）， with 3 mice in each group. They were given relevant medicine intraperitoneally， once a day， for consecutive 19 d. The growth of tumor was observed， and anti-tumor rate was also calculated. HE staining was used to observe the morphology of tumor cells. RESULTS： The inhibition rate of AB4 on Huh-7 cell proliferation increased with the increase of concentration of AB4， but it did not increase significantly after reaching 50 μmol/L； it increased with the increase of time， but it did not increase significantly after 24 h. The IC50 of AB4 was （56.76±1.756） μmol/L. Compared with negative control group， the number of clone cells was decreased significantly after Huh-7 cells were treated with 50 μmol/L AB4 for 24 h， while the protein expression of Bcl-2 was decreased significantly （P<0.05）； the apoptotic rate， the protein expression of Bax， Caspase-3， Cleaved Caspase-3 and Cleaved PARP were increased significantly （P<0.05 or P<0.01）， there was no statistical significance， compared with positive control group. Compared with negative control group， the volume of tumor was decreased significantly in AB4 low-dose， medium-dose and high-dose groups， positive control group （P<0.05）； the outline of tumor cells become more and more blurred； there were nuclear pyknosis， unclear nucleoplasm and nuclear fragmentation； its anti-tumor rates were 25.93%， 39.15%， 46.26%， 42.83%， respectively. CONCLUSIONS： AB4 inhibits Huh-7 cells and tumor-bearing mice， the mechanism of which may be associated with up-regulating the proportion of Bax/Bcl-2， activating Caspase-3， cracking PARP and inducing apoptosis.

KEYWORDS Anemoside B4； Hepatocellular carcinoma Huh-7； Tumor-bearing nude mice； Inhibitory effect； Mechanism

肝癌是常見的惡性腫瘤，發(fā)病率位于世界總癌癥的第6位，病死率位于第4位，是導(dǎo)致男性死亡的第二大癌癥[1]。導(dǎo)致肝癌發(fā)生的危險因素主要包括以乙型、丙型肝炎病毒為代表的病毒因素；遺傳、變質(zhì)食物中的黃曲霉毒素、水質(zhì)污染導(dǎo)致泛濫的藍(lán)綠藻類毒素、過度吸煙飲酒、非酒精性脂肪肝等非病毒因素[2]。中國是肝癌高發(fā)地區(qū)，尤其是乙肝導(dǎo)致的肝癌[1]。目前索拉菲尼是美國FDA唯一批準(zhǔn)的晚期肝細(xì)胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）治療的藥物[3]，一旦耐藥，就沒有其他標(biāo)準(zhǔn)治療方案適用[4]。為此，尋找能夠治療肝癌的新的化學(xué)結(jié)構(gòu)實(shí)體并研究其作用機(jī)制尤為重要。白頭翁皂苷B4（Anemoside B4，AB4）來源于毛茛科的植物白頭翁，傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)記載，白頭翁有清熱解毒、涼血止痢的功效[5]，其主要成分為三萜皂苷、三萜酸、胡蘿卜苷、木脂素等[6]。白頭翁皂苷（Pulsatilla chinensis saponin）作為一種三萜皂苷，具有抗腫瘤活性，中國民間有應(yīng)用其治療乙肝的實(shí)例[7]。而單體AB4是白頭翁皂苷的主要活性成分，但其抗癌活性與機(jī)制尚不清楚。因此，本研究擬從體內(nèi)和體外探究AB4對肝癌細(xì)胞Huh-7的潛在抑制作用，并初步探討其分子機(jī)制，以期為AB4更好地開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

YXQ-LS-50A型全自動立式電熱壓力蒸汽滅菌器（上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司）；CB型CO2培養(yǎng)箱（德國Binder公司）；XDS-1B型顯微鏡（上海光學(xué)儀器廠）；SW-CJ-2F型超凈工作臺（上海蘇凈實(shí)業(yè)有限公司）；HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州億通分析儀器制造有限公司）；TGL16型離心機(jī)（長沙英泰儀器有限公司）；ELx800型酶標(biāo)儀（美國Bio-Tek公司）；Accuri C6型流式細(xì)胞儀（美國BD公司）；910型凝膠成像系統(tǒng)（上海山富科學(xué)儀器公司）；Mini-Protean Tetra型垂直電泳槽（美國Bio-Rad公司）；WH-1型微型旋渦混合儀（上海滬西分析儀器廠）。

1.2 藥品與試劑

AB4（上海愛必信生物科技有限公司，批號：wkq16032901，純度：98%）；5-氟尿嘧啶（5-FU，北京索萊寶科技有限公司，批號：F8301，純度：98.0%～102.0%）；DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、青霉素/鏈霉素雙抗（美國Hyclone公司，批號：AD16191267、J170046、J170042）；胎牛血清（澳大利亞AusGeneX公司，批號：FBSSA01016-2）；Matrigel膠（美國BD公司，批號：356234）；B細(xì)胞淋巴瘤2（Bcl-2）兔單克隆抗體、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）兔多克隆抗體、胱天蛋白酶3（Caspase-3）兔多克隆抗體、活化多腺苷二磷酸核糖聚合酶（Cleaved PARP）兔多克隆抗體、β-肌動蛋白（β-actin）兔單克隆抗體、辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）（美國CST公司，批號：3498、2772、9662、5625、8457、7074）；四甲基偶氮唑鹽（MTT）試劑盒、膜聯(lián)蛋白Ⅴ-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶（Annexin Ⅴ-FITC/PI）細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號：C0009、C1062、C0105）；HRP底物化學(xué)發(fā)光液（美國Millipore公司，批號：1702302）。

1.3 細(xì)胞

人肝癌細(xì)胞Huh-7購自中國科學(xué)院典藏培養(yǎng)物保藏委員會上海細(xì)胞庫。

1.4 動物

BALB/c裸鼠，SPF級，♂，4 周齡（28～34 d），體質(zhì)量 15～18 g，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2016-0006；將裸鼠置于22～26 ℃、濕度40%～60%的環(huán)境中，自由攝食與飲水，籠具等均經(jīng)高壓滅菌處理后使用，保持墊料干燥清潔，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后用于實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)遵守實(shí)驗(yàn)動物福利與倫理原則，經(jīng)解放軍海軍第九七一醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，編號為401LL-2017010。

2 方法與結(jié)果

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將Huh-7細(xì)胞置于含有10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素雙抗溶液的DMEM培養(yǎng)基中，于37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2～3 d傳代，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。

2.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以 x±s表示，多組間比較采用單因素和雙因素方差分析，組間兩兩比較采用Dunnett’s t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 MTT試驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖抑制率

收集對數(shù)生長期的Huh-7細(xì)胞，用0.25%的胰酶消化，調(diào)整細(xì)胞懸液的濃度至5×104 mL-1，以每孔5 000 個/200 μL的接種量接種于96孔板，放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁融合至70%～80%，加入磷酸鹽緩沖液（PBS）配制的AB4（終濃度分別為0、3、6、12、25、50、100、200、400、800、1 600 μmol/L），同時設(shè)置空白對照組（無細(xì)胞）、陽性對照組（50 μmol/L 5-FU），每組3個復(fù)孔。藥物與細(xì)胞作用12、24、36、48 h后，每孔加入 5 mg/mL的MTT溶液10 μL，繼續(xù)孵育4 h，加入100 μL Formazan溶解液，混勻后孵育4 h，光學(xué)顯微鏡下觀察紫色結(jié)晶全部溶解，用酶標(biāo)儀在570 nm波長處測定吸光度（A），試驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率[細(xì)胞增殖抑制率（%）=（ 1-A給藥組/A陰性對照組）×100%]和半數(shù)抑制濃度（IC50）。不同濃度AB4對Huh-7細(xì)胞增殖抑制率的影響見圖1，AB4作用不同時間對Huh-7細(xì)胞增殖抑制率的影響見圖2。

由圖1可知，與AB4 0 μmol/L比較，AB4 6～1 600 μmol/L作用12、24、36、48 h對Huh-7細(xì)胞增殖均有抑制作用（P<0.05或P<0.01），其增殖抑制率均隨AB4給藥濃度的增加而增加，6～50 μmol/L濃度間增加幅度較大，50～1 600 μmol/L濃度間細(xì)胞抑制率增加幅度減小。其中50 μmol/L AB4的細(xì)胞增殖抑制率與陽性對照組最接近。因此后續(xù)試驗(yàn)中AB4的給藥濃度均定為50 μmol/L。

由圖2可知，AB4對Huh-7細(xì)胞的增殖抑制率隨作用時間的延長而增加，作用24 h后增殖抑制率的增加幅度減緩，因此后續(xù)試驗(yàn)作用時間定為24 h。根據(jù)以上結(jié)果，計(jì)算50 μmol/L AB4作用24 h對Huh-7細(xì)胞的IC50為（56.76±1.756） μmol/L。

2.4 克隆形成試驗(yàn)評估AB4的長期抑制效果

將Huh-7細(xì)胞以2.5×106個/孔的密度接種在6孔板中，37 ℃下孵育24 h，加入50 μmol/L的AB4（AB4組），同時設(shè)置陰性對照組（等體積培養(yǎng)液）、陽性對照組（50 μmol/L 5-FU），作用24 h后，臺盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，以每孔 1 000個細(xì)胞重新鋪板到6孔板中，孵育14 d，用冷PBS洗滌2次，4%多聚甲醛固定20 min，0.1%結(jié)晶紫染色20 min后流水清洗染色液，放置空氣中干燥，肉眼計(jì)數(shù)。結(jié)果顯示，與陰性對照組比較，AB4組和陽性對照組均能夠顯著抑制Huh-7細(xì)胞的克隆形成，AB4的抑制效果與 5-FU無明顯差異。各組細(xì)胞的克隆形成圖見圖3。

2.5 Annexin Ⅴ-FITC/PI染色評估細(xì)胞凋亡率

收集對數(shù)生長期的Huh-7細(xì)胞，以2.5×105個/孔接種到24孔板中，37 ℃、5% CO2孵育過夜后，加入50 μmol/L的AB4（AB4組），同時設(shè)置陰性對照組（等體積培養(yǎng)液）、陽性對照組（50 μmol/L 5-FU），作用24 h后，PBS清洗2次，以1×106 mL-1重懸至結(jié)合緩沖液（Binding buffer），加入Annexin Ⅴ-FITC和PI混勻，室溫避光孵育10～30 min，隨后置于冰浴中，上流式細(xì)胞儀檢測，試驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算細(xì)胞凋亡率（凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%）。結(jié)果顯示，陰性對照組、AB4組、陽性對照組的細(xì)胞凋亡率分別為2.99%、68.63%、64.94%。與陰性對照組比較，AB4組和陽性對照組的細(xì)胞凋亡率明顯增加（P<0.01），AB4組與陽性對照組的細(xì)胞凋亡率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。這表明AB4可顯著提高Huh-7細(xì)胞凋亡率。各組細(xì)胞凋亡的分布圖見圖4。

2.6 Western blot法檢測Bcl-2、Bax、Caspase-3、Cleaved Caspase-3、Cleaved PARP蛋白表達(dá)水平

將Huh-7細(xì)胞接種于6孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁融合至70%～80%，加入50 μmol/L的AB4（AB4組），同時設(shè)置陰性對照組（等體積培養(yǎng)液）、陽性對照組（50 μmol/L 5-FU），作用24 h，用細(xì)胞裂解液裂解各組細(xì)胞獲得細(xì)胞總蛋白，BCA試劑盒測定總蛋白含量，100 ℃下5 min蛋白變性后，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳，濕轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2兔單克隆抗體、Bax兔多克隆抗體、Caspase-3兔多克隆抗體、Cleaved PARP兔多克隆抗體、β-actin兔單克隆抗體（稀釋比例均為1 ∶ 1 000），4 ℃孵育過夜。隔日加入HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG（稀釋比例為1 ∶ 1 000），室溫孵育1 h，將增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光（ECL）顯色劑覆蓋于膜的蛋白面，于化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀中顯影拍照，用Image J對蛋白條帶進(jìn)行分析，以目標(biāo)蛋白灰度值與β-actin蛋白灰度值的比值評價目標(biāo)蛋白的表達(dá)量，將陰性對照組各蛋白相對表達(dá)量設(shè)為“1”，評價其他組各蛋白的相對表達(dá)量，試驗(yàn)重復(fù)3次。各組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的電泳圖見圖5，測定結(jié)果見圖6。

由圖6可知，與陰性對照組比較，AB4組和陽性對照組細(xì)胞中Bcl-2蛋白相對表達(dá)量明顯降低（P<0.05），Bax、Caspase-3、Cleaved Caspase-3、Cleaved PARP蛋白相對表達(dá)量均明顯增加（P<0.05或P<0.01），且AB4組與陽性對照組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。由此表明，AB4抑制肝癌細(xì)胞增殖的作用可能與細(xì)胞凋亡有關(guān)。

2.7 荷瘤裸鼠的抑瘤作用檢測

收集對數(shù)生長期的Huh-7細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min后重懸于PBS中，與Matrigel膠等體積混合，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107 mL-1，皮下注射于裸鼠右側(cè)腋下部位，接種量為0.2 mL，5 d后，裸鼠右上肢腋下觀察有黃豆大小腫瘤生成（體積約為20～40 mm3），即為造模成功。隨后，用游標(biāo)卡尺測量腫瘤長徑與短徑，計(jì)算瘤體積=（長×寬2）/2。待裸鼠瘤體積長至100～150 mm3，將荷瘤裸鼠隨機(jī)分為陰性對照組（生理鹽水）、陽性對照組（50 mg/kg 5-FU）和AB4低、中、高劑量組（25、50、100 mg/kg），每組3只，按預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)置給藥劑量，每日腹腔注射相應(yīng)藥物1次，給藥體積均為10 mL/kg，連續(xù)給藥19 d。從第1次腹腔注射藥物開始，每隔1 d測量1次腫瘤的長徑與短徑，并計(jì)算瘤體積。末次給藥后處死裸鼠，剝離腫瘤，稱體質(zhì)量，計(jì)算抑瘤率，同時將腫瘤組織放入10%甲醛中固定待用。抑瘤率（%）=（1-給藥組瘤質(zhì)量/陰性對照組瘤質(zhì)量）×100%。結(jié)果顯示，注射藥物19 d后，荷瘤裸鼠無中毒癥狀，體質(zhì)量無明顯差異（P>0.05）。與陰性對照組比較，AB4低、中、高劑量組和陽性對照組荷瘤裸鼠瘤體積明顯減小（P<0.05或P<0.01），第19天的瘤體積分別減小了24.18%、33.31%、43.20%、37.57%；抑瘤率分別為25.93%、39.15%、46.26%、42.83%。不同給藥時間后各組荷瘤裸鼠瘤體積的變化曲線見圖7。

2.8 腫瘤組織病理學(xué)檢查

將固定在10%甲醛中的腫瘤組織進(jìn)行脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、貼片等步驟后，進(jìn)行HE染色并封片，光鏡下觀察腫瘤組織結(jié)構(gòu)的改變。病理切片顯示，陰性對照組細(xì)胞核大小較均一，無明顯的形態(tài)學(xué)改變；AB4低、中、高劑量組和陽性對照組腫瘤組織細(xì)胞輪廓模糊，細(xì)胞邊界不清晰，形狀不規(guī)則，大小不一，出現(xiàn)核固縮、核質(zhì)不清晰、核碎裂等現(xiàn)象，上述現(xiàn)象隨AB4劑量的增加越明顯。各組荷瘤裸鼠腫瘤細(xì)胞的形態(tài)圖見圖8。

3 討論

原發(fā)性肝癌包括HCC、肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌（Intrahepatic cholangi-Ocarcinoma，ICC）和混合性肝細(xì)胞膽管癌（Combined hepatocellular-cholangiocarcinoma，CHC）[8]，其中最常見的為HCC。當(dāng)前對肝癌的治療方法主要有手術(shù)治療[9]、放射治療[10]、化學(xué)[11]及生物治療[12]等，盡管我國一直致力于對肝癌的研究，并在肝癌的檢測和治療方面取得進(jìn)展，但由于肝癌發(fā)病機(jī)制復(fù)雜、早期診斷困難、治療水平限制及腫瘤進(jìn)展迅速且易轉(zhuǎn)移等，導(dǎo)致患者復(fù)發(fā)率高、預(yù)后較差[13]。關(guān)于肝癌的藥物治療現(xiàn)況，目前主要是化療藥物與小分子靶向藥物及之間的聯(lián)合用藥。化療藥物毒性強(qiáng)、特異性差，在殺死癌細(xì)胞時，往往正常細(xì)胞也會“受災(zāi)”；小分子靶向藥物特異性強(qiáng)、毒性小，但是仍存在耐藥問題。這主要是因?yàn)榧?xì)胞信號通路非常復(fù)雜，抑制一種信號通路，很可能會使其他信號通路產(chǎn)生代償性改變。

Bax和Bcl-2是參與Caspase依賴性細(xì)胞凋亡過程中的相關(guān)蛋白，Bax作為促凋亡蛋白，Bcl-2作為抑凋亡蛋白，共同調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡過程[14-15]。Bax可單獨(dú)形成同源二聚體，促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生凋亡；也可以與Bcl-2一起形成異同源二聚體，抑制細(xì)胞發(fā)生凋亡，同源二聚體的穩(wěn)定性小于異同源二聚體[16]。研究發(fā)現(xiàn)，Bcl-2和Bax的比例關(guān)系對于細(xì)胞凋亡至關(guān)重要[17]，降低抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白水平的表達(dá)，增強(qiáng)促凋亡蛋白Bax蛋白水平的表達(dá)，從而使Bax/Bcl-2比例升高，可促使細(xì)胞發(fā)生凋亡。另外，Caspase家族是細(xì)胞凋亡過程中重要的半胱氨酸蛋白酶，其中Caspase-3蛋白酶是凋亡級聯(lián)反應(yīng)中的主要角色。Bcl-2是通過抑制細(xì)胞色素C釋放[18]，從而抑制Caspase家族相關(guān)蛋白酶激活，阻止細(xì)胞凋亡發(fā)生；相反，作為線粒體膜的離子通道成分的Bax能促使細(xì)胞色素C釋放入線粒體，激活Caspase家族，活化Caspase-3，裂解PARP[19]，使其失去生物活性，損傷核內(nèi)DNA，引發(fā)細(xì)胞凋亡發(fā)生[17]。本研究初步發(fā)現(xiàn)，AB4可能通過下調(diào)Bcl-2，上調(diào)Bax，增大Bax/Bcl-2比例，激活Caspase家族，活化Caspase-3，作用于PARP，進(jìn)而促使肝癌細(xì)胞發(fā)生凋亡，從而發(fā)揮抗腫瘤作用，其誘導(dǎo)凋亡的具體關(guān)系機(jī)制則需進(jìn)一步研究。

本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AB4作為白頭翁皂苷的主要活性成分，具有抗肝癌活性。先前研究表明，從P. chinensis saponins中提取的其他活性化合物也具有抗腫瘤活性，如白頭翁皂苷A（PSA）、白頭翁皂苷D（PSD）及23-羥基白樺酸（23-HBA）。PSA通過誘導(dǎo)DNA損傷，調(diào)節(jié)p53、細(xì)胞周期蛋白B（Cyclin B）和Bcl-2蛋白表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡[20]。PSD的分離物SB365能通過抑制Akt、mTOR和p70S6K的磷酸化，調(diào)節(jié)PI3K/Akt/mTOR通路抑制細(xì)胞生長和血管生成[21]，該通路在細(xì)胞凋亡方面占據(jù)重要地位[22]。23-HBA的衍生物B4G2則能增強(qiáng)活性氧介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)鈣積累，刺激線粒體Ca2+滲透性轉(zhuǎn)換孔開放，導(dǎo)致線粒體形態(tài)改變，引發(fā)線粒體依賴的細(xì)胞凋亡，抑制肝癌細(xì)胞增殖[23]。因此，可嘗試采用AB4聯(lián)合白頭翁皂苷其他活性成分，通過作用不同的通路共同誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生凋亡，產(chǎn)生協(xié)同作用。另外，白頭翁皂苷提取的活性產(chǎn)物還能與化療藥物聯(lián)合用藥。研究表明，SB365能協(xié)同化療藥物增強(qiáng)對宮頸癌細(xì)胞HeLa的敏感性，增強(qiáng)其抗癌活性[24]； 23-HBA與阿霉素有協(xié)同抗癌作用[25]，若將AB4與化療藥物聯(lián)用，也會為化療藥物聯(lián)合用藥多提供了一種選擇。這表明AB4未來可能是一種很有價值的抗癌藥。

當(dāng)前，來源于植物的天然產(chǎn)物已在臨床上有廣泛的應(yīng)用，是目前的研究熱點(diǎn)，特別是應(yīng)用于臨床無法治愈的惡性腫瘤，因此，AB4具有良好的開發(fā)應(yīng)用前景。本研究率先證明AB4能夠抑制肝癌細(xì)胞Huh-7的增殖，抑制肝癌裸鼠異種移植模型腫瘤的生長，并初步探索了其誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制，這為AB4將來在臨床上可能作為一種小分子靶向藥物的輔助治療藥物提供了依據(jù)。下一步實(shí)驗(yàn)可補(bǔ)充AB4對肝癌的藥效學(xué)及機(jī)制研究，全面進(jìn)行AB4的藥物代謝、生物毒性、穩(wěn)定劑型的研究，以期研發(fā)一種治療效果好、副作用小、質(zhì)量穩(wěn)定的中藥新制劑。

參考文獻(xiàn)

[ 1 ] BRAY F，F(xiàn)ERLAY J，SOERJOMATARAM I，et al. Global cancer statistics 2018：GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries[J]. CA Cancer J Clin，2018，68（6）：394-424.

[ 2 ] RAWLA P，SUNKARA T，MURALIDHARAN P，et al. Update in global trends and aetiology of hepatocellular carcinoma[J]. Contemp Oncol （Pozn），2018，22（3）：141- 150.

[ 3 ] BRUIX J，RAOUL JL，SHERMAN M，et al. Efficacy and safety of sorafenib in patients with advanced hepatocellular carcinoma：subanalyses of a phase Ⅲ trial[J]. J Hepatol，2012，57（4）：821-829.

[ 4 ] BAHMAN AA，ABAZA MSI，KHOUSHIASH SI，et al. Sequence-dependent effect of sorafenib in combination with natural phenolic compounds on hepatic cancer cells and the possible mechanism of action[J]. Int J Mol Med，2018，42（3）：1695-1715.

[ 5 ] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S]. 2015年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：104.

[ 6 ] LI W，SUN YN，YAN XT，et al. Isolation of nematicidal triterpenoid saponins from Pulsatilla koreana root and their activities against Meloidogyne incognita[J]. Molecules，2013，18（5）：5306-5316.

[ 7 ] YAO D，LI H，GOU Y，et al. Betulinic acid-mediated inhibitory effect on hepatitis B virus by suppression of manganese superoxide dismutase expression[J]. Febs J，2009，276（9）：2599-2614.

[ 8 ] SIA D，VILLANUEVA A，F(xiàn)RIEDMAN SL，et al. Liver cancer cell of origin，molecular class，and effects on patient prognosis[J]. Gastroenterology，2017，152（4）：745- 761.

[ 9 ] LIU X，ZHOU J，ZHOU N，et al. SYNJ2BP inhibits tumor growth and metastasis by activating DLL4 pathway in hepatocellular carcinoma[J]. J Exp Clin Cancer Res，2016.DOI：10.1186/s13046-016-0385-0.

[10] CUI J，GONG Z，SHEN HM. The role of autophagy in liver cancer：molecular mechanisms and potential therapeutic targets[J]. Biochim Biophys Acta，2013，1836（1）：15- 26.

[11] KHAN M，LI T，AHMAD KHAN MK，et al. Alantolactone induces apoptosis in HepG2 cells through GSH depletion，inhibition of STAT3 activation，and mitochondrial dysfunction[J]. Biomed Res Int，2013.DOI：10.1155/2013/719858.

[12] ALLAIRE M，NAULT JC. Advances in management of hepatocellular carcinoma[J]. Curr Opin Oncol，2017，29（4）：288-295.

[13] ZHU JN，JIANG L，JIANG JH，et al. Hepatocyte nuclear factor-1beta enhances the stemness of hepatocellular carcinoma cells through activation of the notch pathway[J]. Sci Rep，2017.DOI：10.1038/s41598-017-04116-7.

[14] 郝軒軒，王新陸，崔琳，等.加參方浸膏對H2O2誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞凋亡的干預(yù)作用研究[J].中國藥房，2018，29（14）：1898-1903.

[15] MUKHOPADHYAY S，PANDA PK，SINHA N，et al. Autophagy and apoptosis：where do they meet？[J]. Apoptosis，2014，19（4）：555-566.

[16] POULIQUEN D，BELLOT G，GUIHARD G，et al. Mitochondrial membrane permeabilization produced by PTP，Bax and apoptosis：a 1H-NMR relaxation study[J]. Cell Death Differ，2006，13（2）：301-310.

[17] WANG Y，WANG H，GE H，et al. AG-1031 induced autophagic cell death and apoptosis in C6 glioma cells associated with notch-1 signaling pathway[J]. J Cell Biochem，2018，119（7）：5893-5903.

[18] KIRAZ Y，ADAN A，KARTAL YM，et al. Major apoptotic mechanisms and genes involved in apoptosis[J]. Tumour Biol，2016，37（7）：8471-8486.

[19] 王曉霞，劉天龍，劉晶，等.黃芪甲苷對D-半乳糖誘導(dǎo)原代培養(yǎng)心肌細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用及機(jī)制研究[J].中國藥房，2018，29（9）：1189-1193.

[20] LIU Q，CHEN W，JIAO Y，et al. Pulsatilla saponin A，an active molecule from Pulsatilla chinensis，induces cancer cell death and inhibits tumor growth in mouse xenograft models[J]. J Surg Res，2014，188（2）：387-395.

[21] HONG SW，JUNG KH，LEE HS，et al. SB365 inhibits angiogenesis and induces apoptosis of hepatocellular carcinoma through modulation of PI3K/Akt/mTOR signaling pathway[J]. Cancer Sci，2012，103（11）：1929-1937.

[22] 田龍夫，張琦，王波濤，等.血根堿通過調(diào)控PI3K/Akt信號通路誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2018，24（19）：166-171.

[23] YAO N，LI YJ，ZHANG DM，et al. B4G2 induces mitochondrial apoptosis by the ROS-mediated opening of Ca2+-dependent permeability transition pores[J]. Cell Phy- siol Biochem，2015，37（3）：838-852.

[24] ZHANG Y，BAO J，WANG K，et al. Pulsatilla saponin D inhibits autophagic flux and synergistically enhances the anticancer activity of chemotherapeutic agents against HeLa cells[J]. Am J Chin Med，2015，43（8）：1657-1670.

[25] ZHENG Y，ZHOU F，WU X，et al. 23-Hydroxybetulinic acid from Pulsatilla chinensis （Bunge） Regel synergizes the antitumor activities of doxorubicin in vitro and in vivo[J]. J Ethnopharmacol，2010，128（3）：615-622.

（收稿日期：2018-10-11 修回日期：2019-01-11）

（編輯：鄒麗娟）