南敏倫 赫玉芳 司學(xué)玲 趙昱瑋 王雪 白雪 李川晶

中圖分類(lèi)號(hào) R914.5；R965.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2019）05-0591-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.05.04

摘 要 目的：合成并鑒定救必應(yīng)酸酯類(lèi)衍生物，并評(píng)價(jià)其體外抗腫瘤活性。方法：以救必應(yīng)酸為原料，通過(guò)28位酯化、3β位和23位羥基與酸酐反應(yīng)合成救必應(yīng)酸酯類(lèi)衍生物；采用高分辨質(zhì)譜、核磁共振氫譜、核磁共振碳譜及理化性質(zhì)對(duì)合成的救必應(yīng)酸酯類(lèi)衍生物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。采用MTT法評(píng)價(jià)紫杉醇（陽(yáng)性對(duì)照）、救必應(yīng)酸及救必應(yīng)酸酯類(lèi)衍生物對(duì)人宮頸癌細(xì)胞HeLa、人惡性黑色素瘤細(xì)胞A375、人肺腺癌細(xì)胞SPC-A1、人肝癌細(xì)胞HepG2的體外抗腫瘤活性[以半數(shù)抑制濃度（IC50）為指標(biāo)]。結(jié)果：共合成了6個(gè)救必應(yīng)酸酯類(lèi)衍生物，分別為救必應(yīng)酸甲酯（化合物1）、3，23-O-雙（乙?；┚缺貞?yīng)酸甲酯（化合物2）、3，23-O-雙（丙?；┚缺貞?yīng)酸甲酯（化合物3）、3，23-O-雙（丁酰基）救必應(yīng)酸甲酯（化合物4）、3，23-O-雙（鄰苯二甲?；┚缺貞?yīng)酸甲酯（化合物5）及3，23-O-雙（丁二酰基）救必應(yīng)酸甲酯（化合物6）。與紫杉醇比較，化合物5和化合物6對(duì)HeLa、A375、HepG2、SPC-A1細(xì)胞的抗腫瘤活性與其相似，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），救必應(yīng)酸及其他化合物的IC50顯著減?。≒<0.05）。結(jié)論：本研究合成了6個(gè)救必應(yīng)酸酯類(lèi)衍生物，其中化合物5、6具有顯著的體外抗腫瘤活性，可為后續(xù)研究提供參考。

關(guān)鍵詞 救必應(yīng)酸；衍生物；合成；鑒定；抗腫瘤活性

Study on Synthesis and Identification of Rotundic Acid Esters Derivatives and in vitro Antitumor Activity

NAN Minlun1，HE Yufang1，2，SI Xueling3，ZHAO Yuwei4，WANG Xue1，5，BAI Xue1，5，LI Chuanjing1，5（1.Institute of Phytochemistry， Jilin Academy of Chinese Medicine Sciences， Changchun 130012， China；2.College of Management， Changchun University of TCM， Changchun 130117， China；3.Xiuzheng Pharmaceutical Group Changchun Hi-tech Pharmaceutical Co.， Ltd.， Changchun 130012， China；4.Jilin Jice Detective Technical Co.， Ltd.， Changchun 130117， China；5.College of Chinese Medicinal Materials， Jilin Agricultural University， Changchun 130118， China）

ABSTRACT OBJECTIVE： To synthesize and identify rotundic acid esters derivatives， and to evaluate in vitro antitumor activity. METHODS： Using rotundic acid as raw material， rotundic acid esters derivatives were synthesized by 28-esterification， 3β and 23-position hydroxyl group combined with acid anhydride. The structure of rotundic acid esters derivatives were identified by HRMS， 1H-NMR， 13C-NMR and physicochemical properties. The in vitro antitumor activities were evaluated by MTT assay against paclitaxel （positive control）， rotundic acid and rotundic acid esters derivatives with human cervical cancer cells HeLa， human malignant melanoma cells A375， human lung adenocarcinoma cells SPC-A1 and human liver cancer cells HepG2 （take IC50 as an indicator）. RESULTS： Totally 6 kinds of rotundic acid esters derivatives were synthesized， i.e. rotundic acid methyl ester（compound 1）， 3， 23-O-di（acetyl） rotundic acid methyl ester（compound 2）， 3， 23-O-di（propionyl） rotundic acid methyl ester（compound 3）， 3， 23-O-di（butyryl） rotundic acid methyl ester（compound 4）， 3， 23-O-di（phthaloyl） rotundic acid methyl ester（compound 5） and 3， 23-O-di（succinyl） rotundic acid methyl ester（compound 6）. Compared with paclitaxel， the antitumor activity of compound 5 and compound 6 to Hela， A375， HepG2 and SPC-A1 was similar to it， and there was no significant difference between them （P>0.05）； the IC50 of rotuntic acid and other compounds decreased with statistical significance （P<0.05）. CONCLUSIONS： In the study， 6 kinds of rotundic acid esters derivatives are synthesized and compound 5 and compound 6 have significant antitumor activity in vitro， which can provide reference for further study.

KEYWORDS Rotundic acid； Derivatives； Synthesis； Identification； Antitumor activity

救必應(yīng)酸（Rotundic acid）是一種五環(huán)三萜酸類(lèi)化合物，主要存在于冬青科冬青屬植物中，資源豐富[1]。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，救必應(yīng)酸具有降血脂[2]、抗腫瘤[3]、保護(hù)心腦血管[4]等藥理作用，尤其是抗腫瘤活性引起了廣大學(xué)者的關(guān)注。雖然救必應(yīng)酸具有一定的抗腫瘤活性，但其極性較小、溶解度較差、生物利用度較低，影響了其臨床應(yīng)用。為改善救必應(yīng)酸生物活性，國(guó)內(nèi)外學(xué)者針對(duì)其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，通過(guò)結(jié)構(gòu)修飾，得到了一系列溶解性好、生物活性強(qiáng)、療效更確切、毒性更低的化合物，如齊敦果酸[5]、熊果酸[6]、樺木酸[7]等。

根據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，在救必應(yīng)酸母體上引入親脂基團(tuán)，可提高其脂溶性，并增強(qiáng)其透過(guò)血腦屏障的能力，進(jìn)而提高其生物活性[8]。本課題組結(jié)合救必應(yīng)酸3β位、19α位、23位含有三個(gè)羥基，28位含有一個(gè)羧基的特點(diǎn)，對(duì)救必應(yīng)酸進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，然后以救必應(yīng)酸為母核，先合成救必應(yīng)酸甲酯，再與相應(yīng)的酸酐反應(yīng)生成救必應(yīng)酸酯類(lèi)衍生物，并對(duì)合成的救必應(yīng)酸類(lèi)衍生物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，然后評(píng)價(jià)救必應(yīng)酸及救必應(yīng)酸酯類(lèi)衍生物對(duì)人宮頸癌細(xì)胞HeLa、人惡性黑色素瘤細(xì)胞A375、人肺腺癌細(xì)胞SPC-A1、人肝癌細(xì)胞HepG2的體外抗腫瘤活性，為篩選活性更好的抗腫瘤藥物提供參考。

1 材料

1.1 儀器

超凈工作臺(tái)（青島中建凈化空調(diào)工程有限公司）；MPA100熔點(diǎn)測(cè)定儀[先鋒科技（香港）股份有限公司]；DD2 400-MR核磁共振波譜（NMR）儀（美國(guó)安捷倫公司）；ELEMENT GD電噴霧質(zhì)譜（ESI-MS）儀（美國(guó)賽默飛世爾科技公司）；ELX800酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Tek公司）；Ⅸ73倒置顯微鏡、DM-1解剖顯微鏡均購(gòu)自上海天放實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.2 藥品與試劑

救必應(yīng)酸（吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院植物化學(xué)研究所自制，批號(hào)：160801，純度：>99%）；MTT（美國(guó)SECOMA公司，批號(hào)：170502）；胎牛血清（美國(guó)賽默飛世爾科技公司，批號(hào)：160110-159）；胰蛋白酶（上海第一生化藥業(yè)有限公司，批號(hào)：170602）；二甲基亞砜（DMSO，北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：161212）；紫杉醇（太極集團(tuán)四川太極制藥有限公司，批號(hào)：20160802，純度：99.5%）；吡啶（西隴化工股份有限公司，批號(hào)：151103）；4-二甲氨基吡啶（今日化學(xué)技術(shù)有限公司，批號(hào)：T029057）；丁二酸酐（天津市光復(fù)精細(xì)化工研究，批號(hào)：20170613）；乙酸酐（天津市富鑫商貿(mào)有限公司，批號(hào)：170201）；丙酸酐（批號(hào)：47093）、丁酸酐（批號(hào)：B108974）、鄰苯二甲酸酐（批號(hào)：52026）均購(gòu)自阿拉丁試劑（上海）有限公司。

1.3 細(xì)胞

人宮頸癌細(xì)胞HeLa、人惡性黑色素瘤細(xì)胞A375、人肺腺癌細(xì)胞SPC-A1、人肝癌細(xì)胞HepG2均由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院提供。

2 救必應(yīng)酸酯類(lèi)衍生物的合成、鑒定及其抗腫瘤活性檢測(cè)

本研究共合成6個(gè)救必應(yīng)酸酯類(lèi)衍生物（編號(hào)：化合物1～6），并采用MS、核磁共振氫譜（1H-NMR）、核磁共振碳譜（13C-NMR）等波譜手段及其理化性質(zhì)對(duì)化合物1～6進(jìn)行鑒定。救必應(yīng)酸酯類(lèi)衍生物合成路線見(jiàn)圖1。

2.1 化合物1的合成與鑒定

2.1.1 化合物1的合成 取救必應(yīng)酸0.976 g（2 mmol），置于圓底燒瓶中，加入N，N-二甲基甲酰胺25 mL，無(wú)水碳酸鉀1.104 g（8 mmol），碘甲烷0.62 mL（10 mmol），反應(yīng)過(guò)程中用薄層色譜（TLC）法檢測(cè)反應(yīng)至無(wú)救必應(yīng)酸。反應(yīng)結(jié)束后，加入水200 mL，攪拌，過(guò)濾，濾餅用水洗脫至中性，用100 mL乙酸乙酯溶解，再用飽和碳酸氫鈉、1 mol/L鹽酸、水各洗脫3次，每次30 mL；無(wú)水硫酸鈉脫水，過(guò)濾，干燥，即得化合物1（0.84 g，產(chǎn)率為83.7%）。

2.1.2 化合物1的鑒定 白色粉末。熔點(diǎn)（mp）為249.8～251.7 ℃，ESI-MS（m/z）：525[M+Na]+，1H-NMR（400 MHz，DMSO）δ：5.19（1H，12-CH），4.39（1H，19-OH），4.14（1H，3-OH），3.85（1H，23-OH），3.50（3H，1′ -CH2），3.44～3.41（1H，3-CH），3.32（1H，23-CH2），3.09～3.06（1H，23-CH2），2.61～2.54（1H，11-CH2），2.40（1H，18-CH），1.88～1.45（14H），1.29（3H，30-CH3），1.25～1.13（5H），1.08（3H，27-CH3），0.93～0.91（1H），0.87（3H，24-CH3），0.84（d，J=6.9 Hz，3H，29-CH3），0.60（3H，26-CH3），0.53（3H，25-CH3）。13C-NMR（100 MHz，DMSO）δ：177.41（C-28），138.28（C-13），127.20（C-12），71.62（C-3），70.52（C-19），64.69（C-23），53.31（C-18），51.19（C-1′ ），47.49（C-5），46.67（C-9），46.54（C-17），41.81（C-20），41.33（C-14），41.05（C-8），39.24（C-1），38.01（C-4），37.16（C-22），36.23（C-10），32.16（C-7），28.02（C-15），26.54（C-21），26.29（C-29），25.80（C-2），25.13（C-16），24.08（C-27），23.14（C-11），17.57（C-6），16.29（C-25），16.17（C-26），15.41（C-30），12.55（C-24）。根據(jù)以上數(shù)據(jù)確定該化合物1為救必應(yīng)酸甲酯。

2.2 化合物2～6的合成與鑒定

2.2.1 化合物2～6的合成 取0.5 g化合物1（1 mmol）5份，分別溶于20 mL吡啶中，分別加入6 mmol相應(yīng)酸酐，0.976 g（0.8 mmol）4-二甲氨基吡啶，攪拌使其完全溶解，85 ℃攪拌反應(yīng)，反應(yīng)過(guò)程中用TLC法檢測(cè)反應(yīng)是否完全。反應(yīng)結(jié)束后，放至室溫；再轉(zhuǎn)移至150 mL冰水浴中，用稀鹽酸調(diào)其pH為5～6，濾過(guò)，濾餅用水洗至中性，再用200 mL乙酸乙酯溶解；再依次用水、飽和氯化鈉溶液各洗3次，每次25 mL，乙酸乙酯層用無(wú)水硫酸鈉脫水；再回收溶劑，干燥，干法上樣，分別以石油醚-乙酸乙酯-甲酸（6 ∶ 3 ∶ 0.05，V/V/V）、石油醚-乙酸乙酯-甲酸（7 ∶ 2 ∶ 0.05，V/V/V）、石油醚-乙酸乙酯（3 ∶ 2，V/V）、石油醚-乙酸乙酯（7 ∶ 4，V/V）、三氯甲烷-甲醇-甲酸（10 ∶ 2 ∶ 0.1，V/V/V）溶液進(jìn)行柱層析，根據(jù)TLC檢測(cè)結(jié)果，合并相同流分，回收溶劑，純化，減壓干燥，即得化合物2（0.52 g，產(chǎn)率為88.7%）、化合物3（0.44 g，產(chǎn)率為71.7%）、化合物4（0.50 g，產(chǎn)率為77.9%）、化合物5（0.52 g，產(chǎn)率為65.2%）、化合物6（0.35 g，產(chǎn)率為49.9%）。

2.2.2 化合物2的鑒定 白色粉末。mp為106.9～108.9 ℃；ESI-MS（m/z）：609.39[M+Na]+，1H-NMR（400 MHz，DMSO）δ：5.19（1H，12-CH），4.67～4.62（1H，19-OH），3.85（1H，3-CH），3.82（1H，23-CH2），3.68～3.62（1H，23-CH2），3.50（3H），2.58～2.52（1H，11-CH2），2.41（1H，18-CH），2.00（3H，2″ -CH3），1.98（3H，2″′ -CH3），1.90～1.86（2H），1.64～1.34（12H），1.29（3H，30-CH3），1.24～1.12（5H），1.09（3H，27-CH3），1.02～0.97（1H），0.93（3H，24-CH3），0.85（d，J=6.6 Hz，3H，29-CH3），0.79（3H，26-CH3），0.64（3H，25-CH3）。13C-NMR（100 MHz，DMSO）δ：176.43（C-28），169.98（C-1″ ），169.85（C-1″′ ），138.37（C-13），126.99（C-12），73.82（C-3），71.58（C-19），64.73（C-23），53.29（C-18），51.29（C-1′ ），47.52（C-5），47.47（C-9），46.73（C-17），41.33（C-20），40.90（C-14），40.17（C-8），37.40（C-1），37.18（C-4），36.23（C-22），32.08（C-10），27.92（C-7），26.29（C-15），25.80（C-21），25.81（C-29），25.07（C-2），23.85（C-16），23.09（C-27），22.64（C-11），20.90（C-2″ ），20.59（C-2″′ ），17.59（C-6），16.43（C-25），16.23（C-26），15.37（C-30），12.84（C-24）。根據(jù)以上數(shù)據(jù)確定該化合物2為3，23-O-雙（乙?；┚缺貞?yīng)酸甲酯。

2.2.3 化合物3的鑒定 白色粉末。mp為175.4～177.0 ℃，ESI-MS（m/z）：637.39[M+Na]+，1H-NMR（400 MHz，DMSO）δ：5.20（1H，12-CH），4.69～4.63（1H，19-OH），3.88（1H，3-CH），3.85（1H，23-CH2），3.68～3.61（1H，23-CH2），3.50（3H，1′ -CH3），2.58～2.57（1H，11- CH2），2.40（1H，18-CH），2.34～2.23（4H，2″ -CH2，2″′ - CH2），1.90～1.85（2H），1.67～1.35（12H），1.29（3H，30- CH3），1.24～1.16（4H），1.09～0.96（10H，3″ -CH3，3″′ - CH3，27-CH3），0.97-0.96（1H），0.93（3H，24-CH3），0.85（d，J=6.6 Hz，3H，29-CH3），0.80（3H，26-CH3），0.62（3H，25-CH3）。13C-NMR（100 MHz，DMSO）δ：177.38（C-28），172.92（C-1″ ），172.88（C-1″′ ），138.27（C-13），126.99（C-12），73.51（C-3），71.54（C-19），64.23（C-23），53.31（C-18），51.24（C-1′ ），47.47（C-5），47.40（C-9），46.81（C-17），41.31（C-20），40.91（C-14），40.37（C-8），37.45（C-1），37.12（C-4），36.18（C-22），32.03（C-10），27.94（C-7），27.12（C-15），26.24（C-21），25.78（C-29），25.06（C-2），23.77（C-16），23.07（C-27），22.84（C-11），22.78（C-2″ ），22.57（C-2″′ ），17.55（C-6），16.26（C-25），16.21（C-26），15.30（C-30），12.79（C-24），9.16（C-3″ ），9.06（C-3″′ ）。根據(jù)以上數(shù)據(jù)確定該化合物3為3，23-O-雙（丙?；┚缺貞?yīng)酸甲酯。

2.2.4 化合物4的鑒定 白色粉末。mp為166.9～168.4 ℃；ESI-MS（m/z）：665.43[M+Na]+，1H-NMR（400 MHz，DMSO）δ：5.20（1H，12-CH），4.70～4.64（1H，19-OH），3.88（1H，3-CH），3.84（1H，23-CH2），3.67～3.58（1H，23-CH2），3.50（3H），2.61～2.54（1H，11-CH2），2.41（1H，18-CH），2.29～2.15（4H，2″-CH2，2″′ -CH2），1.90～1.86（2H），1.67～1.35（16H，3″-CH2，3″′ -CH2），1.29（3H，30-CH3），1.24～1.13（4H），1.09（3H，27-CH3），0.99～0.97（1H），0.93～0.84（13H），0.79（3H，26-CH3），0.65（3H，25-CH3）。13C-NMR（100 MHz，DMSO）δ：177.38（C-28），172.06（C-1″ ），171.99（C-1″ ′ ），138.26（C-13），127.00（C-12），73.49（C-3），71.55（C-19），64.20（C-23），53.30（C-18），51.24（C-1′ ），47.46（C-5），47.31（C-9），46.81（C-17），41.31（C-20），40.91（C-14），40.25（C-8），37.47（C-1），37.11（C-4），36.18（C-22），35.69（C-10），35.67（C-2″ ），32.06（C-2″ ′ ），27.96（C-7），26.24（C-15），25.78（C-21），25.05（C-29），23.72（C-2），23.07（C-16），22.57（C-27），22.49（C-11），18.09（C-3″ ），18.01（C-3″ ′ ），17.53（C-6），16.26（C-25），16.20（C-26），15.29（C-30），13.50（C-4″ ），13.32（C-4″ ′ ），12.84（C-24）。根據(jù)以上數(shù)據(jù)確定該化合物4為3，23-O-雙（丁?；┚缺貞?yīng)酸甲酯。

2.2.5 化合物5的鑒定 白色粉末。mp為155.6～157.1 ℃；ESI-MS（m/z）：821.39[M+Na]+，1H-NMR（400 MHz，DMSO）δ：13.21（s，2H），7.78～7.61（m，8H），5.19（1H，12-CH），5.00～4.95（1H，19-OH），4.10～3.97（2H，3CH，23-CH2），3.85～3.82（1H，23-CH2），3.50（3H，1′ -CH3），2.55～2.51（1H，11-CH2），2.40（1H，18-CH），1.99～1.87（2H），1.77～1.44（12H），1.36～1.29（3H），1.22（3H，30-CH3），1.19-1.15（2H），1.08（4H，27-CH3），0.94～0.91（1H），0.97（3H，24-CH3），0.87（3H，26-CH3），0.84（d，J=6.6 Hz，3H，29-CH3），0.65（3H，25-CH3）。13C-NMR（100 MHz，DMSO）δ：177.45（C-28），168.14（C-1″ ），167.89（C-1″ ′ ），166.95（C-8″ ），166.89（C-8″ ′ ），138.41（C-13），132.51（C-2″ ），132.40（C-3″ ），132.14（C-2″ ′ ），132.07（C-3″ ′ ），131.32（C-4″ ′ ），131.23（C-5″ ′ ），130.98（C-4″ ），130.48（C-5″ ），128.92（C-6″ ），128.72（C-7″ ），128.32（C-6″ ′ ），128.14（C-7″ ′ ），126.96（C-12），75.47（C-3），71.55（C-19），65.73（C-23），53.55（C-18），51.29（C-1′ ），47.51（C-5），47.47（C-9），46.73（C-17），41.34（C-20），41.01（C-14），40.63（C-8），37.37（C-1），37.15（C-4），36.24（C-22），32.01（C-10），27.84（C-7），26.27（C-15），25.83（C-21），25.10（C-29），25.04（C-2），23.72（C-16），23.13（C-27），22.04（C-11），17.59（C-6），16.30（C-25），16.23（C-26），15.33（C-30），12.85（C-24）。根據(jù)以上數(shù)據(jù)確定該化合物5為3，23-O-雙（鄰苯二甲?；┚缺貞?yīng)酸甲酯。

2.2.6 化合物6的鑒定 白色粉末。mp為103.8～105.6 ℃；ESI-MS（m/z）：725.38[M+Na]+，1H-NMR（400 MHz，DMSO）δ：12.17（2H，4″ -COOH，4″′ -COOH），5.19（1H，12-CH），4.71～4.65（1H，19-OH），3.90～3.85（1H，23-CH2），3.81（1H，3-CH），3.61～3.57（1H，23-CH2），3.50（3H，1′ -CH3），2.62～2.56（1H，11-CH2），2.47～2.40（9H，18-CH，2″ -CH2，2″′ -CH2，3″ -CH2，3″′ -CH2），2.06～1.85（2H），1.67～1.41（12H），1.30（3H，30-CH3），1.24～1.13（5H），1.09（3H，27-CH3），0.92（3H，24-CH3），0.90～0.88（1H），0.85（d，J=6.6 Hz，3H，29-CH3），0.79（3H，26- CH3），0.62（3H，25-CH3）。13C-NMR（100 MHz，DMSO）δ：177.31（C-28），173.15（C-1″ ），172.94（C-1″ ′ ），171.26（C-4″ ），171.14（C-4″ ′ ），138.30（C-13），126.88（C-12），73.91（C-3），71.52（C-19），64.65（C-23），53.26（C-18），51.10（C-1′ ），47.42（C-5），47.22（C-9），46.53（C-17），41.24（C-20），40.91（C-14），40.26（C-8），37.16（C-1），37.02（C-4），36.12（C-22），31.89（C-10），29.07（C-7），28.87（C-15），28.70（C-2″ ），28.63（C-2″ ′ ），27.85（C-3″ ），26.19（C-3″ ′ ），25.71（C-21），25.04（C-29），23.71（C-2），23.01（C-16），22.48（C-27），18.29（C-11），17.51（C-6），16.18（C-25），16.08（C-26），15.20（C-30），12.68（C-24）。根據(jù)以上數(shù)據(jù)確定該化合物6為3，23-O-雙（丁二?；┚缺貞?yīng)酸甲酯。

2.3 救必應(yīng)酸及其酯類(lèi)衍生物抗腫瘤活性檢測(cè)

2.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 分別取HeLa、A375、SPC-A1、HepG24細(xì)胞株，加入適量培養(yǎng)液，混懸，于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)2～3 d，以0.1%胰酶消化傳代。

2.3.2 分組、給藥及抗腫瘤活性檢測(cè) 4種腫瘤細(xì)胞均設(shè)置陰性對(duì)照組（不加藥，以相同體積培養(yǎng)基代替）、空白對(duì)照組（只加培養(yǎng)基）、陽(yáng)性對(duì)照組（紫杉醇濃度為2.5、5、10、20、40 μmol/L的系列溶液）和7個(gè)試驗(yàn)組（用含DMSO小于10%的培養(yǎng)基，分別制備救必應(yīng)酸、化合物1～6的濃度為2.5、5、10、20、40 μmol/L的系列溶液），除空白對(duì)照組外，其余各組均加入1×105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，然后于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h后，加20 μL MTT溶液繼續(xù)培養(yǎng)4 h，離心10 min，棄去上清液，加入150 μL DMSO，振搖10 min后，采用酶標(biāo)儀于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各組吸光度（OD），并計(jì)算抑制率[抑制率=（陰性對(duì)照組OD-試驗(yàn)組OD）/（陰性對(duì)照組OD-空白對(duì)照組OD）×100%]，然后繪制不同藥物濃度與抑制率的關(guān)系曲線，得半數(shù)抑制濃度（IC50）[9-12]。所有數(shù)據(jù)以x±s表示，采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

由表1可知，救必應(yīng)酸及其衍生物對(duì)HeLa、A375、HepG2、SPC-A1的生長(zhǎng)均有一定的抑制作用，與紫杉醇比較，化合物5和化合物6對(duì)這4種細(xì)胞的抗腫瘤活性與其相似，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），救必應(yīng)酸及其他化合物的IC50顯著減小（P<0.05）。

3 討論

3.1 救必應(yīng)酸酯類(lèi)衍生物的合成過(guò)程

由于救必應(yīng)酸結(jié)構(gòu)存在立體位阻，使得救必應(yīng)酸28位羧基酯化反應(yīng)比較困難，筆者前期曾采用救必應(yīng)酸與甲醇在酸的催化下直接酯化，但其產(chǎn)率僅有15%。故在本試驗(yàn)中先將救必應(yīng)酸成鹽再與鹵代烴進(jìn)行反應(yīng)。救必應(yīng)酸與碳酸鉀、氫氧化鉀均能成鹽，但試驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，救必應(yīng)酸與無(wú)水碳酸鉀在N，N-二甲基甲酰胺溶液中更易形成均相溶液，而與氫氧化鉀反應(yīng)副產(chǎn)物較多。故在本試驗(yàn)中選取無(wú)水碳酸鉀與救必應(yīng)酸生成鉀鹽，然后再與相應(yīng)的酸酐反應(yīng)。

3.2 抗腫瘤活性研究

初步抗腫瘤活性的研究結(jié)果表明，合成的6個(gè)化合物對(duì)4種腫瘤細(xì)胞均具有一定抗腫瘤活性，且化合物5、6的活性明顯高于其他衍生物及救必應(yīng)酸，筆者推測(cè)可能是化合物5、6引入了吸電子基團(tuán)；化合物6的活性高于化合物5的原因可能是丁二酸的吸電能力大于鄰苯二甲酸。另外，通過(guò)分析數(shù)據(jù)可知合成的6個(gè)化合物對(duì)HeLa細(xì)胞的抗腫瘤活性皆高于其他3種腫瘤細(xì)胞，其原因可能是化合物對(duì)各細(xì)胞的選擇性不同，因此，后續(xù)可進(jìn)一步研究其構(gòu)效關(guān)系對(duì)腫瘤細(xì)胞活性的影響。

綜上所述，本研究合成了6個(gè)救必應(yīng)酸酯類(lèi)衍生物，其中化合物5、6具有顯著的體外抗腫瘤活性，可作為新的抗腫瘤潛在化合物。本研究結(jié)果也為進(jìn)一步研究救必應(yīng)酸的結(jié)構(gòu)修飾及其構(gòu)效關(guān)系奠定了基礎(chǔ)，為從天然藥物中尋找安全有效的抗腫瘤化合物提供了試驗(yàn)依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[ 1 ] 孫輝，張曉琦，蔡艷，等. 救必應(yīng)的化學(xué)成分研究[J].林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)，2009，29（1）：111-114.

[ 2 ] 劉國(guó)樵.五環(huán)三萜皂苷化合物用途：中國(guó)，200810198190[P]. 2008-09-18.

[ 3 ] 趙立春.響應(yīng)曲面法用于救必應(yīng)等3種藥材高效提取及其提取物的藥理活性研究[D].保定：河北大學(xué)，2013.

[ 4 ] 趙全成，南敏倫，赫玉芳，等.救必應(yīng)酸在制備防治心腦血管疾病的藥物中的應(yīng)用：中國(guó)，201010204596.9[P]. 2010- 06-22.

[ 5 ] 賀興隆.齊墩果酸衍生物的合成與表征及其抑菌活性的研究[D]. 沈陽(yáng)：遼寧師范大學(xué)，2011.

[ 6 ] 楊定菊，李穎，尹述凡. 3-O-乙?；芄?3-乙?；?2- [（未）取代苯基]-2，3-二氫-1，3，4-噁二唑-5-甲酯的合成及其抗炎活性研究[J].有機(jī)化學(xué)，2008，28（6）：1055- 1060.

[ 7 ] 倪明宇，馬莉，吳英良，等.樺木酸的抗腫瘤作用及其誘導(dǎo)KB細(xì)胞凋亡的研究[J].沈陽(yáng)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，23（1）：38-42.

[ 8 ] 陳榮，廖曉峰.熊果酸酯的合成研究[J].現(xiàn)代食品科技，2006，22（4）：181-182.

[ 9 ] HE YF，NAN ML，SUN JM，et al. Synthesis，characterization and cytotoxicity of new rotundic acid derivatives[J]. Molecules，2012，17（2）：1278-1291.

[10] HE YF，NAN ML，SUN JM，et al. Design，synthesis and cytotoxicity of cell death mechanism of rotundic acid derivatives[J]. Bioorg Med Chem Lett，2013，23（9）：2543- 2547.

[11] 赫玉芳.救必應(yīng)酸的制備及其衍生物的設(shè)計(jì)、合成和抗腫瘤活性研究[D].長(zhǎng)春：吉林大學(xué)，2013.

[12] 黃茂莘，蔡楊靖，劉壽柏，等.憂遁草枝葉的化學(xué)成分及體外抗腫瘤活性研究[J].中國(guó)藥房，2017，28（7）：895-898.

（收稿日期：2018-09-25 修回日期：2019-01-03）

（編輯：唐曉蓮）