邱靈慧 王鐵山 劉碧原

摘要 目的：觀察不同力度對(duì)刮痧效果的影響，初步探討刮痧的作用機(jī)制以及效應(yīng)周期，進(jìn)一步探究刮痧治療的最佳間隔時(shí)間。方法：用自制的特殊刮痧板控制使刮痧頻次等參數(shù)保持一致，分別以1N、3N和9N的力進(jìn)行刮痧，通過ELISA方法檢測(cè)刮痧后IL-1α、IL-6的變化，結(jié)合皮膚HE染色法探究不同力度刮痧對(duì)機(jī)體的影響，選擇適合的刮痧力度，通過血常規(guī)和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)刮痧后不同時(shí)間點(diǎn)的白細(xì)胞總數(shù)、淋巴細(xì)胞總數(shù)及T細(xì)胞亞群等的變化，初步探討刮痧的作用機(jī)制和效應(yīng)周期。結(jié)果：1N的力度刮痧未引起明顯的變化，9N的力度刮痧造成了較嚴(yán)重的皮膚損傷和大量炎性反應(yīng)因子釋放，3N的力度刮痧較為適中，引起了機(jī)體適度的應(yīng)激反應(yīng)。以3N的力度刮痧后，血液中白細(xì)胞總數(shù)和淋巴細(xì)胞總數(shù)及IL-1α、IL-6緩慢升高，在1 h到24 h之間達(dá)到峰值，之后緩慢下降，在72 h左右恢復(fù)正常水平。結(jié)論：3N的力比較適合于刮痧實(shí)驗(yàn)，在刮痧之后1 h到24 h，刮痧對(duì)免疫系統(tǒng)的增強(qiáng)作用達(dá)到峰值，在72 h左右回歸正常值，初步提示可以開始下一次刮痧治療。

關(guān)鍵詞 刮痧;力度;時(shí)間;免疫;組織切片;炎性反應(yīng)因子;血常規(guī);T淋巴細(xì)胞亞群

Abstract Objective：To explore the effects of different intensity on the efficacy of Gua Sha，the working mechanism and the effective period of Gua Sha preliminarily，and to further explore the best time interval between two Gua Sha treatments.Methods：The parameters such as the frequency of Gua Sha were controlled by the self-made special Gua Sha plate，and Gua Sha was respectively performed with the force of 1N，3N and 9N.The changes of IL-1α and IL-6 after Gua Sha were detected by ELISA.The effects of Gua Sha with different intensity on the body was tested via the method of skin HE staining，and the appropriate Gua Sha intensity was selected.The changes of leukocyte count，lymphocyte count and T cell subpopulations at different time points after Gua Sha were detected by routine blood examination and flow cytometry.The working mechanism and effective period of Gua Sha were preliminarily discussed.Results：The Gua Sha of 1N intensity did not cause obvious changes，while Gua Sha of 9N intensity caused relatively serious skin injury and the release of a large number of inflammatory factors.Gua Sha of 3N intensity was of moderation，which caused moderate stress reaction of the body.After Gua Sha with 3N intensity，the total number of leukocytes and lymphocytes，IL-1α and IL-6 increased slowly，reached the peak between 1 hour and 24 hours，then decreased slowly，and returned to normal level at 72 h.Conclusion：3N intensity is suitable for Gua Sha experiments.In between 1 hour and 24 hours after Gua Sha，the boosting effect of Gua Sha on the immune system peaked，which returned normal at 72 hours after the performance，suggesting the proceeding of the next treatment.

Key Words Gua Sha; Intensity; Time interval; Immunity; Tissue sections; Inflammatory factors; Blood routine examination; Tlymphocyte subpopulation

中圖分類號(hào)：R244.4文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.05.016

刮痧是中國(guó)中醫(yī)學(xué)中一種既可保健又可治療的自然療法，是中醫(yī)學(xué)的重要組成部分[1]。刮痧主要通過牛角、玉石、苧麻等工具配合相應(yīng)的手法，蘸取一定的遞質(zhì)（植物油、活血?jiǎng)┣逅龋隗w表進(jìn)行同方向反復(fù)刮拭、摩擦，使皮膚局部紅點(diǎn)如粟，以手撫之稍有阻礙的“出痧”樣變化，從而達(dá)到疏通經(jīng)絡(luò)、活血化瘀、驅(qū)邪排毒的作用[2-3]。刮痧在臨床上應(yīng)用廣泛，經(jīng)常應(yīng)用于呼吸系統(tǒng)疾病（普通感冒、流感、咽痛和哮喘等）及消化系統(tǒng)疾病（胃炎、腸炎等）等的治療，臨床療效顯著[4-10]。同時(shí)，刮痧可以減輕局部和遠(yuǎn)端肌痛，有一定的抗氧化作用，在預(yù)防和保健方面也被廣泛應(yīng)用[11-13]。

雖然刮痧在臨床上應(yīng)用廣泛，但其基礎(chǔ)研究相對(duì)落后，其療效的作用機(jī)制仍不明確[14]。同時(shí)在刮痧的過程中，與刮痧效果相關(guān)的很多指標(biāo)如刮痧的力度、持續(xù)時(shí)間、頻次和2次治療的間隔時(shí)間等都沒有相應(yīng)的量化標(biāo)準(zhǔn)和控制手段。這些不僅限制了刮痧的臨床應(yīng)用和理論研究，也降低了刮痧的國(guó)際認(rèn)可度[15]。其中，刮痧的力度與刮痧效果之間的關(guān)系最為密切，因此需要探究力度對(duì)刮痧效果產(chǎn)生的影響。為了保證結(jié)果的可靠性，需要在控制刮痧力度的同時(shí)，保持次數(shù)、時(shí)間和頻次等參數(shù)一致。為此，我們?cè)O(shè)計(jì)了一種專門的刮痧板，方便控制刮痧的力度、頻次等參數(shù)。在其他參數(shù)一致的情況下，探究不同大小的力對(duì)刮痧效果產(chǎn)生的影響。

此外，在多數(shù)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)中，刮痧僅操作一次，但在臨床應(yīng)用中，刮痧治療通常是持續(xù)性的。目前，對(duì)于2次刮痧治療的間隔還沒有明確規(guī)定和相關(guān)研究，因此探究2次刮痧治療的間隔尤為重要。為了初步探究2次刮痧的適當(dāng)間隔，需要明確刮痧后機(jī)體功能變化的周期，以刮痧后機(jī)體功能恢復(fù)正常的時(shí)間作為最小的刮痧間隔。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)Balb/c雌性小鼠，6周齡，體質(zhì)量（16±2）g，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK（京）2014-0010，飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)屏障環(huán)境動(dòng)物室，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（京）2016-0038。飼養(yǎng)環(huán)境溫度23～25 ℃，相對(duì)濕度45%～50%，光照12 h明/暗交替，動(dòng)物自由進(jìn)食、飲水。

1.1.2 試劑及儀器 水合氯醛（美國(guó)bioruler）;多聚甲醛固定液（凱基生物）;Mouse IL-1alpha ELISA Kit（默沙克生物;批號(hào)：20171009083）;Mouse IL-6 ELISA Kit（life technologiesTM;批號(hào)：1671984B1）;淋巴細(xì)胞分離液、全血及組織稀釋液、洗滌液（Solarbio，批號(hào)分別是：20170820;20170628;20170728）;Fitc-CD3、APC-CD4，PE-CD8a流式抗體（美國(guó)BD公司，批號(hào)分別是：6340765;7153905;7028748）;EDTA抗凝管（國(guó)產(chǎn)）。BD FACSCanto Ⅱ型流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司），光學(xué)顯微鏡（日本OLYMPUS，U-RFL-T）全自動(dòng)血液分析儀（日本svsmex，xs-800i）。

1.2 方法

1.2.1 刮痧力度對(duì)刮痧效果的影響

1.2.1.1 分組與模型制備 40只Balb/c雌性小鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為四組：A組：不刮痧對(duì)照組，B組：以1N的力刮痧60次，C組以3N的力刮痧60次，D組以9N的力刮痧60次。

1.2.1.2 干預(yù)方法 刮痧前24 h小鼠背部皮膚備皮，1 cm×2 cm。刮痧前，腹腔注射10%水合氯醛（0.35 g/kg）麻醉小鼠，俯臥位放置，在備皮區(qū)以75%乙醇消毒，按各組力度進(jìn)行刮痧，每組刮痧60次，持續(xù)30 s，即刮痧頻次為2次/s。為了完成對(duì)力度的控制，我們制作了一個(gè)可以顯示刮痧力度的刮痧板（圖1），顯示如下：F表示刮痧的力度，以g表示，1 000 g等于9.8N（1N≈102 g;3N≈306 g;9N≈918 g），T表示刮痧持續(xù)的時(shí)間，W是力與時(shí)間的乘積（圖2）。刮痧時(shí)控制力度在目標(biāo)值范圍內(nèi)，正負(fù)不超過10%。并且保證每組的刮痧時(shí)間在30 s左右，以控制刮痧頻次在2次/s左右。

1.2.1.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法 1）制作HE染色切片觀察刮痧后皮膚組織狀態(tài)：頸椎脫臼法處死小鼠，俯臥位放置，刮痧背部正中取約1 cm×1 cm的皮膚，鋪平，4%多聚甲醛固定，修剪后放入包埋盒中，流水沖洗30 min后脫水，透明，再將已透明的組織塊置于已溶化的石蠟中，放入溶蠟箱保溫。待石蠟完全浸入組織塊后進(jìn)行包埋。組織塊變硬后，切片，展片，烤片?？靖珊笠来芜M(jìn)行脫蠟和脫水。脫水后利用蘇木精和伊紅染色，經(jīng)乙醇脫水和二甲苯透明后封片觀察。2）ELISA法檢測(cè)小鼠血清中IL-1α和IL-6含量：刮痧后0.5 h取小鼠靜脈血，室溫沉淀30 min后離心取血清。取20 μL血清用ELISA檢測(cè)其中IL-1α、IL-6的含量。向包有IL-1α或IL-6的酶標(biāo)板中加入血清，37 ℃孵育30 min，用PBS洗滌3次。孵育含有酶的檢測(cè)抗體，37 ℃孵育30 min后加入底物反應(yīng)顯色，用酶標(biāo)儀讀板，參考標(biāo)曲得到每孔的IL-1α和IL-6含量。

1.2.2 刮痧后不同時(shí)間點(diǎn)免疫功能的變化

1.2.2.1 分組與模型制備 70只Balb/c雌性小鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為7組，以3N力刮痧，刮痧操作方法同上。分組：A組：不刮痧對(duì)照組;B組：刮痧后即刻，取血;C組：刮痧后0.5 h，取血;D組：刮痧后1 h，取血;E組：刮痧后24 h，取血;F組：刮痧后72 h，取血;每組10只。

1.2.2.2 干預(yù)方法 同1.2.1.2。

1.2.2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法 1）檢測(cè)刮痧后小鼠的血常規(guī)變化：刮痧后摘眼球取血，EDTA管抗凝，用全血細(xì)胞分析儀分析血常規(guī)變化。2）流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)刮痧后T細(xì)胞亞群的變化：取抗凝全血，用淋巴細(xì)胞分離液分離，得到淋巴細(xì)胞，500 μL加入離心管。Fitc-CD3、APC-CD4，PE-CD8a各取1 μg到離心管中，與小鼠淋巴細(xì)胞均勻混合，4 ℃避光30 min，之后400 g離心10 min，棄上清，1 mL PBS重懸細(xì)胞，400 g，離心10 min，重復(fù)2次后200 μL重懸，流式上機(jī)檢測(cè)。3）ELISA法檢測(cè)刮痧后不同時(shí)間點(diǎn)小鼠血清IL-1α和IL-6含量方法同上。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SAS 9.2統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。若符合正態(tài)，均數(shù)比較采用One-way ANOVA進(jìn)行分析;根據(jù)方差是否齊，組間比較分別采用LSD或者DUNETT′s T3。數(shù)據(jù)若不符合正態(tài)，均數(shù)及組間比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 刮痧力度對(duì)刮痧效果的影響

2.1.1 刮痧后整體效果展示 見圖3。

2.1.2 HE染色切片 HE染色結(jié)果顯示，1N刮痧組皮膚無明顯變化，無明顯出血與充血;3N刮痧組皮膚無明顯受損，可見血管充血，無血管出血和炎性反應(yīng)細(xì)胞浸潤(rùn);9N刮痧組皮膚受損嚴(yán)重，已無基本組織形態(tài)，出血嚴(yán)重，出現(xiàn)較多的炎性反應(yīng)細(xì)胞浸潤(rùn)。說明使用9N的力度刮痧過大，會(huì)引起較嚴(yán)重的組織損傷，而1N的力則刺激過小，沒有明顯的變化。見圖4。

2.1.3 ELISA檢測(cè)不同力度刮痧IL-1α和IL-6含量變化 IL-1α是膜型炎性反應(yīng)因子，正常狀態(tài)下表達(dá)在細(xì)胞膜上，在細(xì)胞受損破裂時(shí)會(huì)被釋放入血，發(fā)揮免疫效應(yīng)和趨化作用[16]。IL-6是主要的炎性反應(yīng)因子[17]。在9N組，IL-6升高接近20倍，印證了HE組織切片的結(jié)果，說明9N的力刮痧會(huì)引起較為嚴(yán)重的炎性反應(yīng);3N組的IL-1α和IL-6含量均有適度升高，說明3N的力刮痧會(huì)引起適當(dāng)?shù)难仔苑磻?yīng)，可以適度增強(qiáng)機(jī)體免疫，因此后續(xù)刮痧實(shí)驗(yàn)均采用3N的力度進(jìn)行刮痧。見表1。

2.2 探究刮痧后不同時(shí)間點(diǎn)免疫功能的變化

2.2.1 各組小鼠刮痧后不同取血時(shí)間IL-1α和IL-6含量變化 從刮痧到刮痧后1 h，血清中IL-1α和IL-6含量逐漸上升，在24 h時(shí)出現(xiàn)下降，72 h之后恢復(fù)，接近正常。見表2。

2.2.2 刮痧對(duì)各組小鼠血液中白細(xì)胞總數(shù)和淋巴細(xì)胞總數(shù)的影響 從刮痧到刮痧后1 h，白細(xì)胞總數(shù)和淋巴細(xì)胞總數(shù)逐漸增加，在24 h時(shí)出現(xiàn)下降，在72 h之后恢復(fù)到正常值。

2.2.3 刮痧對(duì)各組小鼠T淋巴細(xì)胞亞群的影響 T細(xì)胞百分比是指T淋巴細(xì)胞占淋巴細(xì)胞百分比，CD4+，CD8+百分比指其占T細(xì)胞百分比刮痧后，T細(xì)胞百分比和淋巴細(xì)胞百分比比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

刮痧是中醫(yī)學(xué)的瑰寶之一，在臨床上廣泛應(yīng)用[18]。但是因?yàn)楣勿鹑鄙傧鄳?yīng)的量化指標(biāo)，使得其在臨床應(yīng)用時(shí)只能依賴醫(yī)師的個(gè)人經(jīng)驗(yàn)[19]，增大了刮痧治療的難度，在一定限度上限制了刮痧的應(yīng)用。針灸與刮痧同為傳統(tǒng)中醫(yī)的瑰寶，但無論是在基礎(chǔ)研究還是臨床應(yīng)用，尤其是海外的臨床應(yīng)用方面，刮痧遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于針灸。其原因可能是針灸有著嚴(yán)格的量化指標(biāo)而刮痧缺乏相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)[15]。在我們制作的智能刮痧板的幫助下，刮痧的標(biāo)準(zhǔn)化成為可能，這對(duì)推動(dòng)刮痧在臨床上的應(yīng)用和基礎(chǔ)研究有重大的意義。同時(shí)，我們可以控制單一變量，研究單一因素對(duì)刮痧效果的影響，因此，我們首先探究了不同的刮痧力度對(duì)刮痧效果的影響。

組織切片HE染色的結(jié)果顯示：1N刮痧組與未刮痧組沒有明顯的差異，而9N組則出現(xiàn)了明顯的壞死，說明這2種力度都不適宜進(jìn)行刮痧實(shí)驗(yàn)。而3N組的組織出現(xiàn)了適度的充血，說明刮痧造成了一定的刺激，但并沒有造成明顯損傷。同樣，IL-1α和IL-6的ELISA結(jié)果也顯示1N組造成的刺激過輕，而9N組的刺激過重，引起了較為嚴(yán)重的炎性反應(yīng)，尤其是IL-6升高了20倍。而3N組有組織適度的炎性反應(yīng)，對(duì)組織有一定的刺激但又不會(huì)過于強(qiáng)烈，所以我們認(rèn)為對(duì)于小鼠刮痧實(shí)驗(yàn)而言，3N是合適的力度。但是在臨床上合適的刮痧力度還需要相應(yīng)的臨床實(shí)驗(yàn)進(jìn)行探討和證實(shí)。力度過輕可能沒有治療效果，力度過重會(huì)造成組織損傷，這也說明了在刮痧的過程中，控制刮痧的力度是十分重要的。

在臨床應(yīng)用中，刮痧治療通常是持續(xù)性的，但是，與刮痧的力度一樣臨床上也沒有判斷兩次刮痧之間間隔的量化指標(biāo)。因此，在確定了刮痧力度之后我們繼續(xù)探究?jī)纱喂勿鹬g的適宜間隔。要想探究?jī)纱喂勿鹬委煹暮线m間隔，必須明確刮痧之后機(jī)體的變化規(guī)律，找到可以反映刮痧后機(jī)體功能變化的指標(biāo)。在上述研究中，我們發(fā)現(xiàn)刮痧可以升高IL-1α和IL-6，同時(shí)，IL-1α和IL-6不僅和細(xì)胞損傷相關(guān)，也都和免疫相關(guān)，有一定的白細(xì)胞趨化作用[20]，所以我們檢測(cè)了刮痧后不同時(shí)間點(diǎn)白細(xì)胞含量和細(xì)胞因子的變化，希望能夠找到刮痧后機(jī)體功能變化的規(guī)律。

在刮痧后白細(xì)胞總數(shù)和淋巴細(xì)胞總數(shù)有顯著性增高降低的線性變化（P<0.01），并隨時(shí)間變化而變化。在刮痧后，1 h內(nèi)白細(xì)胞總數(shù)和淋巴細(xì)胞總數(shù)逐漸升高，在1 h到24 h之間達(dá)到峰值，之后開始下降，在72 h附近恢復(fù)到正常水平。IL-1α在刮痧后的變化沒有那么顯著，但是其趨勢(shì)與白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞相同。有意思的是IL-6的變化早于IL-1α、白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞。說明IL-6的變化可能是在刮痧之后最先產(chǎn)生的變化之一。在刮痧以后，由于組織輕微損傷釋放了IL-6和IL-1α，吸引了白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞入血，促進(jìn)機(jī)體的免疫功能[21]。IL-6與IL-1α都具有免疫調(diào)節(jié)作用，同時(shí)可以促進(jìn)免疫細(xì)胞的增殖和活化[22-23]。淋巴細(xì)胞總數(shù)升高，但是T細(xì)胞和其亞群比例沒有發(fā)生變化，說明刮痧造成的刺激對(duì)各種淋巴細(xì)胞是均勻的，沒有明顯的偏向性。

結(jié)合HE切片染色以及炎性反應(yīng)因子和白細(xì)胞及淋巴細(xì)胞數(shù)量的變化，我們初步描述了刮痧調(diào)節(jié)免疫功能的過程圖：在出痧的過程中，血管擴(kuò)張漸至少量毛細(xì)血管破裂，皮膚局部細(xì)胞破裂釋放炎性反應(yīng)因子，炎性反應(yīng)因子釋放導(dǎo)致白細(xì)胞被趨化入血，增強(qiáng)機(jī)體免疫力，之后毛細(xì)血管逐漸收縮，血管外的紅細(xì)胞先在凝血系統(tǒng)的作用下，發(fā)生凝血形成“痧”，在纖溶系統(tǒng)的作用下溶解，“痧”逐漸退卻，白細(xì)胞含量逐漸恢復(fù)正常。了解刮痧后機(jī)體的變化過程對(duì)于進(jìn)一步探究刮痧的作用機(jī)制有著深刻的意義。

由于在72 h時(shí)，血細(xì)胞和炎性反應(yīng)因子都恢復(fù)到了正常水平，因此我們初步推斷兩次刮痧間隔可以在72 h以后，但是其效果還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證。

刮痧是中華傳統(tǒng)文化的瑰寶，需要我們將其傳承下去。同時(shí)，我們需要吸取現(xiàn)代科學(xué)的精髓，完成對(duì)刮痧這一古老技能的傳承與創(chuàng)新。其中，科學(xué)的闡明刮痧的作用機(jī)理和為刮痧治療制定相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)是極為重要的一環(huán)。我們的工作為這一步奠定了基礎(chǔ)。

該實(shí)驗(yàn)證明，刮痧的效果與刮痧力度密切相關(guān)，力度太大或者太小都不能起到很好的效果，并且發(fā)現(xiàn)3N的力適合小鼠刮痧實(shí)驗(yàn)。并證明了刮痧可以通過改變血液中的白細(xì)胞數(shù)及淋巴細(xì)胞數(shù)來調(diào)節(jié)人體免疫力，并探究了刮痧后血液中白細(xì)胞隨時(shí)間的變化，初步描繪了刮痧后機(jī)體免疫系統(tǒng)變化的過程：在刮痧之后1 h到24 h之間，刮痧對(duì)免疫系統(tǒng)的增強(qiáng)作用達(dá)到峰值，之后在72 h作用回歸正常值，初步提示可以開始下一次的刮痧治療。

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（2018-10-18收稿 責(zé)任編輯：芮莉莉）