杜瑜欣 江蕾 余煉 張思原 高程海

摘要：【目的】研究前體調控對Bacillus sp. 108菌株發(fā)酵合成抑制甘蔗鞭黑粉菌活性物質24元大環(huán)內酯產量的影響，為Bacillus sp.108菌株發(fā)酵工藝規(guī)?；糯蠹案收岷谒氩〉姆乐翁峁┬峦緩??！痉椒ā坷脝我蛩貎?yōu)化方法，考察乙酸鈉、丙酸鈉、正丙醇、異亮氨酸和纈氨酸對Bacillus sp. 108菌株發(fā)酵合成24元大環(huán)內酯的作用，確定有效前體的最佳添加濃度和添加時間;采用平板對峙法測定Bacillus sp. 108菌株發(fā)酵產物24元大環(huán)內酯對甘蔗鞭黑粉菌的抑制作用。【結果】乙酸鈉是Bacillus sp. 108菌株發(fā)酵合成24元大環(huán)內酯的最佳前體，在發(fā)酵第96 h時添加1.0%乙酸鈉，24元大環(huán)內酯的產量達104.45 μg/mL，比未添加前體發(fā)酵的對照組提高58.74%。Bacillus sp. 108菌株發(fā)酵粗提物對甘蔗鞭黑粉菌菌絲生長具有較強的抑制作用，半數(shù)有效濃度（EC50）0為157.94 μg/mL?！窘Y論】乙酸鈉是Bacillus sp.108菌株發(fā)酵合成24元大環(huán)內酯較適宜的前體物質，24元大環(huán)內酯對甘蔗鞭黑粉菌菌絲生長具有明顯的抑制作用，具有開發(fā)成微生物農藥的潛力。

關鍵詞： 海洋芽孢桿菌;24元大環(huán)內酯;發(fā)酵;前體;甘蔗鞭黑粉菌

中圖分類號： S435.661? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2019）04-0755-06

Abstract：【Objective】The effects of precursor regulation on the inhibition of the production of active substances of Sporisorium scitamineum by Bacillus sp. 108 fermentation and synthesis was studied， which provided a new way for the scale-up of Bacillus sp. 108 fermentation process and the prevention and control of sugarcane smut. 【Method】The effects of sodium acetate， sodium propionate， n-propanol， isoleucine and valine on the fermentation of Bacillus sp. 108 strain to synthesize 24-membered macrolide were investigated by single factor optimization method， and the optimum concentration and adding time of effective precursors were determined. The inhibition effect of Bacillus sp. 108 strain fermentation products 24-membered macrolide on S. scitamineum was determined by plate confrontation method. 【Result】Sodium acetate was the optimal precursor for 24-membered macrolide biosynthesis by Bacillus sp. 108 strain. By feeding of 1.0% sodium acetate into the fermentation broth at the 96th h of cultivation， the 24-membered macrolide production was 104.45 μg/mL， 58.74% higher than that in the control without any addition of precursor. The mycelium growth experiment of S. scitamineum showed that extract of Bacillus sp. 108 strain fermentation products could inhibit the growth of S. scitamineum mycelium， the median effective concentration（EC50） values was 157.94 μg/mL. 【Conclusion】Sodium acetate is suitable precursor for 24-membered macrolide biosynthesis by Bacillus sp. 108 strain fermentation. The study confirms that 24-membered macrolide has an inhibitory effect on the growth of the mycelium of S. scitamineum， and has the potential to be developed into a microbial pesticide.

Key words： Bacillus marinus; 24-membered macrolide; fermentation; precursor; Sporisorium scitamineum

0 引言

【研究意義】甘蔗黑穗病是制約甘蔗產業(yè)發(fā)展的重要病害之一（Schenck et al.，2005），由甘蔗鞭黑粉菌（Sporisorium scitamineum）引起。甘蔗一旦感染黑粉菌，會造成生長點變異，產生黑色鞭狀物，從而導致甘蔗產量和產糖量下降（Su et al.，2013）。廣西中醫(yī)藥大學海洋藥物研究院在前期研究中已篩選獲得對甘蔗鞭黑粉菌有抑制作用的生防菌株Bacillus sp. 108，但其抑菌活性物質產量僅為63.78±1.34 μg/mL（余煉，2016;江蕾，2018），難以滿足后續(xù)藥理學應用和作用機制的進一步研究。因此，對生防菌株Bacillus sp. 108抑菌活性物質的合成途徑進行研究，以期大幅提高抑菌活性物質的產量，對于甘蔗黑穗病的防治具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】抑菌活性物質的產量主要由活性菌株的遺傳特性、培養(yǎng)工藝及反應器的操作性能等因素決定。在發(fā)酵工藝優(yōu)化方面，通過添加外源性前體物質強化微生物的生物合成過程，可使代謝途徑沿目標產物合成方向進行（高春霞，2018）。陳海燕和郭鴻雁（2013）研究了丙酸鈉作為前體物質的最佳添加濃度和添加時間，發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵48 h時添加濃度為10 mmol/L的丙酸鈉，阿維菌素產量可達5157.89 μg/mL，比未添加前體物質處理提高104.84%;陳慎等（2017）采用固態(tài)培養(yǎng)發(fā)酵方式，選取不同濃度的乙酸鈉、乙醇、丙酸鈉、丁酸鈉、檸檬酸三鈉、檸檬酸鐵、檸檬酸鐵銨和琥珀酸鈉作為前體物質加入培養(yǎng)基進行發(fā)酵，結果表明0.1%檸檬酸三鈉在提高Monacolin K和洛伐他汀含量上作用明顯;方舟等（2018）在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加4種前體物質，其中大豆油對紐莫康定B0效價的影響極顯著，尤其在大豆油6.0 g/L、亮氨酸1.0 g/L、異丁醇4.0 ml/L、甲硫氨酸0.3 g/L時紐莫康定B0發(fā)酵單位達1295 mg/L左右;周劍和張引（2018）將癸酸銨作為前體物質，通過對發(fā)酵方式進行優(yōu)化，即在發(fā)酵30 h后以4.0 mL/（L·h）恒速流加入5%癸酸銨溶液的方式，可使達托霉素發(fā)酵效價達2276 mg/L?！颈狙芯壳腥朦c】余煉（2016）通過UPLC-MS分析發(fā)現(xiàn)對甘蔗鞭黑粉菌有抑制作用的菌株Bacillus sp. 108的發(fā)酵粗提物與24元大環(huán)內酯的離子碎片相似度較高，推斷該類化合物為一類結構相似的24元大環(huán)內酯。但目前提高Bacillus sp. 108菌株次級代謝物24元大環(huán)內酯產量的方法多見于菌種誘變、發(fā)酵工藝條件優(yōu)化等，關于通過生物合成途徑提高24元大環(huán)內酯產量的研究鮮見報道。【擬解決的關鍵問題】以海洋芽孢桿菌Bacillus sp. 108發(fā)酵產24元大環(huán)內酯的產量為研究對象，采用單因素試驗方法優(yōu)化前體添加條件，并以平板對峙法測定24元大環(huán)內酯對甘蔗鞭黑粉菌的抑制效果，為Bacillus sp. 108菌株發(fā)酵工藝規(guī)?；糯蠹案收岷谒氩〉姆乐翁峁┬峦緩?。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

1. 1. 1 菌種 供試生防菌株由廣西中醫(yī)藥大學海洋藥物研究院于廣西防城港怪石灘（東經108°22′、北緯21°49′）水下5 m分離獲得，經形態(tài)特征分析及16S rRNA測序比對，鑒定并命名為Bacillus sp. 108。

供試病原菌菌株：由廣西中醫(yī)藥大學海洋藥物研究院于發(fā)病甘蔗植株上分離得到的甘蔗鞭黑粉菌冬孢子。

1. 1. 2 培養(yǎng)基 純化及保藏培養(yǎng)基：改良ISP2固體培養(yǎng)基;發(fā)酵培養(yǎng)基：改良ISP2液體培養(yǎng)基;指示菌培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基。

1. 1. 3 主要儀器設備 JJ1000Y型電子天平（上海仁沃實業(yè)發(fā)展有限公司）、SW-CJ-2F型潔凈工作臺（蘇州億達凈化設備有限公司）、Avanti J-E多功能高效離心機（美國Beckman Coulter公司）、N-1000型旋轉蒸發(fā)器（上海愛朗儀器有限公司）、HVE-50型高壓滅菌鍋（日本HIRAYMA公司公司）、DHP-9162電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海天呈科技有限公司）、Waters e2695分析半制備型高效液相色譜儀（美國Waters公司）、XB-C18型分析柱（4.6 mm×250 mm）。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 菌種培養(yǎng) 菌種平板培養(yǎng)：用劃線方法將Bacillus sp. 108菌株孢子接種到培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)。生長1 d后可觀察到菌落形態(tài)平坦，分布稀疏，呈白灰色;3 d后菌落沿劃線方向生長，無滲出液，呈淡黃色;第5 d菌落長滿劃線區(qū)域，判定孢子成熟，可進行下一步的發(fā)酵培養(yǎng)。

搖瓶種子培養(yǎng)：取2環(huán)經活化的菌種接種至裝有200 mL培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，28 ℃下?lián)u床（180 r/min）培養(yǎng)10 h。

1. 2. 2 前體物質種類對24元大環(huán)內酯生物合成的影響 分別向發(fā)酵培養(yǎng)基中以0.1%（w/v）的添加量加入乙酸鈉、丙酸鈉、正丙醇、異亮氨酸和纈氨酸，以篩選出對Bacillus sp. 108發(fā)酵合成24元大環(huán)內酯具有促進作用的前體物質，以未添加前體物質的基礎發(fā)酵培養(yǎng)基為對照。發(fā)酵7 d（168 h）后取樣測定發(fā)酵液中24元大環(huán)內酯化合物產量及菌體干重（生物量）。

1. 2. 3 最佳添加濃度對24元大環(huán)內酯生物合成的影響 在配制發(fā)酵培養(yǎng)基時，分別向培養(yǎng)基中添加0.1%、0.2%、0.4%、0.8%、1.0%和1.2%的最適前體，以未添加前體的基礎發(fā)酵培養(yǎng)基為對照。發(fā)酵7 d后取樣測定分析，確定最適添加濃度。

1. 2. 4 最佳添加時間對24元大環(huán)內酯生物合成的影響 分別在發(fā)酵培養(yǎng)的第0、24、48、72、96、120和144 h向發(fā)酵培養(yǎng)基加入最適濃度的最佳前體，以未添加前體的基礎發(fā)酵培養(yǎng)基為對照。發(fā)酵7 d后取樣測定分析，確定最佳添加時間。

1. 2. 5 活性菌株發(fā)酵及其粗提物的制備 參照覃媚等（2016）的方法，發(fā)酵結束后收集發(fā)酵液并進行破壁處理，用乙酸乙酯等體積萃取4次，濃縮回收乙酸乙酯后得到細菌發(fā)酵粗提物，并置于干燥器低溫保存。

1. 2. 6 發(fā)酵粗提物乙酸乙酯相的高效液相色譜（HPLC）分析 參考Xue等（2008）和Mojid Mondol等（2011）的方法，選用Waters e2695分析半制備型高效液相色譜，4.6 mm×250 mm Waters XB-C18型分析柱。操作條件：流動相為色譜級甲醇（A）和超純水（B）;洗脫條件0～5 min，5%甲醇;5～35 min，95%甲醇;35～46 min，100%甲醇;46～52 min，5%甲醇;流速1 mL/min;進樣量5 μL;檢測波長227 nm。根據(jù)標準曲線（y=1774x+279674）計算得到產物含量（μg/mL），其中x表示大環(huán)內酯產量，y表示峰面積。

1. 2. 7 24元大環(huán)內酯殺菌劑對甘蔗鞭黑粉菌菌絲生長的抑制作用 參照Singh等（2005）的方法檢測24元大環(huán)內酯對甘蔗鞭黑粉菌的抑制效果。首先用生物級DMSO將24元大環(huán)內酯配成含量為1000.0、100.0、50.0、10.0、5.0、1.0和0.1 μg/mL系列濃度的母液，然后分別加入到25 mL滅菌后冷卻至50 ℃的PDA固體培養(yǎng)基中，搖勻后倒入滅菌培養(yǎng)皿，制成24元大環(huán)內酯的系列濃度含藥培養(yǎng)基。再用牙簽挑取“+”、“-”兩種配型的甘蔗鞭黑粉菌擔孢子，分別接種于裝有50 mL YEPS培養(yǎng)基的三角瓶中，設搖床培養(yǎng)條件為28 ℃、180 r/min，培養(yǎng)36～48 h;將兩種配型擔孢子菌懸液等體積比例混合后，用移液槍吸取1 μL混合菌懸液，分別滴加到含有不同濃度24元大環(huán)內酯的PDA培養(yǎng)基上，以不含24元大環(huán)內酯的PDA培養(yǎng)基為陽性對照。靜置待平板內的懸浮液完全吸干，倒置平板放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)7 d，每種濃度設3次平行。培養(yǎng)結束后用十字交叉法測量不同24元大環(huán)內酯濃度下的菌落直徑，計算24元大環(huán)酯對甘蔗鞭黑粉菌的半數(shù)有效濃度（EC50）。

2 結果與分析

2. 1 前體調控對24元大環(huán)內酯生物合成的影響

2. 1. 1 不同前體對24元大環(huán)內酯生物合成的影響 由圖1可知，添加0.1%乙酸鈉可有效提高24元大環(huán)內酯發(fā)酵產量及菌體干重，總大環(huán)內酯產量達68.97 μg/mL，比對照（65.80 μg/mL）提高4.82%，菌體生物量也比對照高30.83%。推測是乙酸鈉參與了Bacillus sp. 108液態(tài)發(fā)酵合成24元大環(huán)內酯的代謝途徑，且對其合成起促進作用;正丙醇和纈氨酸對24元大環(huán)內酯合成的影響不明顯，而丙酸鈉和異亮氨酸會抑制24元大環(huán)內酯合成。Schneider等（2007）的前體補料試驗結果表明，大環(huán)內酯類物質是通過聚酮途徑以甲基丙二酰CoA為起始和延伸單元組裝而成。因此，24元大環(huán)內酯的合成途徑與典型的大環(huán)內酯類物質的生物合成途徑并不完全相同，丙酸鹽類的前體物質并不一定能提高24元大環(huán)內酯類物質發(fā)酵效率。此外，劉揚等（2014）研究發(fā)現(xiàn)微生物中次級代謝物的生物合成基因通常受多個水平和多層次的調控，丙二酰CoA為聚酮合酶的延伸單位，經11輪的Claisen縮合及聚酮鏈末端的羥基對羰基碳進行親核攻擊，再通過Aldol Reaction反應才環(huán)化形成大環(huán)內酯類物質。據(jù)此選擇乙酸鈉為前體進行最適添加濃度及添加時間試驗。

2. 1. 2 乙酸鈉添加濃度對24元大環(huán)內酯生物合成的影響 配制發(fā)酵培養(yǎng)基時向培養(yǎng)基添加不同濃度乙酸鈉，發(fā)酵7 d后取樣測定菌體干重及24元大環(huán)內酯產量。結果（圖2）顯示，當發(fā)酵培養(yǎng)基中乙酸鈉添濃度從0.1%增加到1.0%時，24元大環(huán)內酯產量和發(fā)酵液生物量隨之上升，說明在合適的濃度條件下，乙酸鈉能有效促進菌體生長和產物合成;但當乙酸鈉濃度超過1.0%時24元大環(huán)內酯產量和菌體干重明顯下降。究其原因，一是培養(yǎng)基中乙酸鈉濃度可能過高，使得菌體在長時間低pH環(huán)境下生長受到抑制，影響24元大環(huán)內酯在體外的合成;二是前體一般都有毒性，高濃度乙酸鈉對菌體的生長不利，導致24元大環(huán)內酯產量下降，而且前體物質的價格相對較高，添加過多也易引起揮發(fā)和氧化。因此，確定前體乙酸鈉的最佳添加量濃度為1.0%，此條件下24元大環(huán)內酯產量最高，達84.68 μg/mL，比空白對照（63.65 μg/mL）提高33.04%。

2. 1. 3 乙酸鈉添加時間對24元大環(huán)內酯生物合成的影響 在不同發(fā)酵時期，菌體的生長情況不相同，而24元大環(huán)內酯作為菌株的發(fā)酵產物，其合成程度也有所不同。由圖3可知，在發(fā)酵培養(yǎng)第96 h添加1.0%乙酸鈉，24元大環(huán)內酯產量及菌體干重均比其他處理組效果好，24元大環(huán)內酯產量達104.45 μg/mL，與對照相比提高58.74%。其原因可能是在培養(yǎng)0～48 h時加入乙酸鈉，由于細胞合成的功能酶還較少，沒有足夠的物質調節(jié)代謝轉換，因而前期添加乙酸鈉細胞對其利用率較低;在發(fā)酵培養(yǎng)第72～96 h是菌體開始進入次級代謝產物大環(huán)內酯合成階段，此時加入乙酸鈉能作為前體參與合成大環(huán)內酯;在發(fā)酵培養(yǎng)第120 h加入乙酸鈉，細胞受到前體作用的時間短，有部分細胞未能及時轉化成大環(huán)內酯而發(fā)酵過程已結束，未能充分利用乙酸鈉。因此，在發(fā)酵培養(yǎng)第96 h加入1.0%乙酸鈉能促進24元大環(huán)內酯的合成。

2. 2 24元大環(huán)內酯對甘蔗鞭黑粉菌菌絲生長的抑制效果

由表1和圖4可知，各24元大環(huán)內酯濃度處理對甘蔗鞭黑粉菌菌絲生長均有抑制作用，24元大環(huán)內酯濃度越高，對甘蔗鞭黑粉菌菌絲生長的抑制效果越強，且均優(yōu)于陽性對照，EC50為157.94 μg/mL。因此，Bacillus sp. 108菌株的主體代謝產物24元大環(huán)內酯具有開發(fā)成生物農藥用于防控甘蔗黑穗病的潛力。

3 討論

近年來，生物防治以其生態(tài)環(huán)境友好、成本低及無污染的特點已成為植物病害防治的熱門研究領域，其中芽孢桿菌因其生長速度快、耐受性良好、抑菌作用廣泛而成為科研工作者生防研究的熱點（Wang et al.，2015;段海明等，2017;王波等，2017;何碧珀等，2018）。江蕾等（2018）采用牛津杯法對來自海黃瓜的79株共附生細菌的發(fā)酵產物進行抗甘蔗鞭黑粉菌活性測定，結果發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌屬細菌BGMRC03005對3種鞭黑粉菌形態(tài)均有抑制作用。李菲等（2018）利用牛津杯法對來自廣西斜陽島附近海域的24株海綿共附生細菌進行抑制甘蔗鞭黑粉菌活性篩選，發(fā)現(xiàn)有8株細菌的發(fā)酵粗提物對甘蔗鞭黑粉菌具有很強的抑菌活性，其中4株隸屬于芽孢桿菌屬。有些酶，如β-葡聚糖酶、幾丁質酶和分泌糖蛋白等是通過水解菌絲體細胞壁的一些成分來抑制甘蔗鞭黑粉菌冬孢子萌發(fā)。王竹青（2016）將甘蔗鞭黑粉菌接種在1個抗病品種（YZ03/258）和1個易染病品種（FN39）的蔗芽上，測定其在0～7 d的生理生化指標，結果發(fā)現(xiàn)兩個品種的過氧化物酶（POD）活性均持續(xù)上升，但抗病品種的POD活性比易染病品種的增幅大，表明POD有利于甘蔗抵抗黑粉菌的入侵。

本研究發(fā)現(xiàn)Bacillus sp. 108發(fā)酵代謝合成的24元大環(huán)內酯對甘蔗鞭黑粉菌具有良好的抑菌活性，且24元大環(huán)內酯濃度越高，對甘蔗鞭黑粉菌菌絲生長的抑制效果越強，EC50為157.94 μg/mL。在大環(huán)內酯類抗生素的生物合成中，內酯環(huán)是基于乙酸、丙酸和丁酸鹽等而形成。這意味著大環(huán)內酯類抗生素的生物合成重要前體是短鏈脂肪酸，但由于乙酸和丙酸等脂肪酸前體對菌絲體有一定的毒性，不利于菌體生長，因而限制了大環(huán)內酯類抗生素的生物合成。因此，本研究將乙酸鈉、丙酸鈉、正丙醇、異亮氨酸和纈氨酸作為外源性前體，在發(fā)酵過程中加入發(fā)酵培養(yǎng)基，使其參與24元大環(huán)內酯的生物合成，篩選出在發(fā)酵第96 h添加1.0%乙酸鈉是對Bacillus sp. 108發(fā)酵合成24元大環(huán)內酯具有促進作用的前體物質。這與多拉菌素（楊世紅等，2011）和阿維菌素（樊樂，2017）類大環(huán)內酯的生物合成途徑不完全相同，說明丙酸鹽類的前體物質并不一定都能提高24元大環(huán)內酯發(fā)酵效率。

本研究雖然通過外加前體物質提高了Bacillus sp. 108發(fā)酵產24元大環(huán)內酯產量，并通過觀察菌絲生長情況驗證其對甘蔗鞭黑粉菌的抑制作用，但其生產發(fā)酵仍停留在實驗室規(guī)模的基礎上。因此，在后續(xù)的研究中應通過研究Bacillus sp. 108發(fā)酵動力學，建立底物消耗與24元大環(huán)內酯物質合成及菌體生長的關系方程，通過改變底物濃度及控制菌體生長來提高24元大環(huán)內酯產量，還可以該產物的藥學性質為研究對象，為對甘蔗黑穗病有防治作用的新型生物農藥開發(fā)提供理論基礎。

4 結論

乙酸鈉作為前體對Bacillus sp. 108菌株發(fā)酵合成24元大環(huán)內酯的促進作用優(yōu)于丙酸鈉、正丙醇、異亮氨酸和纈氨酸，是較適宜的前體物質。對Bacillus sp. 108菌株發(fā)酵粗提物活性物質的進一步研究發(fā)現(xiàn)，24元大環(huán)內酯對甘蔗鞭黑粉菌菌絲生長有明顯的抑制作用，表明Bacillus sp. 108菌株具有開發(fā)成生物農藥用于防控甘蔗黑穗病的潛力。

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（責任編輯 麻小燕）