張清 桂萌 高亮 周康 李軍

摘要：【目的】?jī)?yōu)化落葵（Basella alba L.）種子蛋白提取工藝，并分析其抑菌和抗氧化特性，為開發(fā)利用落葵種子蛋白提供參考依據(jù)?！痉椒ā坎捎名}析法提取落葵種子蛋白，以大腸桿菌為指示菌，通過比較不同浸泡緩沖液、浸泡時(shí)間、料液比和硫酸銨飽和度提取蛋白的抑菌效果，選出影響較大的因素進(jìn)行正交試驗(yàn)從而確定最佳提取方案;通過牛津杯抑菌試驗(yàn)評(píng)價(jià)落葵種子蛋白對(duì)33株菌的抑菌效果，同時(shí)對(duì)其還原力及清除DPPH自由基能力進(jìn)行測(cè)定?！窘Y(jié)果】3個(gè)因素對(duì)落葵種子蛋白提取效果的影響排序?yàn)榱弦罕?gt;硫酸銨飽和度>浸泡時(shí)間;其最佳提取工藝為：浸泡時(shí)間14 h、料液比1∶8、硫酸銨飽和度95%，在此條件下提取物的蛋白含量可達(dá)33.00 mg/mL，大腸桿菌抑菌圈直徑為19.68 mm。落葵種子蛋白抑菌范圍較廣，對(duì)紅酵母、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌、藤黃球菌、副溶血性弧菌、假單胞菌、氣單胞菌、大腸桿菌等33株菌均具有良好的抑菌效果。落葵種子蛋白還原力測(cè)定的半最大效應(yīng)濃度（EC50）為4.867 mg/mL，對(duì)DPPH自由基清除率的半抑制濃度（IC50）為27.817 mg/mL?！窘Y(jié)論】落葵種子蛋白具有良好的抑菌效果和抗氧化特性，有作為天然抑菌劑和抗氧化劑的潛在價(jià)值。

關(guān)鍵詞： 落葵種子蛋白;單因素;正交試驗(yàn);提取工藝;抑菌;抗氧化

中圖分類號(hào)： S649? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2019）04-0816-09

Abstract：【Objective】The extraction technology of Basella alba L. seed protein was optimized， its bacteriostasis and antioxidant properties were analyzed. It provided theoretical basis for the development and utilization of B. alba seeds.【Method】Salting-out method was used to extract protein of B. alba seeds. Escherichia coli was used as indicator bacteria. The antimicrobial effect of protein extracted by different soaking buffers， soaking times， material-liquid ratios and ammonium sulfate saturation was compared， and the influencing factors were selected for orthogonal test to determine the best extraction scheme. Antimicrobial effect of B. alba seed protein against thirty-three strains of bacteria were tested in Oxford cup. The reducing power and DPPH free radicals scavenging ability were also studied. 【Result】Three prominent influen-cing factors were selected and their effects on B. alba seed protein extraction were： material-liquid ratio>saturation of ammonium sulfate>soaking time. The optimum extraction conditions were as follows： soaking time 14 h， ratio of material to liquid 1∶8 and saturation of ammonium sulfate 95%. Under such condition， the extracted protein content was 33.00 mg/mL and the diameter of the inhibition zone for E. coli was 19.68 mm.The inhibition zone of B. alba seed protein was large， it had fine inhibition effects against 33 strains of bacteria such as Rhodothece glutinis， Bacillus subtilis， Staphylococcus aureus， Listeria monocytogenes， Micrococcus luteus， Vibrio parahemolyticus， Pseudomonas aeruginosa， Aeromonas and E. coli. Half-maximal effect concentration（EC50） of B. alba seed protein reducing ability was 4.867 mg/mL， and its half-inhibitory concentration（IC50） against DPPH radical scavenging rate was 27.817 mg/mL. 【Conclusion】B. alba seed protein has fine antibacterial effect and antioxidant property， and has potential value as a natural antimicrobial and antioxidant.

Key words： seed protein of Basella alba L.; single factor; orthogonal test; extraction technique; bacteriostatic; antioxidation

0 引言

【研究意義】落葵（Basella alba L.）為落葵科落葵屬多年生蔓生肉質(zhì)藤本植物（趙金莉等，2011），其味道清香爽口，作為新型綠色健康蔬菜越來(lái)越受到人們喜愛。落葵營(yíng)養(yǎng)豐富，葉和莖均可食用，每1 kg可食部分含有蛋白質(zhì)17 g、脂肪2 g和碳水化合物31 g，同時(shí)含有豐富的鈣、磷、鐵等元素（盧毓星等，2005）。落葵全株可入藥，民間常用其治病或作食療，能清熱滑腸、涼血、解毒，主治大便秘結(jié)、小便短澀、痢疾便血等癥（彭會(huì)軍，2008）。落葵種子富含蛋白，李艷梅等（2011）采用堿溶酸沉法提取分離落葵種子蛋白，在優(yōu)化條件下得到蛋白質(zhì)提取率為82.15%。雖然落葵種子蛋白含量豐富，但未得到充分利用，為研究其潛在價(jià)值，本研究采用正交優(yōu)化法最大限度地提取落葵種子活性蛋白。植物源防腐劑是從植物的根、莖、葉和果實(shí)等提煉出的蛋白類、肽類、多糖類、黃酮類、多酚類、萜類、精油及植物自身成分的酶解產(chǎn)物等，具有一定的營(yíng)養(yǎng)保健價(jià)值，即發(fā)揮抑菌、抗菌和食品保鮮作用的同時(shí)，還具有抗氧化、降血脂、降血壓、預(yù)防腫瘤等疾病的保健功能（張媛媛等，2014）。落葵本身具有藥食同源性，具有研發(fā)成為天然抑菌劑和天然抗氧化劑的潛力，因此研究落葵種子蛋白的特性具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】關(guān)于植物蛋白特性的研究，主要包括抑菌和抗氧化兩方面。食品腐敗不僅降低食品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，還增加食源性疾病風(fēng)險(xiǎn)（張新武等，2014），目前食品防腐劑種類繁多，化學(xué)防腐劑是使用最廣泛的一種，但由于其對(duì)人體有一定的毒害作用，所以人們開始尋求天然食品防腐劑（肖素榮和李京東，2007;趙國(guó)萍等，2017）。王佐等（2002）分離純化得到色譜純的抗3型科薩奇病毒的苦瓜蛋白，通過體外抗病毒試驗(yàn)表明一定范圍內(nèi)的苦瓜蛋白對(duì)3型科薩奇病毒感染的HepG2細(xì)胞有明顯保護(hù)作用;李軍等（2018b）從蘿卜籽中分離得到一種抑菌蛋白，研究發(fā)現(xiàn)該蛋白對(duì)9株鱘魚腐敗菌均具有很好的抑制作用。目前工業(yè)上使用的抗氧化劑大多是合成型，雖然抗氧化效果好，但其安全性一直受到質(zhì)疑;天然抗氧化劑是從天然食品中提取的具有抗氧化活性的物質(zhì)，具有安全性高、抗氧化能力強(qiáng)、無(wú)副作用等特點(diǎn)（章林等，2012），如蓮子蛋白對(duì)羥基自由基具有較好的清除作用（張羽，2008）。關(guān)于落葵的研究目前主要集中在對(duì)落葵色素和多糖的研究，張美榮等（2010）對(duì)落葵果實(shí)中的色素提取工藝進(jìn)行優(yōu)化并研究其穩(wěn)定性;林愛琴（2010）研究表明落葵多糖具有清除自由基的作用;鄒群等（2011）研究發(fā)現(xiàn)落葵多糖有抑制腫瘤生長(zhǎng)和免疫調(diào)節(jié)功效;李小莉等（2012）研究表明落葵多糖對(duì)荷瘤小鼠的腫瘤生長(zhǎng)表現(xiàn)出顯著的抑制作用;Reshmi和Suganya（2012）采用瓊脂擴(kuò)散法將落葵果實(shí)甲醇提取物對(duì)枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、乳酸桿菌等多種微生物的抑菌范圍進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，落葵果實(shí)提取物具有良好的抑菌性能。【本研究切入點(diǎn)】目前對(duì)落葵種子蛋白的功能特性研究較少，針對(duì)落葵種子蛋白抑菌和抗氧化特性的研究也鮮見報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問題】通過硫酸銨沉淀、單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化提取落葵種子蛋白的工藝條件，并對(duì)其抑菌特性、DPPH自由基清除能力和還原力進(jìn)行研究，為開發(fā)利用落葵種子蛋白提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

落葵種子購(gòu)自北京市豐臺(tái)區(qū)新發(fā)地種子市場(chǎng)。紅酵母（Rhodothece glutinis）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aur-eus）、乳酸菌（Lactobacillus）、藤黃菌（Micrococcus luteus）、單增李斯特菌（Listeria monocytogenes）、副溶血性弧菌（Vibrio parahemolyticus）和河水細(xì)菌由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院提供，假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、腐敗希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）、氣單胞菌（Aeromonas）、大腸桿菌（Escheri-chia coli）和不動(dòng)桿菌（Acinetobacter sp.）為北京市水產(chǎn)科學(xué)研究所保藏并提供。平板計(jì)數(shù)瓊脂（PCA）培養(yǎng)基和3%氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司;硫酸銨、六氰合鐵酸鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、氯化鈉和瓊脂粉均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;Bradford蛋白質(zhì)定量試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司;2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT）和乙二胺四乙酸（EDTA）購(gòu)自索萊寶生物科技有限公司;DPPH自由基購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

主要儀器設(shè)備：冷凍離心機(jī)（美國(guó)Sigma公司）;全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（美國(guó)伯騰儀器有限公司）;4 ℃冰箱（青島海爾股份有限公司）;潔凈工作臺(tái)（北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司）;生化培養(yǎng)箱、恒溫水浴鍋（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）;全溫振蕩器（蘇州培英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）;微波爐（廣東美的廚房電器制造有限公司）。

1. 2 落葵種子蛋白提取物制備

采用硫酸銨沉淀法。將落葵種子磨成粉后（現(xiàn)磨現(xiàn)用，無(wú)需過篩，盡可能磨成細(xì)粉，便于落葵種子蛋白析出）與15 g/L EDTA緩沖液以1∶5（m/v）比例浸泡12 h，8層紗布過濾后取濾液于4 ℃下12000 r/min離心5 min，收集上清液，邊攪拌邊添加硫酸銨，使飽和度達(dá)80%，沉淀3 h后于4 ℃下12000 r/min離心20 min，收集沉淀，用去離子水復(fù)溶（每10 g落葵種子干粉蛋白提取物添加10 mL去離子水），4 ℃、12000 r/min離心20 min后收集上清液，0.22 μm水相濾膜過濾后4 ℃保存?zhèn)溆茫ɡ钴姷龋?018a）。

1. 3 落葵種子蛋白提取物含量測(cè)定

根據(jù)Bradford蛋白定量測(cè)定原理（Compton and Jones，1985）進(jìn)行。制備蛋白定量標(biāo)準(zhǔn)曲線，按照表1添加試劑于10 mL EP管中并混勻;搖勻后用96孔板分別在595 nm處測(cè)吸光值，記錄數(shù)據(jù)，以蛋白質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。取100 μL待測(cè)樣品加入3 mL Bradford蛋白定量測(cè)定試劑混勻后在595 nm處測(cè)吸光值，通過蛋白定量標(biāo)準(zhǔn)曲線可得知待測(cè)樣品的蛋白含量。

1. 4 落葵種子蛋白抑菌試驗(yàn)

真菌選取紅酵母;致病菌選取單增李斯特菌、藤黃球菌、金色葡萄球菌和副溶血性弧菌;腐敗菌選取大腸桿菌、假單胞菌、氣單胞菌、腐敗希瓦氏菌、枯草芽孢桿菌，以及從腐敗魚中篩選出的14株腐敗菌菌株和從河水中篩出的9種細(xì)菌，共33株菌進(jìn)行抑菌研究。除副溶血性弧菌外的其他菌株用PCA培養(yǎng)基活化后，用無(wú)菌生理鹽水稀釋至106 CFU/mL，取1 mL菌懸液置于10 mL PCA固體培養(yǎng)基中混勻凝固;副溶血性弧菌用10 mL 3%氯化鈉胰蛋白胨水稀釋至106 CFU/mL，取1 mL置于10 mL 3%氯化鈉胰蛋白胨瓊脂固體培養(yǎng)基中混勻凝固，凝固的平板用牛津杯（外徑8 mm、內(nèi)徑6 mm、高10 mm）進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，每個(gè)牛津杯中加入200 μL落葵種子蛋白提取物（用無(wú)菌超純水將1.3測(cè)得的落葵種子蛋白提取物濃度稀釋至30.00 mg/mL），37 ℃培養(yǎng)18～24 h后觀察抑菌圈直徑，每組3個(gè)平行。

1. 5 落葵種子蛋白提取工藝優(yōu)化

1. 5. 1 單因素試驗(yàn)

1. 5. 1. 1 浸泡緩沖液選擇 選擇4種緩沖液[硼酸鈉緩沖液（0.05 mol/L，pH 8.2）、磷酸緩沖液（0.1 mol/L KCl，2 mmol/L EDTA，pH 7.5）、Tris-HCl緩沖液（0.05 mol/L，pH 8.0）和EDTA緩沖液（15 g/L，pH 8.0）]對(duì)落葵種子蛋白進(jìn)行浸提，比較提取效果。以大腸桿菌（濃度106 CFU/mL）為指示菌株，取1 mL菌懸液置于無(wú)菌培養(yǎng)皿中，加入10 mL適溫PCA固體培養(yǎng)基混勻靜置，待其凝固后放入牛津杯，再取200 μL落葵種子蛋白提取物加入牛津杯中，37 ℃培養(yǎng)18～24 h，通過觀察抑菌圈選擇適宜的緩沖液，每組試驗(yàn)3個(gè)平行。

1. 5. 1. 2 浸泡時(shí)間選擇 用最佳浸泡緩沖液分別浸泡落葵種子粉末4、8、12、16、20和24 h，按照1.2操作得到蛋白提取物后，以大腸桿菌（106 CFU/mL）為指示菌株，取200 μL落葵種子蛋白提取物加入牛津杯中，37 ℃培養(yǎng)18～24 h，觀察抑菌圈。每組試驗(yàn)3個(gè)平行。

1. 5. 1. 3 料液比選擇 將落葵種子粉末與緩沖液以1∶3、1∶5、1∶7、1∶9、1∶11和1∶12（w/v）的比例浸泡合適時(shí)間，按照1.2操作得到蛋白提取物后，以大腸桿菌（106 CFU/mL）為指示菌株，取200 μL落葵種子蛋白提取物加入牛津杯中，37 ℃培養(yǎng)18～24 h，觀察抑菌圈。每組試驗(yàn)3個(gè)平行。

1. 5. 1. 4 硫酸銨飽和度選擇 稱取80 g落葵種子粉末，加入560 mL EDTA緩沖液浸泡12 h后紗布過濾，4 ℃下12000 r/min離心5 min，取上清液分為8份，每份30 mL，分別添加硫酸銨4.92、6.78、8.73、10.83、13.08、15.48、18.09和20.91 g（對(duì)應(yīng)飽和度分別為30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%和100%）沉淀落葵種子蛋白。后續(xù)步驟按照1.2操作，并將不同硫酸銨飽和度沉淀的落葵蛋白提取物以大腸桿菌（106 CFU/mL）為指示菌株測(cè)抑菌效果。每組試驗(yàn)3個(gè)平行。

1. 5. 2 正交優(yōu)化試驗(yàn) 以對(duì)大腸桿菌的抑菌圈為篩選指標(biāo)，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果選取浸泡時(shí)間、料液比和硫酸銨飽和度進(jìn)行正交試驗(yàn)，因素及水平設(shè)計(jì)見表2。

1. 6 落葵種子蛋白提取物還原力測(cè)定

取1 mL不同質(zhì)量濃度樣液，與1 mL 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.6）和1 mL 1.0%六氰合鐵酸鉀溶液混合，在50 ℃下水浴20 min后快速冷卻，然后在反應(yīng)混合物中加入1 mL 10%三氯乙酸，放置10 min，待反應(yīng)充分后6000 r/min離心10 min，取上清1 mL，加入1 mL蒸餾水和0.2 mL 0.1%三氯化鐵溶液，充分混勻，室溫靜置10 min后在700 nm處測(cè)吸光值（吸光值的增加代表反應(yīng)混合物還原力增強(qiáng)，樣品的抗氧化活性增加），以維生素C為陽(yáng)性對(duì)照。得吸光值在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)的線性回歸方程，通過回歸方程計(jì)算半最大效應(yīng)濃度EC50（吸光值為0.5時(shí)對(duì)應(yīng)的樣液質(zhì)量濃度）。EC50越小，表明其還原力越強(qiáng)，抗氧化活性越強(qiáng)（孟德敬等，2007;王雅，2012;Zhang et al.，2017）。

1. 7 落葵種子蛋白提取物對(duì)DPPH自由基清除能力測(cè)定

1. 7. 1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 準(zhǔn)確稱取DPPH自由基1 mg，用乙醇定容至10 mL，配制成質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液（現(xiàn)用現(xiàn)配）。分別吸取0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，用乙醇定容至5 mL，最終質(zhì)量濃度分別為0、2、4、8、12、16和20 μg/mL。測(cè)定上述標(biāo)準(zhǔn)溶液在517 nm波長(zhǎng)處的吸光值，以不同質(zhì)量濃度DPPH自由基為橫坐標(biāo)、吸光值為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1. 7. 2 樣品測(cè)定 0.25 mL不同質(zhì)量濃度落葵蛋白提取物與0.25 mL 0.1 mmol/L DPPH（溶解于95%乙醇中）混合后振蕩，室溫下避光反應(yīng)30 min。若有沉淀，6400 g離心3 min，取200 μL上清液加到96孔板中，517 nm測(cè)定吸光值。對(duì)照組用0.25 mL蒸餾水替代樣品，BHT（200 μg/mL）作陽(yáng)性對(duì)照（Enujiugha et al.，2012）。按照下式計(jì)算落葵種子蛋白提取物對(duì)DPPH自由基的清除率（曹輝等，2009）：

DPPH自由基清除率（%）=[1-（Ai-Aj）/A0]×100

式中，Ai為加入蛋白樣品與DPPH反應(yīng)后517 nm處吸光值，Aj為加入蛋白樣品與無(wú)水乙醇混合后517 nm處吸光值，A0為不加蛋白樣品時(shí)測(cè)得DPPH 517 nm的吸光值。

半抑制濃度（IC50）為DPPH自由基清除率等于50%時(shí)添加落葵種子提取物的質(zhì)量濃度。

1. 8 統(tǒng)計(jì)分析

所有試驗(yàn)均重復(fù)3次。采用SPSS 17.0的One-way ANOVA進(jìn)行方差分析，Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 落葵種子蛋白提取物的蛋白含量測(cè)定結(jié)果

落葵種子蛋白提取物溶液中蛋白質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.3135x+0.3482（R2=0.9913）。經(jīng)測(cè)定，落葵種子硫酸銨沉淀蛋白提取物溶液中蛋白質(zhì)量濃度為32.30 mg/mL。

2. 2 落葵種子蛋白提取優(yōu)化結(jié)果

2. 2. 1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2. 2. 1. 1 浸泡緩沖液優(yōu)化 由圖1可知，采用硼酸鈉緩沖液、磷酸緩沖液、Tris-HCl緩沖液和EDTA緩沖液提取的落葵種子蛋白含量分別為36.20、36.58、34.30和36.17 mg/mL，其中Tris-HCl緩沖液浸提的蛋白含量顯著低于其他3種緩沖液浸提的蛋白含量（P<0.05，下同），其他三者間差異不顯著（P>0.05，下同）。將4種不同處理后的落葵種子蛋白（統(tǒng)一稀釋到30.00 mg/mL）對(duì)大腸桿菌進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，結(jié)果顯示，只有EDTA緩沖液浸提的落葵種子蛋白具有抑菌效果，對(duì)大腸DH5α的抑菌圈直徑為17.02 mm。原因可能是硼酸鈉緩沖液、磷酸緩沖液和Tris-HCl緩沖液對(duì)落葵蛋白中的有效抑菌活性蛋白結(jié)構(gòu)造成破壞或使蛋白發(fā)生降解（古卓良等，2003）。與其他3種緩沖液相比，EDTA緩沖液較溫和，能保留有效抑菌蛋白，其浸提出的蛋白具有最佳的抑菌效果，故選擇EDTA作為浸提緩沖液進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2. 2. 1. 2 浸泡時(shí)間優(yōu)化 由圖2可看出，在浸泡時(shí)間4～8 h范圍內(nèi)，落葵種子蛋白對(duì)指示菌株大腸桿菌的抑菌圈直徑差異不顯著，浸泡12 h的抑菌圈直徑顯著增大（17.53 mm），抑菌效果最佳;然而隨著浸泡時(shí)間的繼續(xù)延長(zhǎng)，抑菌效果顯著下降。可能是由于緩沖液中可溶性雜質(zhì)多，導(dǎo)致有效蛋白沉降。因此，選擇10、12和14 h 3個(gè)水平進(jìn)行正交優(yōu)化試驗(yàn)。

2. 2. 1. 3 料液比優(yōu)化 從圖3可看出，在料液比1∶3～1∶7范圍內(nèi)，抑菌圈直徑顯著增大，在1∶7～1∶12范圍內(nèi)抑菌圈直徑均在17.00 mm左右，4個(gè)水平間差異不顯著。適當(dāng)減小料液比，有利于有效抑菌蛋白質(zhì)的充分溶出，而使提取率提高（周麗卿，2012）;但料液比過小，蛋白質(zhì)分子與水分子間的相互作用增強(qiáng)，使得蛋白質(zhì)分子易發(fā)生作用而沉淀。從經(jīng)濟(jì)效益角度考慮，選擇料液比1∶7進(jìn)行蛋白提取，得到的蛋白對(duì)大腸桿菌抑菌圈直徑為17.86 mm，抑菌效果較好。因此，選擇1∶6、1∶7和1∶8 3個(gè)水平進(jìn)行正交優(yōu)化試驗(yàn)。

2. 2. 1. 4 硫酸銨飽和度優(yōu)化 由圖4可知，硫酸銨飽和度在30%～40%范圍內(nèi)時(shí)抑菌圈從無(wú)到有，飽和度在50%～70%時(shí)抑菌圈直徑顯著增大，在70%～80%時(shí)抑菌圈直徑緩慢增大;當(dāng)硫酸銨飽和度為90%時(shí)，抑菌蛋白對(duì)大腸桿菌的抑菌圈直徑達(dá)18.51 mm，顯著大于其他飽和度的抑菌圈直徑。表明抑菌蛋白在90%硫酸銨飽和度時(shí)沉淀最多，且相對(duì)100%硫酸銨沉淀更節(jié)約成本，故選取90%飽和度硫酸銨作為蛋白沉淀?xiàng)l件，選擇85%、90%和95% 3個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2. 2. 2 正交試驗(yàn)結(jié)果 由單因素試驗(yàn)結(jié)果可知，落葵種子蛋白對(duì)大腸桿菌的抑菌效果受浸泡時(shí)間、料液比和硫酸銨飽和度影響明顯，故選擇這3個(gè)因素采用正交試驗(yàn)3因素3水平表優(yōu)化落葵種子蛋白的提取工藝。由表3可知，在浸泡時(shí)間（因素A）中K3>K1>K2，料液比（因素B）中K3>K2>K1，硫酸銨飽和度（因素C）中K3>K2>K1，得出最優(yōu)組合為A3B3C3（以大腸DH5α為指示菌株，抑菌圈直徑大為選取條件），即浸泡時(shí)間為14 h、料液比為1∶8、硫酸銨飽和度為95%;由表3中R可知影響落葵種子蛋白提取因素的主次排序?yàn)榱弦罕?gt;硫酸銨飽和度>浸泡時(shí)間。以最優(yōu)方案進(jìn)行提取，重復(fù)試驗(yàn)3次，得到的蛋白含量為33.00 mg/mL，對(duì)大腸桿菌的抑菌圈直徑為19.68 mm。正交試驗(yàn)結(jié)果大于其他水平值，說明正交試驗(yàn)優(yōu)化提取落葵種子蛋白工藝可行。

2. 3 落葵種子蛋白抑菌結(jié)果

由表4可知，通過EDTA緩沖液浸提，95%飽和硫酸銨沉淀的落葵種子蛋白提取物（30.00 mg/mL）對(duì)真菌具有抑菌作用，以紅酵母為代表，其抑菌圈直徑為24.59 mm;對(duì)致病菌金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌、藤黃球菌和副溶血性弧菌均有抑菌作用，其抑菌圈直徑分別為19.60、26.27、25.98和15.24 mm;對(duì)腐敗菌也有抑菌作用，如腐敗希瓦氏菌和假單胞菌，其抑菌直徑分別為28.01和30.32 mm。表4中菌株除常見的食源性致病菌和肉類腐敗菌外，還有來(lái)自河水中的9株細(xì)菌，這些細(xì)菌隨水附著在魚體表面，當(dāng)魚類失去生命時(shí)，具有潛在致腐的可能，因此控制這些細(xì)菌能降低潛在致腐風(fēng)險(xiǎn)。落葵種子蛋白對(duì)Bacillus velezensis具有最大抑菌圈直徑（39.77 mm），對(duì)氣單胞屬中的Aeromonas allosaccharophila strain S5-33菌株具有最小抑菌圈直徑（14.06 mm），對(duì)大腸桿菌DH5α抑菌直徑為17.00 mm。落葵種子蛋白對(duì)這些腐敗致病菌均具有良好的抑菌效果。

2. 4 落葵種子蛋白提取物還原力測(cè)定結(jié)果

落葵種子蛋白提取物還原性測(cè)定如圖5所示，吸光值隨蛋白質(zhì)量濃度的增加而增加，根據(jù)吸光值與蛋白質(zhì)量濃度的關(guān)系得出線性回歸方程y=0.1324x-0.1444，R2=0.9918。當(dāng)吸光值為0.5時(shí)對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)量濃度為4.867 mg/mL，即為EC50。

2. 5 落葵種子蛋白提取物對(duì)DPPH自由基清除能力測(cè)定結(jié)果

以不同質(zhì)量濃度DPPH自由基為橫坐標(biāo)、517 nm處吸光值為縱坐標(biāo)，制得標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.0076x+0.0408，R2=0.9994。

加樣質(zhì)量濃度與DPPH自由基清除率關(guān)系方程為y=1.6317x+8.4665，R2=0.9854，如圖6所示。根據(jù)方程推算出當(dāng)DPPH自由基殘留率為50%時(shí)，IC50為27.817 mg/mL。落葵種子蛋白提取物對(duì)DPPH自由基的清除能力隨著蛋白質(zhì)量濃度（一定范圍內(nèi)）的增加而增強(qiáng)。

3 討論

本研究采用硫酸銨沉淀鹽析法對(duì)落葵種子蛋白進(jìn)行提取，該方法是從粗制劑中濃縮和純化蛋白的經(jīng)典方法，能更好地保留蛋白活性。在提取過程中，蛋白大部分通過硫酸銨沉淀，用去離子水溶解沉淀后再次離心，此時(shí)糖類、脂類等雜質(zhì)基本在沉淀中，而蛋白基本溶解出來(lái)。能否最大限度地提取落葵種子中的活性蛋白，單因素優(yōu)化條件十分關(guān)鍵，不同的浸泡緩沖液對(duì)蛋白析出率和蛋白活性影響不同（Li et al.，2016）。本研究比較磷酸緩沖液、EDTA緩沖液、硼酸鈉緩沖液和Tris-HCl緩沖液對(duì)落葵種子蛋白浸提的效果，結(jié)果顯示，除Tris-HCl緩沖液浸提出的落葵種子蛋白含量稍低外，其他3種緩沖液浸提蛋白析出含量差異不顯著;將4種緩沖液浸提的落葵種子蛋白提取物用無(wú)菌超純水稀釋至30.00 mg/mL進(jìn)行大腸桿菌抑菌試驗(yàn)，結(jié)果顯示只有EDTA緩沖液浸提的蛋白具有抑菌活性，說明不同的浸泡緩沖液對(duì)蛋白活性影響明顯。

落葵種子中蛋白質(zhì)含量豐富，本研究利用Bradford蛋白定量測(cè)定法測(cè)得落葵種子蛋白提取物的蛋白含量為32.30 mg/mL。李艷梅等（2011）采用堿溶酸沉法提取分離落葵種子蛋白，其提取率達(dá)82.15%，但并未對(duì)提取的粗蛋白進(jìn)行深入研究。本研究對(duì)落葵種子蛋白提取物的特性進(jìn)行分析，在硫酸銨飽和度80%～100%沉淀出的落葵種子蛋白提取物抑菌效果較好;此外，本研究還發(fā)現(xiàn)落葵種子蛋白提取物在pH 8.0左右抑菌特性消失，可能是蛋白等電點(diǎn)導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性或聚沉，溫度高于80 ℃時(shí)抑菌活性顯著下降，進(jìn)一步說明起抑菌作用的是蛋白類而非糖類等其他物質(zhì)。Reshmi和Suganya（2012）發(fā)現(xiàn)落葵果實(shí)甲醇提取物抑菌效果好，本研究也發(fā)現(xiàn)落葵種子蛋白提取物具有抑菌作用。落葵種子蛋白提取物對(duì)試驗(yàn)中的33株菌的抑菌圈直徑為14.06～39.77 mm，抑菌效果優(yōu)于苦瓜蛋白對(duì)枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和酵母的抑菌效果（抑菌圈直徑分別為15.0、14.5、13.5和1.02 mm）（于群和朱新產(chǎn)，2012）;優(yōu)于苦蕎蛋白對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果（抑菌圈直徑分別為12.8和13.2 mm）（陳英嬌，2015）;也優(yōu)于紫菜蛋白對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果（抑菌圈直徑為18.70 mm）（宋惠平等，2015）。綜上所述，落葵種子蛋白對(duì)真菌、致病菌和腐敗菌均具有良好的抑制作用，作為食品防腐抑菌劑具有廣闊的發(fā)展前景。

落葵種子還原力的測(cè)定中，隨著有效活性蛋白質(zhì)量濃度的增加，還原力不斷增強(qiáng)，在吸光值0.5時(shí)其EC50為4.867 mg/mL，說明落葵種子蛋白有很強(qiáng)的抗氧化能力。彭會(huì)軍（2008）測(cè)得落葵多糖對(duì)超氧自由基和羥基自由基的最大清除率分別為54.32%和52.94%，研究發(fā)現(xiàn)落葵中提取的活性物質(zhì)可能為糖蛋白或蛋白多糖。這與本研究得出落葵種子蛋白提取物具有抗氧化作用的結(jié)論相符。落葵種子蛋白提取物還原能力測(cè)定的EC50為4.867 mg/mL，優(yōu)于青刺果果實(shí)的還原力（EC50為24.7 mg/mL）（張瑞琳等，2017）;同時(shí)落葵種子蛋白提取物對(duì)DPPH自由基清除能力的IC50為27.817 mg/mL，優(yōu)于葡萄籽原花青素清除DPPH自由基能力，其清除DPPH自由基（2.5×10-2 mg/mL）的IC50為118 g/kg（李春陽(yáng)等，2006）。本研究對(duì)落葵種子中粗蛋白進(jìn)行了初步分析，但落葵種子蛋白粗提物中活性成分可能是一種或幾種蛋白的混合物或多肽，后續(xù)試驗(yàn)將對(duì)蛋白提取物進(jìn)行純化和質(zhì)譜鑒定。此外，關(guān)于落葵種子蛋白是否具有抗腫瘤、降血糖、降膽固醇等功效，其理化性質(zhì)及在食品保鮮上的應(yīng)用等均有待后續(xù)研究。

4 結(jié)論

落葵種子蛋白在EDTA緩沖液中可浸提出有效抑菌蛋白，最佳提取工藝為浸泡時(shí)間14 h、料液比1∶8、硫酸銨飽和度95%;落葵種子蛋白對(duì)1株真菌、4株致病菌和28株腐敗菌均有較好的抑菌效果，對(duì)DPPH自由基清除效果良好，且抗氧化活性強(qiáng)。落葵種子蛋白具有開發(fā)為天然防腐抑菌劑和抗氧化劑的潛在價(jià)值。

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（責(zé)任編輯 羅 麗）

0 引言

【研究意義】落葵（Basella alba L.）為落葵科落葵屬多年生蔓生肉質(zhì)藤本植物（趙金莉等，2011），其味道清香爽口，作為新型綠色健康蔬菜越來(lái)越受到人們喜愛。落葵營(yíng)養(yǎng)豐富，葉和莖均可食用，每1 kg可食部分含有蛋白質(zhì)17 g、脂肪2 g和碳水化合物31 g，同時(shí)含有豐富的鈣、磷、鐵等元素（盧毓星等，2005）。落葵全株可入藥，民間常用其治病或作食療，能清熱滑腸、涼血、解毒，主治大便秘結(jié)、小便短澀、痢疾便血等癥（彭會(huì)軍，2008）。落葵種子富含蛋白，李艷梅等（2011）采用堿溶酸沉法提取分離落葵種子蛋白，在優(yōu)化條件下得到蛋白質(zhì)提取率為82.15%。雖然落葵種子蛋白含量豐富，但未得到充分利用，為研究其潛在價(jià)值，本研究采用正交優(yōu)化法最大限度地提取落葵種子活性蛋白。植物源防腐劑是從植物的根、莖、葉和果實(shí)等提煉出的蛋白類、肽類、多糖類、黃酮類、多酚類、萜類、精油及植物自身成分的酶解產(chǎn)物等，具有一定的營(yíng)養(yǎng)保健價(jià)值，即發(fā)揮抑菌、抗菌和食品保鮮作用的同時(shí)，還具有抗氧化、降血脂、降血壓、預(yù)防腫瘤等疾病的保健功能（張媛媛等，2014）。落葵本身具有藥食同源性，具有研發(fā)成為天然抑菌劑和天然抗氧化劑的潛力，因此研究落葵種子蛋白的特性具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】關(guān)于植物蛋白特性的研究，主要包括抑菌和抗氧化兩方面。食品腐敗不僅降低食品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，還增加食源性疾病風(fēng)險(xiǎn)（張新武等，2014），目前食品防腐劑種類繁多，化學(xué)防腐劑是使用最廣泛的一種，但由于其對(duì)人體有一定的毒害作用，所以人們開始尋求天然食品防腐劑（肖素榮和李京東，2007;趙國(guó)萍等，2017）。王佐等（2002）分離純化得到色譜純的抗3型科薩奇病毒的苦瓜蛋白，通過體外抗病毒試驗(yàn)表明一定范圍內(nèi)的苦瓜蛋白對(duì)3型科薩奇病毒感染的HepG2細(xì)胞有明顯保護(hù)作用;李軍等（2018b）從蘿卜籽中分離得到一種抑菌蛋白，研究發(fā)現(xiàn)該蛋白對(duì)9株鱘魚腐敗菌均具有很好的抑制作用。目前工業(yè)上使用的抗氧化劑大多是合成型，雖然抗氧化效果好，但其安全性一直受到質(zhì)疑;天然抗氧化劑是從天然食品中提取的具有抗氧化活性的物質(zhì)，具有安全性高、抗氧化能力強(qiáng)、無(wú)副作用等特點(diǎn)（章林等，2012），如蓮子蛋白對(duì)羥基自由基具有較好的清除作用（張羽，2008）。關(guān)于落葵的研究目前主要集中在對(duì)落葵色素和多糖的研究，張美榮等（2010）對(duì)落葵果實(shí)中的色素提取工藝進(jìn)行優(yōu)化并研究其穩(wěn)定性;林愛琴（2010）研究表明落葵多糖具有清除自由基的作用;鄒群等（2011）研究發(fā)現(xiàn)落葵多糖有抑制腫瘤生長(zhǎng)和免疫調(diào)節(jié)功效;李小莉等（2012）研究表明落葵多糖對(duì)荷瘤小鼠的腫瘤生長(zhǎng)表現(xiàn)出顯著的抑制作用;Reshmi和Suganya（2012）采用瓊脂擴(kuò)散法將落葵果實(shí)甲醇提取物對(duì)枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、乳酸桿菌等多種微生物的抑菌范圍進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，落葵果實(shí)提取物具有良好的抑菌性能?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前對(duì)落葵種子蛋白的功能特性研究較少，針對(duì)落葵種子蛋白抑菌和抗氧化特性的研究也鮮見報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過硫酸銨沉淀、單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化提取落葵種子蛋白的工藝條件，并對(duì)其抑菌特性、DPPH自由基清除能力和還原力進(jìn)行研究，為開發(fā)利用落葵種子蛋白提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

落葵種子購(gòu)自北京市豐臺(tái)區(qū)新發(fā)地種子市場(chǎng)。紅酵母（Rhodothece glutinis）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aur-eus）、乳酸菌（Lactobacillus）、藤黃菌（Micrococcus luteus）、單增李斯特菌（Listeria monocytogenes）、副溶血性弧菌（Vibrio parahemolyticus）和河水細(xì)菌由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院提供，假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、腐敗希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）、氣單胞菌（Aeromonas）、大腸桿菌（Escheri-chia coli）和不動(dòng)桿菌（Acinetobacter sp.）為北京市水產(chǎn)科學(xué)研究所保藏并提供。平板計(jì)數(shù)瓊脂（PCA）培養(yǎng)基和3%氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司;硫酸銨、六氰合鐵酸鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、氯化鈉和瓊脂粉均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;Bradford蛋白質(zhì)定量試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司;2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT）和乙二胺四乙酸（EDTA）購(gòu)自索萊寶生物科技有限公司;DPPH自由基購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

主要儀器設(shè)備：冷凍離心機(jī)（美國(guó)Sigma公司）;全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（美國(guó)伯騰儀器有限公司）;4 ℃冰箱（青島海爾股份有限公司）;潔凈工作臺(tái)（北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司）;生化培養(yǎng)箱、恒溫水浴鍋（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）;全溫振蕩器（蘇州培英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）;微波爐（廣東美的廚房電器制造有限公司）。

1. 2 落葵種子蛋白提取物制備

采用硫酸銨沉淀法。將落葵種子磨成粉后（現(xiàn)磨現(xiàn)用，無(wú)需過篩，盡可能磨成細(xì)粉，便于落葵種子蛋白析出）與15 g/L EDTA緩沖液以1∶5（m/v）比例浸泡12 h，8層紗布過濾后取濾液于4 ℃下12000 r/min離心5 min，收集上清液，邊攪拌邊添加硫酸銨，使飽和度達(dá)80%，沉淀3 h后于4 ℃下12000 r/min離心20 min，收集沉淀，用去離子水復(fù)溶（每10 g落葵種子干粉蛋白提取物添加10 mL去離子水），4 ℃、12000 r/min離心20 min后收集上清液，0.22 μm水相濾膜過濾后4 ℃保存?zhèn)溆茫ɡ钴姷龋?018a）。

1. 3 落葵種子蛋白提取物含量測(cè)定

根據(jù)Bradford蛋白定量測(cè)定原理（Compton and Jones，1985）進(jìn)行。制備蛋白定量標(biāo)準(zhǔn)曲線，按照表1添加試劑于10 mL EP管中并混勻;搖勻后用96孔板分別在595 nm處測(cè)吸光值，記錄數(shù)據(jù)，以蛋白質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。取100 μL待測(cè)樣品加入3 mL Bradford蛋白定量測(cè)定試劑混勻后在595 nm處測(cè)吸光值，通過蛋白定量標(biāo)準(zhǔn)曲線可得知待測(cè)樣品的蛋白含量。

1. 4 落葵種子蛋白抑菌試驗(yàn)

真菌選取紅酵母;致病菌選取單增李斯特菌、藤黃球菌、金色葡萄球菌和副溶血性弧菌;腐敗菌選取大腸桿菌、假單胞菌、氣單胞菌、腐敗希瓦氏菌、枯草芽孢桿菌，以及從腐敗魚中篩選出的14株腐敗菌菌株和從河水中篩出的9種細(xì)菌，共33株菌進(jìn)行抑菌研究。除副溶血性弧菌外的其他菌株用PCA培養(yǎng)基活化后，用無(wú)菌生理鹽水稀釋至106 CFU/mL，取1 mL菌懸液置于10 mL PCA固體培養(yǎng)基中混勻凝固;副溶血性弧菌用10 mL 3%氯化鈉胰蛋白胨水稀釋至106 CFU/mL，取1 mL置于10 mL 3%氯化鈉胰蛋白胨瓊脂固體培養(yǎng)基中混勻凝固，凝固的平板用牛津杯（外徑8 mm、內(nèi)徑6 mm、高10 mm）進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，每個(gè)牛津杯中加入200 μL落葵種子蛋白提取物（用無(wú)菌超純水將1.3測(cè)得的落葵種子蛋白提取物濃度稀釋至30.00 mg/mL），37 ℃培養(yǎng)18～24 h后觀察抑菌圈直徑，每組3個(gè)平行。

1. 5 落葵種子蛋白提取工藝優(yōu)化

1. 5. 1 單因素試驗(yàn)

1. 5. 1. 1 浸泡緩沖液選擇 選擇4種緩沖液[硼酸鈉緩沖液（0.05 mol/L，pH 8.2）、磷酸緩沖液（0.1 mol/L KCl，2 mmol/L EDTA，pH 7.5）、Tris-HCl緩沖液（0.05 mol/L，pH 8.0）和EDTA緩沖液（15 g/L，pH 8.0）]對(duì)落葵種子蛋白進(jìn)行浸提，比較提取效果。以大腸桿菌（濃度106 CFU/mL）為指示菌株，取1 mL菌懸液置于無(wú)菌培養(yǎng)皿中，加入10 mL適溫PCA固體培養(yǎng)基混勻靜置，待其凝固后放入牛津杯，再取200 μL落葵種子蛋白提取物加入牛津杯中，37 ℃培養(yǎng)18～24 h，通過觀察抑菌圈選擇適宜的緩沖液，每組試驗(yàn)3個(gè)平行。

1. 5. 1. 2 浸泡時(shí)間選擇 用最佳浸泡緩沖液分別浸泡落葵種子粉末4、8、12、16、20和24 h，按照1.2操作得到蛋白提取物后，以大腸桿菌（106 CFU/mL）為指示菌株，取200 μL落葵種子蛋白提取物加入牛津杯中，37 ℃培養(yǎng)18～24 h，觀察抑菌圈。每組試驗(yàn)3個(gè)平行。

1. 5. 1. 3 料液比選擇 將落葵種子粉末與緩沖液以1∶3、1∶5、1∶7、1∶9、1∶11和1∶12（w/v）的比例浸泡合適時(shí)間，按照1.2操作得到蛋白提取物后，以大腸桿菌（106 CFU/mL）為指示菌株，取200 μL落葵種子蛋白提取物加入牛津杯中，37 ℃培養(yǎng)18～24 h，觀察抑菌圈。每組試驗(yàn)3個(gè)平行。

1. 5. 1. 4 硫酸銨飽和度選擇 稱取80 g落葵種子粉末，加入560 mL EDTA緩沖液浸泡12 h后紗布過濾，4 ℃下12000 r/min離心5 min，取上清液分為8份，每份30 mL，分別添加硫酸銨4.92、6.78、8.73、10.83、13.08、15.48、18.09和20.91 g（對(duì)應(yīng)飽和度分別為30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%和100%）沉淀落葵種子蛋白。后續(xù)步驟按照1.2操作，并將不同硫酸銨飽和度沉淀的落葵蛋白提取物以大腸桿菌（106 CFU/mL）為指示菌株測(cè)抑菌效果。每組試驗(yàn)3個(gè)平行。

1. 5. 2 正交優(yōu)化試驗(yàn) 以對(duì)大腸桿菌的抑菌圈為篩選指標(biāo)，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果選取浸泡時(shí)間、料液比和硫酸銨飽和度進(jìn)行正交試驗(yàn)，因素及水平設(shè)計(jì)見表2。

1. 6 落葵種子蛋白提取物還原力測(cè)定

取1 mL不同質(zhì)量濃度樣液，與1 mL 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.6）和1 mL 1.0%六氰合鐵酸鉀溶液混合，在50 ℃下水浴20 min后快速冷卻，然后在反應(yīng)混合物中加入1 mL 10%三氯乙酸，放置10 min，待反應(yīng)充分后6000 r/min離心10 min，取上清1 mL，加入1 mL蒸餾水和0.2 mL 0.1%三氯化鐵溶液，充分混勻，室溫靜置10 min后在700 nm處測(cè)吸光值（吸光值的增加代表反應(yīng)混合物還原力增強(qiáng)，樣品的抗氧化活性增加），以維生素C為陽(yáng)性對(duì)照。得吸光值在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)的線性回歸方程，通過回歸方程計(jì)算半最大效應(yīng)濃度EC50（吸光值為0.5時(shí)對(duì)應(yīng)的樣液質(zhì)量濃度）。EC50越小，表明其還原力越強(qiáng)，抗氧化活性越強(qiáng)（孟德敬等，2007;王雅，2012;Zhang et al.，2017）。

1. 7 落葵種子蛋白提取物對(duì)DPPH自由基清除能力測(cè)定

1. 7. 1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 準(zhǔn)確稱取DPPH自由基1 mg，用乙醇定容至10 mL，配制成質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液（現(xiàn)用現(xiàn)配）。分別吸取0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，用乙醇定容至5 mL，最終質(zhì)量濃度分別為0、2、4、8、12、16和20 μg/mL。測(cè)定上述標(biāo)準(zhǔn)溶液在517 nm波長(zhǎng)處的吸光值，以不同質(zhì)量濃度DPPH自由基為橫坐標(biāo)、吸光值為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1. 7. 2 樣品測(cè)定 0.25 mL不同質(zhì)量濃度落葵蛋白提取物與0.25 mL 0.1 mmol/L DPPH（溶解于95%乙醇中）混合后振蕩，室溫下避光反應(yīng)30 min。若有沉淀，6400 g離心3 min，取200 μL上清液加到96孔板中，517 nm測(cè)定吸光值。對(duì)照組用0.25 mL蒸餾水替代樣品，BHT（200 μg/mL）作陽(yáng)性對(duì)照（Enujiugha et al.，2012）。按照下式計(jì)算落葵種子蛋白提取物對(duì)DPPH自由基的清除率（曹輝等，2009）：

DPPH自由基清除率（%）=[1-（Ai-Aj）/A0]×100

式中，Ai為加入蛋白樣品與DPPH反應(yīng)后517 nm處吸光值，Aj為加入蛋白樣品與無(wú)水乙醇混合后517 nm處吸光值，A0為不加蛋白樣品時(shí)測(cè)得DPPH 517 nm的吸光值。

半抑制濃度（IC50）為DPPH自由基清除率等于50%時(shí)添加落葵種子提取物的質(zhì)量濃度。

1. 8 統(tǒng)計(jì)分析

所有試驗(yàn)均重復(fù)3次。采用SPSS 17.0的One-way ANOVA進(jìn)行方差分析，Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 落葵種子蛋白提取物的蛋白含量測(cè)定結(jié)果

落葵種子蛋白提取物溶液中蛋白質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.3135x+0.3482（R2=0.9913）。經(jīng)測(cè)定，落葵種子硫酸銨沉淀蛋白提取物溶液中蛋白質(zhì)量濃度為32.30 mg/mL。

2. 2 落葵種子蛋白提取優(yōu)化結(jié)果

2. 2. 1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2. 2. 1. 1 浸泡緩沖液優(yōu)化 由圖1可知，采用硼酸鈉緩沖液、磷酸緩沖液、Tris-HCl緩沖液和EDTA緩沖液提取的落葵種子蛋白含量分別為36.20、36.58、34.30和36.17 mg/mL，其中Tris-HCl緩沖液浸提的蛋白含量顯著低于其他3種緩沖液浸提的蛋白含量（P<0.05，下同），其他三者間差異不顯著（P>0.05，下同）。將4種不同處理后的落葵種子蛋白（統(tǒng)一稀釋到30.00 mg/mL）對(duì)大腸桿菌進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，結(jié)果顯示，只有EDTA緩沖液浸提的落葵種子蛋白具有抑菌效果，對(duì)大腸DH5α的抑菌圈直徑為17.02 mm。原因可能是硼酸鈉緩沖液、磷酸緩沖液和Tris-HCl緩沖液對(duì)落葵蛋白中的有效抑菌活性蛋白結(jié)構(gòu)造成破壞或使蛋白發(fā)生降解（古卓良等，2003）。與其他3種緩沖液相比，EDTA緩沖液較溫和，能保留有效抑菌蛋白，其浸提出的蛋白具有最佳的抑菌效果，故選擇EDTA作為浸提緩沖液進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2. 2. 1. 2 浸泡時(shí)間優(yōu)化 由圖2可看出，在浸泡時(shí)間4～8 h范圍內(nèi)，落葵種子蛋白對(duì)指示菌株大腸桿菌的抑菌圈直徑差異不顯著，浸泡12 h的抑菌圈直徑顯著增大（17.53 mm），抑菌效果最佳;然而隨著浸泡時(shí)間的繼續(xù)延長(zhǎng)，抑菌效果顯著下降?？赡苁怯捎诰彌_液中可溶性雜質(zhì)多，導(dǎo)致有效蛋白沉降。因此，選擇10、12和14 h 3個(gè)水平進(jìn)行正交優(yōu)化試驗(yàn)。

2. 2. 1. 3 料液比優(yōu)化 從圖3可看出，在料液比1∶3～1∶7范圍內(nèi)，抑菌圈直徑顯著增大，在1∶7～1∶12范圍內(nèi)抑菌圈直徑均在17.00 mm左右，4個(gè)水平間差異不顯著。適當(dāng)減小料液比，有利于有效抑菌蛋白質(zhì)的充分溶出，而使提取率提高（周麗卿，2012）;但料液比過小，蛋白質(zhì)分子與水分子間的相互作用增強(qiáng)，使得蛋白質(zhì)分子易發(fā)生作用而沉淀。從經(jīng)濟(jì)效益角度考慮，選擇料液比1∶7進(jìn)行蛋白提取，得到的蛋白對(duì)大腸桿菌抑菌圈直徑為17.86 mm，抑菌效果較好。因此，選擇1∶6、1∶7和1∶8 3個(gè)水平進(jìn)行正交優(yōu)化試驗(yàn)。

2. 2. 1. 4 硫酸銨飽和度優(yōu)化 由圖4可知，硫酸銨飽和度在30%～40%范圍內(nèi)時(shí)抑菌圈從無(wú)到有，飽和度在50%～70%時(shí)抑菌圈直徑顯著增大，在70%～80%時(shí)抑菌圈直徑緩慢增大;當(dāng)硫酸銨飽和度為90%時(shí)，抑菌蛋白對(duì)大腸桿菌的抑菌圈直徑達(dá)18.51 mm，顯著大于其他飽和度的抑菌圈直徑。表明抑菌蛋白在90%硫酸銨飽和度時(shí)沉淀最多，且相對(duì)100%硫酸銨沉淀更節(jié)約成本，故選取90%飽和度硫酸銨作為蛋白沉淀?xiàng)l件，選擇85%、90%和95% 3個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2. 2. 2 正交試驗(yàn)結(jié)果 由單因素試驗(yàn)結(jié)果可知，落葵種子蛋白對(duì)大腸桿菌的抑菌效果受浸泡時(shí)間、料液比和硫酸銨飽和度影響明顯，故選擇這3個(gè)因素采用正交試驗(yàn)3因素3水平表優(yōu)化落葵種子蛋白的提取工藝。由表3可知，在浸泡時(shí)間（因素A）中K3>K1>K2，料液比（因素B）中K3>K2>K1，硫酸銨飽和度（因素C）中K3>K2>K1，得出最優(yōu)組合為A3B3C3（以大腸DH5α為指示菌株，抑菌圈直徑大為選取條件），即浸泡時(shí)間為14 h、料液比為1∶8、硫酸銨飽和度為95%;由表3中R可知影響落葵種子蛋白提取因素的主次排序?yàn)榱弦罕?gt;硫酸銨飽和度>浸泡時(shí)間。以最優(yōu)方案進(jìn)行提取，重復(fù)試驗(yàn)3次，得到的蛋白含量為33.00 mg/mL，對(duì)大腸桿菌的抑菌圈直徑為19.68 mm。正交試驗(yàn)結(jié)果大于其他水平值，說明正交試驗(yàn)優(yōu)化提取落葵種子蛋白工藝可行。

2. 3 落葵種子蛋白抑菌結(jié)果

由表4可知，通過EDTA緩沖液浸提，95%飽和硫酸銨沉淀的落葵種子蛋白提取物（30.00 mg/mL）對(duì)真菌具有抑菌作用，以紅酵母為代表，其抑菌圈直徑為24.59 mm;對(duì)致病菌金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌、藤黃球菌和副溶血性弧菌均有抑菌作用，其抑菌圈直徑分別為19.60、26.27、25.98和15.24 mm;對(duì)腐敗菌也有抑菌作用，如腐敗希瓦氏菌和假單胞菌，其抑菌直徑分別為28.01和30.32 mm。表4中菌株除常見的食源性致病菌和肉類腐敗菌外，還有來(lái)自河水中的9株細(xì)菌，這些細(xì)菌隨水附著在魚體表面，當(dāng)魚類失去生命時(shí)，具有潛在致腐的可能，因此控制這些細(xì)菌能降低潛在致腐風(fēng)險(xiǎn)。落葵種子蛋白對(duì)Bacillus velezensis具有最大抑菌圈直徑（39.77 mm），對(duì)氣單胞屬中的Aeromonas allosaccharophila strain S5-33菌株具有最小抑菌圈直徑（14.06 mm），對(duì)大腸桿菌DH5α抑菌直徑為17.00 mm。落葵種子蛋白對(duì)這些腐敗致病菌均具有良好的抑菌效果。

2. 4 落葵種子蛋白提取物還原力測(cè)定結(jié)果

落葵種子蛋白提取物還原性測(cè)定如圖5所示，吸光值隨蛋白質(zhì)量濃度的增加而增加，根據(jù)吸光值與蛋白質(zhì)量濃度的關(guān)系得出線性回歸方程y=0.1324x-0.1444，R2=0.9918。當(dāng)吸光值為0.5時(shí)對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)量濃度為4.867 mg/mL，即為EC50。

2. 5 落葵種子蛋白提取物對(duì)DPPH自由基清除能力測(cè)定結(jié)果

以不同質(zhì)量濃度DPPH自由基為橫坐標(biāo)、517 nm處吸光值為縱坐標(biāo)，制得標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.0076x+0.0408，R2=0.9994。

加樣質(zhì)量濃度與DPPH自由基清除率關(guān)系方程為y=1.6317x+8.4665，R2=0.9854，如圖6所示。根據(jù)方程推算出當(dāng)DPPH自由基殘留率為50%時(shí)，IC50為27.817 mg/mL。落葵種子蛋白提取物對(duì)DPPH自由基的清除能力隨著蛋白質(zhì)量濃度（一定范圍內(nèi)）的增加而增強(qiáng)。

3 討論

本研究采用硫酸銨沉淀鹽析法對(duì)落葵種子蛋白進(jìn)行提取，該方法是從粗制劑中濃縮和純化蛋白的經(jīng)典方法，能更好地保留蛋白活性。在提取過程中，蛋白大部分通過硫酸銨沉淀，用去離子水溶解沉淀后再次離心，此時(shí)糖類、脂類等雜質(zhì)基本在沉淀中，而蛋白基本溶解出來(lái)。能否最大限度地提取落葵種子中的活性蛋白，單因素優(yōu)化條件十分關(guān)鍵，不同的浸泡緩沖液對(duì)蛋白析出率和蛋白活性影響不同（Li et al.，2016）。本研究比較磷酸緩沖液、EDTA緩沖液、硼酸鈉緩沖液和Tris-HCl緩沖液對(duì)落葵種子蛋白浸提的效果，結(jié)果顯示，除Tris-HCl緩沖液浸提出的落葵種子蛋白含量稍低外，其他3種緩沖液浸提蛋白析出含量差異不顯著;將4種緩沖液浸提的落葵種子蛋白提取物用無(wú)菌超純水稀釋至30.00 mg/mL進(jìn)行大腸桿菌抑菌試驗(yàn)，結(jié)果顯示只有EDTA緩沖液浸提的蛋白具有抑菌活性，說明不同的浸泡緩沖液對(duì)蛋白活性影響明顯。

落葵種子中蛋白質(zhì)含量豐富，本研究利用Bradford蛋白定量測(cè)定法測(cè)得落葵種子蛋白提取物的蛋白含量為32.30 mg/mL。李艷梅等（2011）采用堿溶酸沉法提取分離落葵種子蛋白，其提取率達(dá)82.15%，但并未對(duì)提取的粗蛋白進(jìn)行深入研究。本研究對(duì)落葵種子蛋白提取物的特性進(jìn)行分析，在硫酸銨飽和度80%～100%沉淀出的落葵種子蛋白提取物抑菌效果較好;此外，本研究還發(fā)現(xiàn)落葵種子蛋白提取物在pH 8.0左右抑菌特性消失，可能是蛋白等電點(diǎn)導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性或聚沉，溫度高于80 ℃時(shí)抑菌活性顯著下降，進(jìn)一步說明起抑菌作用的是蛋白類而非糖類等其他物質(zhì)。Reshmi和Suganya（2012）發(fā)現(xiàn)落葵果實(shí)甲醇提取物抑菌效果好，本研究也發(fā)現(xiàn)落葵種子蛋白提取物具有抑菌作用。落葵種子蛋白提取物對(duì)試驗(yàn)中的33株菌的抑菌圈直徑為14.06～39.77 mm，抑菌效果優(yōu)于苦瓜蛋白對(duì)枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和酵母的抑菌效果（抑菌圈直徑分別為15.0、14.5、13.5和1.02 mm）（于群和朱新產(chǎn)，2012）;優(yōu)于苦蕎蛋白對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果（抑菌圈直徑分別為12.8和13.2 mm）（陳英嬌，2015）;也優(yōu)于紫菜蛋白對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果（抑菌圈直徑為18.70 mm）（宋惠平等，2015）。綜上所述，落葵種子蛋白對(duì)真菌、致病菌和腐敗菌均具有良好的抑制作用，作為食品防腐抑菌劑具有廣闊的發(fā)展前景。

落葵種子還原力的測(cè)定中，隨著有效活性蛋白質(zhì)量濃度的增加，還原力不斷增強(qiáng)，在吸光值0.5時(shí)其EC50為4.867 mg/mL，說明落葵種子蛋白有很強(qiáng)的抗氧化能力。彭會(huì)軍（2008）測(cè)得落葵多糖對(duì)超氧自由基和羥基自由基的最大清除率分別為54.32%和52.94%，研究發(fā)現(xiàn)落葵中提取的活性物質(zhì)可能為糖蛋白或蛋白多糖。這與本研究得出落葵種子蛋白提取物具有抗氧化作用的結(jié)論相符。落葵種子蛋白提取物還原能力測(cè)定的EC50為4.867 mg/mL，優(yōu)于青刺果果實(shí)的還原力（EC50為24.7 mg/mL）（張瑞琳等，2017）;同時(shí)落葵種子蛋白提取物對(duì)DPPH自由基清除能力的IC50為27.817 mg/mL，優(yōu)于葡萄籽原花青素清除DPPH自由基能力，其清除DPPH自由基（2.5×10-2 mg/mL）的IC50為118 g/kg（李春陽(yáng)等，2006）。本研究對(duì)落葵種子中粗蛋白進(jìn)行了初步分析，但落葵種子蛋白粗提物中活性成分可能是一種或幾種蛋白的混合物或多肽，后續(xù)試驗(yàn)將對(duì)蛋白提取物進(jìn)行純化和質(zhì)譜鑒定。此外，關(guān)于落葵種子蛋白是否具有抗腫瘤、降血糖、降膽固醇等功效，其理化性質(zhì)及在食品保鮮上的應(yīng)用等均有待后續(xù)研究。

4 結(jié)論

落葵種子蛋白在EDTA緩沖液中可浸提出有效抑菌蛋白，最佳提取工藝為浸泡時(shí)間14 h、料液比1∶8、硫酸銨飽和度95%;落葵種子蛋白對(duì)1株真菌、4株致病菌和28株腐敗菌均有較好的抑菌效果，對(duì)DPPH自由基清除效果良好，且抗氧化活性強(qiáng)。落葵種子蛋白具有開發(fā)為天然防腐抑菌劑和抗氧化劑的潛在價(jià)值。

參考文獻(xiàn)：

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（責(zé)任編輯 羅 麗）0 引言

【研究意義】落葵（Basella alba L.）為落葵科落葵屬多年生蔓生肉質(zhì)藤本植物（趙金莉等，2011），其味道清香爽口，作為新型綠色健康蔬菜越來(lái)越受到人們喜愛。落葵營(yíng)養(yǎng)豐富，葉和莖均可食用，每1 kg可食部分含有蛋白質(zhì)17 g、脂肪2 g和碳水化合物31 g，同時(shí)含有豐富的鈣、磷、鐵等元素（盧毓星等，2005）。落葵全株可入藥，民間常用其治病或作食療，能清熱滑腸、涼血、解毒，主治大便秘結(jié)、小便短澀、痢疾便血等癥（彭會(huì)軍，2008）。落葵種子富含蛋白，李艷梅等（2011）采用堿溶酸沉法提取分離落葵種子蛋白，在優(yōu)化條件下得到蛋白質(zhì)提取率為82.15%。雖然落葵種子蛋白含量豐富，但未得到充分利用，為研究其潛在價(jià)值，本研究采用正交優(yōu)化法最大限度地提取落葵種子活性蛋白。植物源防腐劑是從植物的根、莖、葉和果實(shí)等提煉出的蛋白類、肽類、多糖類、黃酮類、多酚類、萜類、精油及植物自身成分的酶解產(chǎn)物等，具有一定的營(yíng)養(yǎng)保健價(jià)值，即發(fā)揮抑菌、抗菌和食品保鮮作用的同時(shí)，還具有抗氧化、降血脂、降血壓、預(yù)防腫瘤等疾病的保健功能（張媛媛等，2014）。落葵本身具有藥食同源性，具有研發(fā)成為天然抑菌劑和天然抗氧化劑的潛力，因此研究落葵種子蛋白的特性具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】關(guān)于植物蛋白特性的研究，主要包括抑菌和抗氧化兩方面。食品腐敗不僅降低食品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，還增加食源性疾病風(fēng)險(xiǎn)（張新武等，2014），目前食品防腐劑種類繁多，化學(xué)防腐劑是使用最廣泛的一種，但由于其對(duì)人體有一定的毒害作用，所以人們開始尋求天然食品防腐劑（肖素榮和李京東，2007;趙國(guó)萍等，2017）。王佐等（2002）分離純化得到色譜純的抗3型科薩奇病毒的苦瓜蛋白，通過體外抗病毒試驗(yàn)表明一定范圍內(nèi)的苦瓜蛋白對(duì)3型科薩奇病毒感染的HepG2細(xì)胞有明顯保護(hù)作用;李軍等（2018b）從蘿卜籽中分離得到一種抑菌蛋白，研究發(fā)現(xiàn)該蛋白對(duì)9株鱘魚腐敗菌均具有很好的抑制作用。目前工業(yè)上使用的抗氧化劑大多是合成型，雖然抗氧化效果好，但其安全性一直受到質(zhì)疑;天然抗氧化劑是從天然食品中提取的具有抗氧化活性的物質(zhì)，具有安全性高、抗氧化能力強(qiáng)、無(wú)副作用等特點(diǎn)（章林等，2012），如蓮子蛋白對(duì)羥基自由基具有較好的清除作用（張羽，2008）。關(guān)于落葵的研究目前主要集中在對(duì)落葵色素和多糖的研究，張美榮等（2010）對(duì)落葵果實(shí)中的色素提取工藝進(jìn)行優(yōu)化并研究其穩(wěn)定性;林愛琴（2010）研究表明落葵多糖具有清除自由基的作用;鄒群等（2011）研究發(fā)現(xiàn)落葵多糖有抑制腫瘤生長(zhǎng)和免疫調(diào)節(jié)功效;李小莉等（2012）研究表明落葵多糖對(duì)荷瘤小鼠的腫瘤生長(zhǎng)表現(xiàn)出顯著的抑制作用;Reshmi和Suganya（2012）采用瓊脂擴(kuò)散法將落葵果實(shí)甲醇提取物對(duì)枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、乳酸桿菌等多種微生物的抑菌范圍進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，落葵果實(shí)提取物具有良好的抑菌性能?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前對(duì)落葵種子蛋白的功能特性研究較少，針對(duì)落葵種子蛋白抑菌和抗氧化特性的研究也鮮見報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過硫酸銨沉淀、單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化提取落葵種子蛋白的工藝條件，并對(duì)其抑菌特性、DPPH自由基清除能力和還原力進(jìn)行研究，為開發(fā)利用落葵種子蛋白提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

落葵種子購(gòu)自北京市豐臺(tái)區(qū)新發(fā)地種子市場(chǎng)。紅酵母（Rhodothece glutinis）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aur-eus）、乳酸菌（Lactobacillus）、藤黃菌（Micrococcus luteus）、單增李斯特菌（Listeria monocytogenes）、副溶血性弧菌（Vibrio parahemolyticus）和河水細(xì)菌由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院提供，假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、腐敗希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）、氣單胞菌（Aeromonas）、大腸桿菌（Escheri-chia coli）和不動(dòng)桿菌（Acinetobacter sp.）為北京市水產(chǎn)科學(xué)研究所保藏并提供。平板計(jì)數(shù)瓊脂（PCA）培養(yǎng)基和3%氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司;硫酸銨、六氰合鐵酸鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、氯化鈉和瓊脂粉均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;Bradford蛋白質(zhì)定量試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司;2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT）和乙二胺四乙酸（EDTA）購(gòu)自索萊寶生物科技有限公司;DPPH自由基購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

主要儀器設(shè)備：冷凍離心機(jī)（美國(guó)Sigma公司）;全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（美國(guó)伯騰儀器有限公司）;4 ℃冰箱（青島海爾股份有限公司）;潔凈工作臺(tái)（北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司）;生化培養(yǎng)箱、恒溫水浴鍋（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）;全溫振蕩器（蘇州培英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）;微波爐（廣東美的廚房電器制造有限公司）。

1. 2 落葵種子蛋白提取物制備

采用硫酸銨沉淀法。將落葵種子磨成粉后（現(xiàn)磨現(xiàn)用，無(wú)需過篩，盡可能磨成細(xì)粉，便于落葵種子蛋白析出）與15 g/L EDTA緩沖液以1∶5（m/v）比例浸泡12 h，8層紗布過濾后取濾液于4 ℃下12000 r/min離心5 min，收集上清液，邊攪拌邊添加硫酸銨，使飽和度達(dá)80%，沉淀3 h后于4 ℃下12000 r/min離心20 min，收集沉淀，用去離子水復(fù)溶（每10 g落葵種子干粉蛋白提取物添加10 mL去離子水），4 ℃、12000 r/min離心20 min后收集上清液，0.22 μm水相濾膜過濾后4 ℃保存?zhèn)溆茫ɡ钴姷龋?018a）。

1. 3 落葵種子蛋白提取物含量測(cè)定

根據(jù)Bradford蛋白定量測(cè)定原理（Compton and Jones，1985）進(jìn)行。制備蛋白定量標(biāo)準(zhǔn)曲線，按照表1添加試劑于10 mL EP管中并混勻;搖勻后用96孔板分別在595 nm處測(cè)吸光值，記錄數(shù)據(jù)，以蛋白質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。取100 μL待測(cè)樣品加入3 mL Bradford蛋白定量測(cè)定試劑混勻后在595 nm處測(cè)吸光值，通過蛋白定量標(biāo)準(zhǔn)曲線可得知待測(cè)樣品的蛋白含量。

1. 4 落葵種子蛋白抑菌試驗(yàn)

真菌選取紅酵母;致病菌選取單增李斯特菌、藤黃球菌、金色葡萄球菌和副溶血性弧菌;腐敗菌選取大腸桿菌、假單胞菌、氣單胞菌、腐敗希瓦氏菌、枯草芽孢桿菌，以及從腐敗魚中篩選出的14株腐敗菌菌株和從河水中篩出的9種細(xì)菌，共33株菌進(jìn)行抑菌研究。除副溶血性弧菌外的其他菌株用PCA培養(yǎng)基活化后，用無(wú)菌生理鹽水稀釋至106 CFU/mL，取1 mL菌懸液置于10 mL PCA固體培養(yǎng)基中混勻凝固;副溶血性弧菌用10 mL 3%氯化鈉胰蛋白胨水稀釋至106 CFU/mL，取1 mL置于10 mL 3%氯化鈉胰蛋白胨瓊脂固體培養(yǎng)基中混勻凝固，凝固的平板用牛津杯（外徑8 mm、內(nèi)徑6 mm、高10 mm）進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，每個(gè)牛津杯中加入200 μL落葵種子蛋白提取物（用無(wú)菌超純水將1.3測(cè)得的落葵種子蛋白提取物濃度稀釋至30.00 mg/mL），37 ℃培養(yǎng)18～24 h后觀察抑菌圈直徑，每組3個(gè)平行。

1. 5 落葵種子蛋白提取工藝優(yōu)化

1. 5. 1 單因素試驗(yàn)

1. 5. 1. 1 浸泡緩沖液選擇 選擇4種緩沖液[硼酸鈉緩沖液（0.05 mol/L，pH 8.2）、磷酸緩沖液（0.1 mol/L KCl，2 mmol/L EDTA，pH 7.5）、Tris-HCl緩沖液（0.05 mol/L，pH 8.0）和EDTA緩沖液（15 g/L，pH 8.0）]對(duì)落葵種子蛋白進(jìn)行浸提，比較提取效果。以大腸桿菌（濃度106 CFU/mL）為指示菌株，取1 mL菌懸液置于無(wú)菌培養(yǎng)皿中，加入10 mL適溫PCA固體培養(yǎng)基混勻靜置，待其凝固后放入牛津杯，再取200 μL落葵種子蛋白提取物加入牛津杯中，37 ℃培養(yǎng)18～24 h，通過觀察抑菌圈選擇適宜的緩沖液，每組試驗(yàn)3個(gè)平行。

1. 5. 1. 2 浸泡時(shí)間選擇 用最佳浸泡緩沖液分別浸泡落葵種子粉末4、8、12、16、20和24 h，按照1.2操作得到蛋白提取物后，以大腸桿菌（106 CFU/mL）為指示菌株，取200 μL落葵種子蛋白提取物加入牛津杯中，37 ℃培養(yǎng)18～24 h，觀察抑菌圈。每組試驗(yàn)3個(gè)平行。

1. 5. 1. 3 料液比選擇 將落葵種子粉末與緩沖液以1∶3、1∶5、1∶7、1∶9、1∶11和1∶12（w/v）的比例浸泡合適時(shí)間，按照1.2操作得到蛋白提取物后，以大腸桿菌（106 CFU/mL）為指示菌株，取200 μL落葵種子蛋白提取物加入牛津杯中，37 ℃培養(yǎng)18～24 h，觀察抑菌圈。每組試驗(yàn)3個(gè)平行。

1. 5. 1. 4 硫酸銨飽和度選擇 稱取80 g落葵種子粉末，加入560 mL EDTA緩沖液浸泡12 h后紗布過濾，4 ℃下12000 r/min離心5 min，取上清液分為8份，每份30 mL，分別添加硫酸銨4.92、6.78、8.73、10.83、13.08、15.48、18.09和20.91 g（對(duì)應(yīng)飽和度分別為30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%和100%）沉淀落葵種子蛋白。后續(xù)步驟按照1.2操作，并將不同硫酸銨飽和度沉淀的落葵蛋白提取物以大腸桿菌（106 CFU/mL）為指示菌株測(cè)抑菌效果。每組試驗(yàn)3個(gè)平行。

1. 5. 2 正交優(yōu)化試驗(yàn) 以對(duì)大腸桿菌的抑菌圈為篩選指標(biāo)，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果選取浸泡時(shí)間、料液比和硫酸銨飽和度進(jìn)行正交試驗(yàn)，因素及水平設(shè)計(jì)見表2。

1. 6 落葵種子蛋白提取物還原力測(cè)定

取1 mL不同質(zhì)量濃度樣液，與1 mL 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.6）和1 mL 1.0%六氰合鐵酸鉀溶液混合，在50 ℃下水浴20 min后快速冷卻，然后在反應(yīng)混合物中加入1 mL 10%三氯乙酸，放置10 min，待反應(yīng)充分后6000 r/min離心10 min，取上清1 mL，加入1 mL蒸餾水和0.2 mL 0.1%三氯化鐵溶液，充分混勻，室溫靜置10 min后在700 nm處測(cè)吸光值（吸光值的增加代表反應(yīng)混合物還原力增強(qiáng)，樣品的抗氧化活性增加），以維生素C為陽(yáng)性對(duì)照。得吸光值在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)的線性回歸方程，通過回歸方程計(jì)算半最大效應(yīng)濃度EC50（吸光值為0.5時(shí)對(duì)應(yīng)的樣液質(zhì)量濃度）。EC50越小，表明其還原力越強(qiáng)，抗氧化活性越強(qiáng)（孟德敬等，2007;王雅，2012;Zhang et al.，2017）。

1. 7 落葵種子蛋白提取物對(duì)DPPH自由基清除能力測(cè)定

1. 7. 1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 準(zhǔn)確稱取DPPH自由基1 mg，用乙醇定容至10 mL，配制成質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液（現(xiàn)用現(xiàn)配）。分別吸取0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，用乙醇定容至5 mL，最終質(zhì)量濃度分別為0、2、4、8、12、16和20 μg/mL。測(cè)定上述標(biāo)準(zhǔn)溶液在517 nm波長(zhǎng)處的吸光值，以不同質(zhì)量濃度DPPH自由基為橫坐標(biāo)、吸光值為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1. 7. 2 樣品測(cè)定 0.25 mL不同質(zhì)量濃度落葵蛋白提取物與0.25 mL 0.1 mmol/L DPPH（溶解于95%乙醇中）混合后振蕩，室溫下避光反應(yīng)30 min。若有沉淀，6400 g離心3 min，取200 μL上清液加到96孔板中，517 nm測(cè)定吸光值。對(duì)照組用0.25 mL蒸餾水替代樣品，BHT（200 μg/mL）作陽(yáng)性對(duì)照（Enujiugha et al.，2012）。按照下式計(jì)算落葵種子蛋白提取物對(duì)DPPH自由基的清除率（曹輝等，2009）：

DPPH自由基清除率（%）=[1-（Ai-Aj）/A0]×100

式中，Ai為加入蛋白樣品與DPPH反應(yīng)后517 nm處吸光值，Aj為加入蛋白樣品與無(wú)水乙醇混合后517 nm處吸光值，A0為不加蛋白樣品時(shí)測(cè)得DPPH 517 nm的吸光值。

半抑制濃度（IC50）為DPPH自由基清除率等于50%時(shí)添加落葵種子提取物的質(zhì)量濃度。

1. 8 統(tǒng)計(jì)分析

所有試驗(yàn)均重復(fù)3次。采用SPSS 17.0的One-way ANOVA進(jìn)行方差分析，Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 落葵種子蛋白提取物的蛋白含量測(cè)定結(jié)果

落葵種子蛋白提取物溶液中蛋白質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.3135x+0.3482（R2=0.9913）。經(jīng)測(cè)定，落葵種子硫酸銨沉淀蛋白提取物溶液中蛋白質(zhì)量濃度為32.30 mg/mL。

2. 2 落葵種子蛋白提取優(yōu)化結(jié)果

2. 2. 1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2. 2. 1. 1 浸泡緩沖液優(yōu)化 由圖1可知，采用硼酸鈉緩沖液、磷酸緩沖液、Tris-HCl緩沖液和EDTA緩沖液提取的落葵種子蛋白含量分別為36.20、36.58、34.30和36.17 mg/mL，其中Tris-HCl緩沖液浸提的蛋白含量顯著低于其他3種緩沖液浸提的蛋白含量（P<0.05，下同），其他三者間差異不顯著（P>0.05，下同）。將4種不同處理后的落葵種子蛋白（統(tǒng)一稀釋到30.00 mg/mL）對(duì)大腸桿菌進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，結(jié)果顯示，只有EDTA緩沖液浸提的落葵種子蛋白具有抑菌效果，對(duì)大腸DH5α的抑菌圈直徑為17.02 mm。原因可能是硼酸鈉緩沖液、磷酸緩沖液和Tris-HCl緩沖液對(duì)落葵蛋白中的有效抑菌活性蛋白結(jié)構(gòu)造成破壞或使蛋白發(fā)生降解（古卓良等，2003）。與其他3種緩沖液相比，EDTA緩沖液較溫和，能保留有效抑菌蛋白，其浸提出的蛋白具有最佳的抑菌效果，故選擇EDTA作為浸提緩沖液進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2. 2. 1. 2 浸泡時(shí)間優(yōu)化 由圖2可看出，在浸泡時(shí)間4～8 h范圍內(nèi)，落葵種子蛋白對(duì)指示菌株大腸桿菌的抑菌圈直徑差異不顯著，浸泡12 h的抑菌圈直徑顯著增大（17.53 mm），抑菌效果最佳;然而隨著浸泡時(shí)間的繼續(xù)延長(zhǎng)，抑菌效果顯著下降。可能是由于緩沖液中可溶性雜質(zhì)多，導(dǎo)致有效蛋白沉降。因此，選擇10、12和14 h 3個(gè)水平進(jìn)行正交優(yōu)化試驗(yàn)。

2. 2. 1. 3 料液比優(yōu)化 從圖3可看出，在料液比1∶3～1∶7范圍內(nèi)，抑菌圈直徑顯著增大，在1∶7～1∶12范圍內(nèi)抑菌圈直徑均在17.00 mm左右，4個(gè)水平間差異不顯著。適當(dāng)減小料液比，有利于有效抑菌蛋白質(zhì)的充分溶出，而使提取率提高（周麗卿，2012）;但料液比過小，蛋白質(zhì)分子與水分子間的相互作用增強(qiáng)，使得蛋白質(zhì)分子易發(fā)生作用而沉淀。從經(jīng)濟(jì)效益角度考慮，選擇料液比1∶7進(jìn)行蛋白提取，得到的蛋白對(duì)大腸桿菌抑菌圈直徑為17.86 mm，抑菌效果較好。因此，選擇1∶6、1∶7和1∶8 3個(gè)水平進(jìn)行正交優(yōu)化試驗(yàn)。

2. 2. 1. 4 硫酸銨飽和度優(yōu)化 由圖4可知，硫酸銨飽和度在30%～40%范圍內(nèi)時(shí)抑菌圈從無(wú)到有，飽和度在50%～70%時(shí)抑菌圈直徑顯著增大，在70%～80%時(shí)抑菌圈直徑緩慢增大;當(dāng)硫酸銨飽和度為90%時(shí)，抑菌蛋白對(duì)大腸桿菌的抑菌圈直徑達(dá)18.51 mm，顯著大于其他飽和度的抑菌圈直徑。表明抑菌蛋白在90%硫酸銨飽和度時(shí)沉淀最多，且相對(duì)100%硫酸銨沉淀更節(jié)約成本，故選取90%飽和度硫酸銨作為蛋白沉淀?xiàng)l件，選擇85%、90%和95% 3個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2. 2. 2 正交試驗(yàn)結(jié)果 由單因素試驗(yàn)結(jié)果可知，落葵種子蛋白對(duì)大腸桿菌的抑菌效果受浸泡時(shí)間、料液比和硫酸銨飽和度影響明顯，故選擇這3個(gè)因素采用正交試驗(yàn)3因素3水平表優(yōu)化落葵種子蛋白的提取工藝。由表3可知，在浸泡時(shí)間（因素A）中K3>K1>K2，料液比（因素B）中K3>K2>K1，硫酸銨飽和度（因素C）中K3>K2>K1，得出最優(yōu)組合為A3B3C3（以大腸DH5α為指示菌株，抑菌圈直徑大為選取條件），即浸泡時(shí)間為14 h、料液比為1∶8、硫酸銨飽和度為95%;由表3中R可知影響落葵種子蛋白提取因素的主次排序?yàn)榱弦罕?gt;硫酸銨飽和度>浸泡時(shí)間。以最優(yōu)方案進(jìn)行提取，重復(fù)試驗(yàn)3次，得到的蛋白含量為33.00 mg/mL，對(duì)大腸桿菌的抑菌圈直徑為19.68 mm。正交試驗(yàn)結(jié)果大于其他水平值，說明正交試驗(yàn)優(yōu)化提取落葵種子蛋白工藝可行。

2. 3 落葵種子蛋白抑菌結(jié)果

由表4可知，通過EDTA緩沖液浸提，95%飽和硫酸銨沉淀的落葵種子蛋白提取物（30.00 mg/mL）對(duì)真菌具有抑菌作用，以紅酵母為代表，其抑菌圈直徑為24.59 mm;對(duì)致病菌金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌、藤黃球菌和副溶血性弧菌均有抑菌作用，其抑菌圈直徑分別為19.60、26.27、25.98和15.24 mm;對(duì)腐敗菌也有抑菌作用，如腐敗希瓦氏菌和假單胞菌，其抑菌直徑分別為28.01和30.32 mm。表4中菌株除常見的食源性致病菌和肉類腐敗菌外，還有來(lái)自河水中的9株細(xì)菌，這些細(xì)菌隨水附著在魚體表面，當(dāng)魚類失去生命時(shí)，具有潛在致腐的可能，因此控制這些細(xì)菌能降低潛在致腐風(fēng)險(xiǎn)。落葵種子蛋白對(duì)Bacillus velezensis具有最大抑菌圈直徑（39.77 mm），對(duì)氣單胞屬中的Aeromonas allosaccharophila strain S5-33菌株具有最小抑菌圈直徑（14.06 mm），對(duì)大腸桿菌DH5α抑菌直徑為17.00 mm。落葵種子蛋白對(duì)這些腐敗致病菌均具有良好的抑菌效果。

2. 4 落葵種子蛋白提取物還原力測(cè)定結(jié)果

落葵種子蛋白提取物還原性測(cè)定如圖5所示，吸光值隨蛋白質(zhì)量濃度的增加而增加，根據(jù)吸光值與蛋白質(zhì)量濃度的關(guān)系得出線性回歸方程y=0.1324x-0.1444，R2=0.9918。當(dāng)吸光值為0.5時(shí)對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)量濃度為4.867 mg/mL，即為EC50。

2. 5 落葵種子蛋白提取物對(duì)DPPH自由基清除能力測(cè)定結(jié)果

以不同質(zhì)量濃度DPPH自由基為橫坐標(biāo)、517 nm處吸光值為縱坐標(biāo)，制得標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.0076x+0.0408，R2=0.9994。

加樣質(zhì)量濃度與DPPH自由基清除率關(guān)系方程為y=1.6317x+8.4665，R2=0.9854，如圖6所示。根據(jù)方程推算出當(dāng)DPPH自由基殘留率為50%時(shí)，IC50為27.817 mg/mL。落葵種子蛋白提取物對(duì)DPPH自由基的清除能力隨著蛋白質(zhì)量濃度（一定范圍內(nèi)）的增加而增強(qiáng)。

3 討論

本研究采用硫酸銨沉淀鹽析法對(duì)落葵種子蛋白進(jìn)行提取，該方法是從粗制劑中濃縮和純化蛋白的經(jīng)典方法，能更好地保留蛋白活性。在提取過程中，蛋白大部分通過硫酸銨沉淀，用去離子水溶解沉淀后再次離心，此時(shí)糖類、脂類等雜質(zhì)基本在沉淀中，而蛋白基本溶解出來(lái)。能否最大限度地提取落葵種子中的活性蛋白，單因素優(yōu)化條件十分關(guān)鍵，不同的浸泡緩沖液對(duì)蛋白析出率和蛋白活性影響不同（Li et al.，2016）。本研究比較磷酸緩沖液、EDTA緩沖液、硼酸鈉緩沖液和Tris-HCl緩沖液對(duì)落葵種子蛋白浸提的效果，結(jié)果顯示，除Tris-HCl緩沖液浸提出的落葵種子蛋白含量稍低外，其他3種緩沖液浸提蛋白析出含量差異不顯著;將4種緩沖液浸提的落葵種子蛋白提取物用無(wú)菌超純水稀釋至30.00 mg/mL進(jìn)行大腸桿菌抑菌試驗(yàn)，結(jié)果顯示只有EDTA緩沖液浸提的蛋白具有抑菌活性，說明不同的浸泡緩沖液對(duì)蛋白活性影響明顯。

落葵種子中蛋白質(zhì)含量豐富，本研究利用Bradford蛋白定量測(cè)定法測(cè)得落葵種子蛋白提取物的蛋白含量為32.30 mg/mL。李艷梅等（2011）采用堿溶酸沉法提取分離落葵種子蛋白，其提取率達(dá)82.15%，但并未對(duì)提取的粗蛋白進(jìn)行深入研究。本研究對(duì)落葵種子蛋白提取物的特性進(jìn)行分析，在硫酸銨飽和度80%～100%沉淀出的落葵種子蛋白提取物抑菌效果較好;此外，本研究還發(fā)現(xiàn)落葵種子蛋白提取物在pH 8.0左右抑菌特性消失，可能是蛋白等電點(diǎn)導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性或聚沉，溫度高于80 ℃時(shí)抑菌活性顯著下降，進(jìn)一步說明起抑菌作用的是蛋白類而非糖類等其他物質(zhì)。Reshmi和Suganya（2012）發(fā)現(xiàn)落葵果實(shí)甲醇提取物抑菌效果好，本研究也發(fā)現(xiàn)落葵種子蛋白提取物具有抑菌作用。落葵種子蛋白提取物對(duì)試驗(yàn)中的33株菌的抑菌圈直徑為14.06～39.77 mm，抑菌效果優(yōu)于苦瓜蛋白對(duì)枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和酵母的抑菌效果（抑菌圈直徑分別為15.0、14.5、13.5和1.02 mm）（于群和朱新產(chǎn)，2012）;優(yōu)于苦蕎蛋白對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果（抑菌圈直徑分別為12.8和13.2 mm）（陳英嬌，2015）;也優(yōu)于紫菜蛋白對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果（抑菌圈直徑為18.70 mm）（宋惠平等，2015）。綜上所述，落葵種子蛋白對(duì)真菌、致病菌和腐敗菌均具有良好的抑制作用，作為食品防腐抑菌劑具有廣闊的發(fā)展前景。

落葵種子還原力的測(cè)定中，隨著有效活性蛋白質(zhì)量濃度的增加，還原力不斷增強(qiáng)，在吸光值0.5時(shí)其EC50為4.867 mg/mL，說明落葵種子蛋白有很強(qiáng)的抗氧化能力。彭會(huì)軍（2008）測(cè)得落葵多糖對(duì)超氧自由基和羥基自由基的最大清除率分別為54.32%和52.94%，研究發(fā)現(xiàn)落葵中提取的活性物質(zhì)可能為糖蛋白或蛋白多糖。這與本研究得出落葵種子蛋白提取物具有抗氧化作用的結(jié)論相符。落葵種子蛋白提取物還原能力測(cè)定的EC50為4.867 mg/mL，優(yōu)于青刺果果實(shí)的還原力（EC50為24.7 mg/mL）（張瑞琳等，2017）;同時(shí)落葵種子蛋白提取物對(duì)DPPH自由基清除能力的IC50為27.817 mg/mL，優(yōu)于葡萄籽原花青素清除DPPH自由基能力，其清除DPPH自由基（2.5×10-2 mg/mL）的IC50為118 g/kg（李春陽(yáng)等，2006）。本研究對(duì)落葵種子中粗蛋白進(jìn)行了初步分析，但落葵種子蛋白粗提物中活性成分可能是一種或幾種蛋白的混合物或多肽，后續(xù)試驗(yàn)將對(duì)蛋白提取物進(jìn)行純化和質(zhì)譜鑒定。此外，關(guān)于落葵種子蛋白是否具有抗腫瘤、降血糖、降膽固醇等功效，其理化性質(zhì)及在食品保鮮上的應(yīng)用等均有待后續(xù)研究。

4 結(jié)論

落葵種子蛋白在EDTA緩沖液中可浸提出有效抑菌蛋白，最佳提取工藝為浸泡時(shí)間14 h、料液比1∶8、硫酸銨飽和度95%;落葵種子蛋白對(duì)1株真菌、4株致病菌和28株腐敗菌均有較好的抑菌效果，對(duì)DPPH自由基清除效果良好，且抗氧化活性強(qiáng)。落葵種子蛋白具有開發(fā)為天然防腐抑菌劑和抗氧化劑的潛在價(jià)值。

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（責(zé)任編輯 羅 麗）