劉春 陳曉虹 姜蘭 曹際振 李凱彬 王英英 常藕琴 王芳石存斌 林明輝 王慶

摘要：為研究鲴愛德華氏菌與宿主的相互作用關系，本研究構建帶有紅色熒光蛋白基因的pMDmCherry表達載體，通過電擊轉化法將載體成功導人鮰愛德華氏菌zb1141菌株中，獲得了紅色熒光蛋白標記的鲴愛德華氏菌菌株。在倒置熒光顯微鏡下觀察，重組鲴愛德華氏菌顯示特異性紅色熒光。穩(wěn)定性檢測結果表明，標記菌株傳至28代，重組質粒穩(wěn)定率仍為100%。用標記菌株感染斑馬魚仔魚后，能在激光共聚焦顯微鏡下實時觀察到細菌在魚體內的分布情況;標記菌株體外感染小鼠巨噬細胞后，也能觀察到病原菌與巨噬細胞的相互作用情況。說明標記菌株具有良好的特異性和可視性，為鮰愛德華氏菌對宿主的致病性研究提供了一種良好的生物材料。

關鍵詞：鮰愛德華氏菌;紅色熒光蛋白;斑馬魚;巨噬細胞

中圖分類號： S917.1

文獻標識碼：A

文章編號： 1000-4440（ 2019） 03-0661-06

鮰愛德華氏菌（Edwardsiella ictaluri）隸屬腸桿菌科、愛德華氏菌屬，是一種兼性的胞內寄生菌，可感染斑點叉尾鲴等多種名特魚類[1]。魚體感染后表現(xiàn)為內臟器官的充血、出血、炎癥、變性和壞死，嚴重的在頭部形成開放性的潰瘍灶[2]。自1979年，Hawke首次報道鮰愛德華氏菌感染斑點叉尾鮰以來，該細菌在世界各地迅速蔓延，目前已在澳大利亞、泰國、越南、日本、中國等相繼發(fā)現(xiàn)鮰愛德華氏菌感染魚類發(fā)病，感染對象包括南方大口鲇、斑點叉尾鲴、黃顙魚、長吻鮠、鰻鯰和虹鱒等，發(fā)病率和死亡率均較高，嚴重影響水產養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展[3-6]。為了有效地預防和控制鮰愛德華氏菌病的發(fā)生與傳播，研究鮰愛德華氏菌對宿主的致病性及感染途徑，深刻認識其致病機理顯得尤為重要。

熒光蛋白是部分生物體產生的在特定波長光照射下可激發(fā)對應顏色熒光的蛋白質。熒光蛋白激發(fā)的熒光具有檢測靈敏性高、特異性強和細胞毒性小等優(yōu)點[7]，大量研究結果顯示，熒光蛋白是理想的熒光標記物，利用熒光蛋白標記病原菌，對其進行定位和示蹤，可實現(xiàn)細菌在體內的實時監(jiān)測，研究病原菌入侵的動態(tài)過程[8]。目前在水產養(yǎng)殖領域，已有相關用熒光蛋白標記遲緩愛德華氏菌（Edwardsiellatarda）、嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）、殺鮭氣單胞菌（Aeromonas salmonicida）等致病菌及其對宿主的侵染途徑的研究報道[9-11]。

本研究從患病斑馬魚體內分離出l株高致病性的鮰愛德華氏菌，構建帶有mCherry基因的pMDmCherry載體，通過電擊轉化到鲴愛德華氏菌中。進一步將mCherry基因標記的鲴愛德華氏菌感染斑馬魚仔魚和小鼠巨噬細胞RAW264.7，利用激光共聚焦顯微鏡觀察標記細菌在魚體內的擴散分布情況及標記細菌與體外巨噬細胞的相互作用關系。本研究為mCherry標簽進行細菌標記使菌落觀察更具可視性和特異性提供數(shù)據(jù)支持，也為鮰愛德華氏菌對宿主的致病性及感染途徑研究提供更加便捷、可行的方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

鮰愛德華氏菌菌株zbl141由本實驗室分離保存，含啟動子的質粒PRUAL和含紅色熒光蛋白基因的質粒pLVX-PAnzCherry-C1由本實驗室保存。小鼠巨噬細胞RAW264.7購自廣州市哈藍生物科技有限公司，胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基均購自美國Gibco公司，間氨基苯甲酸乙酯甲烷磺酸鹽（MS-222）、1-苯基-2-硫脲為Sigma公司產品，大腸桿菌DH5a由本實驗室保存。膠回收試劑盒Agarose GelDNA Purification Kit Ver.2.0、DNA Taq酶、dNTP、DNA分子Marker為寶生物工程（大連）有限公司產品，Plasmid Mini Kit I為Omega公司產品，基因組提取試劑盒（細菌）購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 重組表達質粒pMDmCherry的構建

1.2.1 啟動子和mCherry連接片段的擴增根據(jù)啟動子和mCherry基因序列，利用Primer5.O軟件設計2對擴增引物，由上海生工生物工程有限公司合成。用于擴增啟動子基因的上游引物為PPS：5’-CGC-CTAGGATACGCACACCGTGGAAAC-3'，下游引物為PPA：5’_CCrITGCTCACCArITITITCrITCCTCCA_3’;擴增mCherry基因的上游引物為MCS：5’-AG-GAAGAAAAAATGGTGAGCAAGGGTGA-3’，下游弓l物為MCA：5’-GCGTTCGAATTACTACTTGTACAGC-T-3’。

以質粒PRUAL為模板，PPS/PPA為引物，按照常規(guī)PCR方法擴增啟動子基因序列，反應條件為95 cC 2 min;94℃30 s，56℃40 s和72℃90 s，35個循環(huán)，72 cc延伸10 min。以質粒pLVX-PAmCher-ry-CI為模板，MCS/MCA為引物，PCR擴增mCherry基因序列。瓊脂糖凝膠電泳純化回收PCR產物。

采用融合PCR方法，由于設計時PPA和MCS引物有一段重復序列，因而PCR擴增的啟動子和mCherry基因就含有互補片段。以純化的的啟動子和mCherry產物1：1混合作為模板，常規(guī)PCR方法不加引物擴增10個循環(huán)，結束后直接添加PPS、MCA作為上下游引物，PCR方法擴增30個循環(huán)。瓊脂糖凝膠電泳純化回收PCR產物。

1.2.2 重組質粒連接、轉化與鑒定 將方法1.2.1純化回收的啟動子和mCherry連接片段與pMD18-TVector克隆載體（TaKaRa） 16℃連接2h后，轉化至DH5a感受態(tài)細胞，挑取陽性單菌落，送至上海生工生物工程有限公司測序確認，構建好的pMDmCherry質粒保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 重組鮰愛德華氏菌的構建

參照杜以帥等[91的方法制備鮰愛德華氏菌電轉感受態(tài)細胞。分別取100 ng構建的pMDmCherry質粒和70μl鮰愛德華氏菌感受態(tài)細胞于預冷的1mm電轉杯中混勻，在2.1 kV、25 μF、400 Q條件下，快速電脈沖，脈沖時間為5 ms。電擊結束后加入l ml BHI培養(yǎng)液，在28℃100 r/min條件下振蕩培養(yǎng)3h。4℃.5 000 r/min離心10 min，棄掉800μl上清液，重懸細菌沉淀，取200μl轉化產物涂布于含羧芐青霉素（ Amp）抗性的BHI瓊脂平板上，28℃培養(yǎng)48 h。

1.4 mCherry標記的鮰愛德華氏菌的篩選與鑒定

1.4.1 熒光檢測取20μl的陽性克隆菌菌液均勻涂布在載玻片上，用TI-S熒光顯微鏡（Nikon，日本）下觀察，同時以野生菌株作為陰性對照，挑選能發(fā)出強烈紅色熒光信號的菌株。

1.4.2 PCR鑒定挑取發(fā)紅色熒光的菌株，用引物MCS/MCA進行PCR擴增，反應條件同方法1.2.1，PCR產物在1.0%瓊脂糖凝膠電泳回收后測序確認。

1.4.3 質粒穩(wěn)定性試驗參照李靜等[1O]的方法并改進，將標記好的細菌在含有Amp的BHI中28℃培養(yǎng)過夜，接種量為111 000（體積比），每24 h轉接1次。同時取200μl涂布于含Amp抗性的BHI瓊脂平板上，28℃培養(yǎng)24 h后，分別挑取單菌落在熒光顯微鏡下檢測，記錄熒光數(shù)。質粒穩(wěn)定率=發(fā)紅色熒光菌落數(shù)/總菌落數(shù)×100%。

1.5 標記的鮰愛德華氏菌在感染斑馬魚仔魚體內的動態(tài)分布檢測

健康的雌性斑馬魚與雄性斑馬魚進行交配，收集所產的受精卵。受精后12 h的受精卵用0.20mmol/L的1一苯基-2-硫脲浸泡，抑制黑色素生成。取剛孵化出膜的仔魚，經0. 020-/0 MS-222麻醉后，顯微注射標記鮰愛德華氏菌菌液（lx10CFU/ml），控制顯微注射液滴大小使注射體積為1 nl（即每尾仔魚100 CFU），分別在感染后Oh、12 h、24 h用激光共聚焦顯微鏡觀察標記細菌在魚體內的動態(tài)分布情況，另外設一個未感染組作為陰性對照。

1.6標記鮰愛德華氏菌與小鼠巨噬細胞體外的相互作用

RAW264.7傳代至8孔腔室載玻片中，每孔加入300μl新鮮DMEM細胞培養(yǎng)液（含10%胎牛血清），在5% CO2、37℃條件下培養(yǎng)20 h。為了便于觀察，細胞貼壁50%左右時，加入30μl經麥氏比濁法稀釋的標記鮰愛德華氏菌，終濃度為1×10CFU/ml，侵染時間分別為Oh、4h、24 h、48 h、72 h。侵染完成后用FluoView FV1200激光掃描共聚焦顯微鏡（Olympus Japan）進行觀察，另外設一個未感染組作為陰性對照。

2 結果與分析

2.1 重組表達質粒pMDmCherry的構建

以質粒PRUAL為模板，用特異性引物擴增啟動子基因，長度約300 bp（圖1）。以質粒pLVX-PAmCherry-C1為模板，用特異性引物擴增mCherry基因，長度約700 bp;2個片段連接擴增長度為1 000bp左右（圖1）。連接片段克隆至質粒pMD18-T，重組質粒雙酶切后，切出大小約為1000 bp和2 700bp 2條DNA片段，分別與pMD18-T和連接片段基因大小一致（圖1）。測序結果也顯示連接片段堿基沒有發(fā)生任何突變，即成功構建重組質粒pMDmCherry，構建圖譜見圖2。

2.2 mCherry標記的鮰愛德華氏菌的篩選與鑒定

陽性克隆菌用熒光顯微鏡觀察，篩選出了穩(wěn)定高效表達紅色熒光蛋白的菌株（圖3）。以篩選出的重組菌株為模板，用引物MCS/MCA進行PCR擴增，獲得700 bp左右的片段，經過測序確認為mCherry基因片段;目前標記菌株已傳至28代，所有菌落均發(fā)紅色熒光，質粒穩(wěn)定率可達100%。這些結果表明，重組質粒能夠在鲴愛德華氏菌中穩(wěn)定表達，紅色熒光標記鮰愛德華氏菌構建成功。

2.3 標記鮰愛德華氏菌在感染斑馬魚仔魚體內的動態(tài)分布

標記鮰愛德華氏菌顯微注射感染斑馬魚仔魚后，在感染部位及附近血管中呈現(xiàn)紅色熒光（圖4B）;感染12 h，紅色熒光增多，出現(xiàn)在仔魚內臟部位（圖4C）;感染24 h，在內臟、肌肉及血液中都有大量紅色熒光出現(xiàn)（圖4D）。陰性對照組無熒光（圖4A）。

2.4 標記鮰愛德華氏菌與小鼠巨噬細胞在體外的相互作用

激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，陰性對照組巨噬細胞貼壁生長，細胞形態(tài)呈較規(guī)則的圓形或橢圓形（圖SA）;感染Oh觀察到紅色標記細菌游離在培養(yǎng)基中，少量貼壁細胞開始變形，出現(xiàn)梭形細胞和多角形（圖SB）;感染4h，游離紅色標記細菌聚集增多，少量巨噬細胞開始吞噬標記細菌（圖5C）;感染24 h游離標記細菌大量增加，部分巨噬細胞吞噬病原菌（圖SD）;感染48 h，游離標記細菌減少，巨噬細胞內標記細菌大量增殖，有少量細胞破裂死亡（圖SE）;感染72 h，標記細菌明顯減少，巨噬細胞大量脫落死亡（圖SF）。

3 討論

應用現(xiàn)代生物技術對病原進行標記，觀察病原侵染軌跡，是研究病原致病過程，了解病原宿主相互作用機理的有效手段[12]。本研究目的是探討鮰愛德華氏菌在宿主體內的動態(tài)變化，研究病原菌與宿主的相互作用關系。為了跟蹤病原菌活體狀態(tài)下的致病過程，就需要選擇一種既穩(wěn)定又可靠的標記物。mCherry是一種來自于蘑菇珊瑚的紅色熒光蛋白，相對于其他熒光蛋白，mCherry具有對光致漂白作用耐受、熒光亮度高、光穩(wěn)定性卓越、可與綠色熒光蛋白共同標記研究對象等諸多優(yōu)點，因而得到廣泛的應用[13-15]。本研究利用電轉化法將紅色熒光蛋白基因mCherry導入zbl141菌株，得到的轉化菌株保持了和野生型相似的菌落形態(tài)，插入基因能穩(wěn)定遺傳，能使mCherry蛋白在入侵巨噬細胞及宿主的菌株中表現(xiàn)出高強度表達，使鮰愛德華氏菌致病機理的相關研究變得更加便捷。

合適的質粒載體和啟動子是決定mCherry重組質粒能否在鲴愛德華氏菌中高效穩(wěn)定表達的關鍵因素。pMD18-T是一種廣泛應用于高效克隆PCR產物的專用載體，這種載體拷貝數(shù)高，分子量較小，易于轉化，但其自身不帶啟動子。啟動子活性高低在很大程度上影響外源蛋白質的表達，研究結果表明慶大霉素抗性啟動子（ Gentamycin-resistancepromoter）能高效啟動GFP在諾卡氏菌（ⅣocardLabrasiliensis）中的表達[16-17]。本試驗中使用pMD18-T作為載體，利用慶大霉素抗性啟動子融合mCherry基因構建重組表達質粒，轉化至鮰愛德華氏菌中。熒光檢測結果表明，構建的質粒能在鮰愛德華氏菌中高效表達，且多次傳代后，標記細菌依然能夠發(fā)出較強的紅色熒光。

傳統(tǒng)的研究病原菌在動物體內侵染的動力學方法，主要是通過病原菌感染動物后，用平板培養(yǎng)活菌計數(shù)測定不同器官中病原菌含量，這是一種間接的方法，不能直觀反映病原菌的入侵情況，試驗動物間個體差異也會影響試驗結果的準確性[9];放射性標記的方法可以定量檢測細菌，但是放射性物質對生物體有毒性，且這種方法也不能區(qū)分死亡的和活的細菌[18]。本研究中利用構建的紅色熒光標記鮰愛德華氏菌后，通過顯微注射感染斑馬魚仔魚，由于斑馬魚仔魚身體是透明的，在激光共聚焦顯微鏡下借助綠色激光，可清晰觀察到斑馬魚體內的紅色標記細菌，在不處死動物的情況下可對魚體內病原菌的變化進行連續(xù)觀察，在同一動物身上能獲得一系列的動態(tài)試驗數(shù)據(jù)，更為直觀、綜合地了解整個感染過程，提高研究的效率。

巨噬細胞是天然免疫應答的主要效應細胞，可以有效吞噬和消化外來物質，它是機體抵御外來微生物侵襲的第一道防線[19-20]。有研究報道鮰愛德華氏菌是一種兼性細胞內寄生菌，它可以在斑點叉尾鲴和南方鲇等魚類宿主巨噬細胞中生存、繁殖[6，12]，因而了解鮰愛德華氏菌與巨噬細胞的相互作用關系，特別是研究鮰愛德華氏菌在巨噬細胞內入侵、存活及繁殖機制是研究鮰愛德華氏菌致病性的關鍵。馬慧等[22]將布魯氏菌（Brucella melitensis）體外感染小鼠巨噬細胞后，利用綠色熒光標記的菌株結合紅色熒光探針標記的溶酶體、內質網和高爾基體等細胞器，研究測定了侵染細菌與胞內各細胞器結合的時間，為布魯氏菌在細胞內的生存繁殖及其分子機制提供了理論參考。目前有學者建立了與鮰愛德華氏菌同屬的遲緩愛德華氏菌小鼠巨噬細胞感染模型，并用小鼠巨噬細胞進行了病原與宿主互作關系研究，發(fā)現(xiàn)了遲緩愛德華氏菌與宿主互作的新機制[ 23-24]。

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