張長(zhǎng)凱 郭小芳 盧偉 管洪在

[摘要]目的探討EB病毒（EBV）感染與惡性淋巴瘤（ML）病人染色體異常和免疫表型的關(guān)系以及EBV對(duì)ML預(yù)后的影響。方法采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（FQ-PCR）檢測(cè)150例ML病人（包括霍奇金淋巴瘤（HL）14例、非霍奇金淋巴瘤（NHL）136例）和37例正常人骨髓中的EBV-DNA拷貝數(shù)，應(yīng)用R顯帶技術(shù)分析染色體核型，應(yīng)用流式細(xì)胞儀（FCM）對(duì)ML進(jìn)行免疫分型，并對(duì)部分病人進(jìn)行臨床隨訪。結(jié)果150例ML病人中59例檢出EBV，陽(yáng)性率為39.3%;37例正常人中2例檢出EBV，陽(yáng)性率為5.4%，ML病人EBV陽(yáng)性率明顯高于對(duì)照組（χ2=13.60，P<0.01）。FCM分型B-NHL病人和T-NHL病人EBV陽(yáng)性率分別為36.4%（40/110）和38.5%（10/26），兩者差異無(wú)顯著性（χ2=0.04，P>0.05）。R顯帶核型分析顯示，EBV陽(yáng)性病人和EBV陰性病人染色體異常率分別為16.9%（10/59）和13.2%（12/91），染色體異常與EBV感染無(wú)顯著相關(guān)性（χ2=0.16，P>0.05）。臨床隨訪顯示，EBV陽(yáng)性組和EBV陰性組2年內(nèi)復(fù)發(fā)率分別為56.1%（23/41）和31.7%（20/63），病死率分別為24.4%（10/41）和3.2%（2/63），兩組比較差異均有顯著性（χ2=6.10、10.80，P<0.05）。結(jié)論EBV感染與ML病人免疫表型和染色體異常無(wú)關(guān);EBV陽(yáng)性ML病人復(fù)發(fā)率和病死率高，預(yù)后不良。

[關(guān)鍵詞]淋巴瘤;方法，核型分析;皰疹病毒4型，人;實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng);免疫表型分型

[中圖分類號(hào)]R733.4;R373.9[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A[文章編號(hào)]2096-5532（2019）03-0275-05

[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the association of Epstein-Barr virus （EBV） infection with chromosomal abnormalities and immunophenotype in patients with malignant lymphoma （ML） and the influence of EBV on the prognosis of ML. Me-thodsQuantitative real-time PCR was used to measure the copy number of EBV-DNA in bone marrow from 150 patients with ML （14 patients with Hodgkin lymphoma （HL） and 136 patients with non-Hodgkin lymphoma （NHL）） and 37 healthy individuals. The R-banding technique was used to analyze karyotype， and flow cytometry （FCM） was used to determine the immunophenotype of ML patients. Clinical follow-up was performed for some patients. ResultsOf all 150 patients with ML， 59 had EBV infection， resulting in a positive rate of 39.3%; among the 37 healthy individuals， 2 were found to have EBV infection， resulting in a positive rate of 5.4%; the patients with ML had a significantly higher EBV positive rate than healthy individuals （χ2=13.60，P<0.01）. The 136 patients with NHL were divided into B-NHL group with 110 patients and T-NHL group with 26 patients according to FCM， and there was no significant difference in EBV positive rate between the two groups （36.4% （40/110） vs 38.5% （10/26）， χ2=0.04，P>0.05）. The R-banding technique showed a rate of chromosomal abnormalities of 16.9% （10/59） in EBV-positive patients and 13.2% （12/91） in EBV-negative patients， and there was no significant association between chromosome abnormality and EBV infection （χ2=0.16，P>0.05）. Clinical follow-up showed that there were significant differences between the EBV-positive patients and the EBV-negative patients in 2 year recurrence rate （56.1% （23/41） vs 31.7% （20/63）， χ2=6.10，P<0.05） and mortality rate （24.4% （10/41） vs 3.2% （2/63）， χ2=10.80，P<0.05）.ConclusionEBV infection is not associated with immunophenotype and chromosomal abnormalities in patients with ML， and EBV-positive ML patients tend to have high recurrence and mortality rates and poor prognosis.

[KEY WORDS]lymphomas; karyotyping; herpesvirus 4， human; real-time polymerase chain reaction; immunophenotyping

惡性淋巴瘤（ML）是一組起源于淋巴結(jié)或其他淋巴組織的惡性腫瘤，分為霍奇金淋巴瘤（HL）和非霍奇金淋巴瘤（NHL）兩大類[1]。ML占全世界所有惡性腫瘤的3.37%，我國(guó)ML以NHL常見[2]，發(fā)病年齡多在20～40歲。ML的病因目前尚不清楚，病毒感染、染色體易位、癌基因激活及其蛋白產(chǎn)物的作用可能在淋巴瘤的發(fā)病中起重要作用。EB病毒（EBV）是一種人類4型皰疹病毒，在人群中普遍易感。EBV與伯基特淋巴瘤（BL）等多種疾病密切相關(guān)[3]，但關(guān)于EBV感染與ML染色體畸變和免疫表型的關(guān)系報(bào)道較少。因此，本研究通過實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（FQ-PCR）檢測(cè)EBV-DNA拷貝數(shù)來(lái)探討EBV感染與ML免疫表型、染色體畸變以及預(yù)后的關(guān)系。

1資料和方法

1.1一般資料

研究對(duì)象均來(lái)自于青島大學(xué)附屬醫(yī)院2013年1月1日—2017年12月31日收治的病人。實(shí)驗(yàn)組150例ML病人（包括136例NHL和14例HL），男72例，女78例;年齡15～79歲，中位年齡51歲。ML診斷符合2008年世界衛(wèi)生組織造血及淋巴組織腫瘤分類的標(biāo)準(zhǔn)[1]。對(duì)照組37例為無(wú)任何血液系統(tǒng)疾病且骨髓常規(guī)正常的病人，男18例，女19例;年齡17～43歲，中位年齡43歲。

1.2標(biāo)本采集及DNA提取

在無(wú)菌條件下采集研究對(duì)象的骨髓液2 mL，置于肝素抗凝管中。將標(biāo)本離心去上清液后轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，用PBS緩沖液洗滌3次，再加入SNET裂解液1 mL和0.1 g/L的蛋白酶K 35 μL，將離心管顛倒混合均勻，52 ℃消化2 h。采用常規(guī)苯酚-氯仿-異戊醇法提取骨髓細(xì)胞中的DNA，用核酸蛋白檢測(cè)儀測(cè)定提取DNA的純度和濃度。

1.3EBV-DNA擴(kuò)增

EBV核酸擴(kuò)增FQ-PCR檢測(cè)試劑盒（中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司）包含EBV-PCR反應(yīng)液（引物序列見表1）、Tap酶、dNTPs、陰性質(zhì)控品、臨界陽(yáng)性質(zhì)控品、強(qiáng)陽(yáng)性質(zhì)控品、EBV陽(yáng)性定量標(biāo)準(zhǔn)品（包括107、108、109、1010copies/L，用以構(gòu)建FQ-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線）。向PCR反應(yīng)管（管中含有EBV-PCR反應(yīng)液、Taq酶、dNTPs）中加入DNA模板2 μL，震蕩混勻后再離心數(shù)秒，置于SLAN-96P熒光定量PCR儀（上海宏石醫(yī)療科技有限公司）中擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為：93 ℃預(yù)變性2 min;93 ℃、45 s，55 ℃、60 s，10個(gè)循環(huán);93 ℃、30 s，55 ℃、45 s，30個(gè)循環(huán)。檢測(cè)系統(tǒng)自動(dòng)顯示EBV核酸擴(kuò)增的動(dòng)力學(xué)曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線，所有標(biāo)本均重復(fù)檢測(cè)3次。檢測(cè)下限為106copies/L，EBV-DNA拷貝數(shù)低于檢測(cè)下限為EBV陰性。

1.4免疫分型

采用流式細(xì)胞儀（FCM）測(cè)定骨髓標(biāo)本中細(xì)胞的免疫表型。參照2008年世界衛(wèi)生組織的分類法對(duì)ML的免疫表型進(jìn)行分析。采用CD45/側(cè)向散射光強(qiáng)度（SSC）設(shè)門，分析10 000個(gè)細(xì)胞并計(jì)算細(xì)胞表面特定抗原的表達(dá)水平。B細(xì)胞標(biāo)記抗原為CD10、CD19、CD20、CD23、cCD79a，T細(xì)胞標(biāo)記抗原為CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8?？乖磉_(dá)小于20%判定為陰性，抗原表達(dá)在20%～50%之間為可疑陽(yáng)性，抗原表達(dá)超過50%為陽(yáng)性[4]。Kappa/lambda比值大于3.0或小于0.5支持B-NHL[5-6]。CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8標(biāo)記抗原陽(yáng)性支持T-NHL。

1.5細(xì)胞遺傳學(xué)分析

在ML特異性治療前，應(yīng)用R顯帶技術(shù)對(duì)培養(yǎng)24 h的骨髓細(xì)胞進(jìn)行核型分析。每個(gè)樣本分析10個(gè)中期細(xì)胞，核型根據(jù)國(guó)際人類細(xì)胞遺傳學(xué)命名系統(tǒng)（2009）進(jìn)行分類。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 21.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)分析連續(xù)變量是否服從正態(tài)分布，非正態(tài)分布計(jì)量資料的比較采用非參數(shù)檢驗(yàn);各組間EBV陽(yáng)性率的比較采用χ2檢驗(yàn);EBV感染與ML病人復(fù)發(fā)率和病死率的關(guān)系分析采用Log-rank檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1ML病人EBV感染率

本文150例ML病人中59例檢出EBV，陽(yáng)性率為39.3%;37例正常人中2例檢出EBV，陽(yáng)性率為5.4%，ML病人的EBV陽(yáng)性率明顯高于對(duì)照組（χ2=13.60，P<0.01）。NHL和HL病人EBV陽(yáng)性率分別為36.7%（50/136）和64.3%（9/14），HL病人EBV陽(yáng)性率明顯高于NHL病人（χ2=4.03，P<0.05）。

2.2EBV感染與NHL免疫分型

FCM免疫分型顯示，136例NHL病人中，110例為B-NHL，26例為T-NHL。B-NHL和T-NHL病人EBV陽(yáng)性率分別為36.4%（40/110）和38.5%（10/26），兩者之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.04，P>0.05）。

2.3EBV感染與染色體異常

R顯帶核型分析顯示，ML病人的染色體異常率為14.7%（22/150），染色體異常以復(fù)雜異常為主（指存在≥3個(gè)染色體畸變，包括至少1個(gè)結(jié)構(gòu)畸變）。見表2。EBV陽(yáng)性病人和EBV陰性病人染色體異常率分別為16.9%（10/59）和13.2%（12/91），染色體異常與EBV感染無(wú)顯著相關(guān)性（χ2=0.16，P>0.05）。

2.4EBV感染與預(yù)后

截止到2017年12月31日，共隨訪到104例病人（EBV陽(yáng)性41例，EBV陰性63例）。EBV陽(yáng)性組和EBV陰性組2年內(nèi)復(fù)發(fā)率分別為56.1%（23/41）和31.7%（20/63），病死率分別為24.4%（10/41）和3.2%（2/63），EBV陽(yáng)性組的復(fù)發(fā)率和病死率明顯高于EBV陰性組，差異均有顯著意義（χ2=6.10、10.80，P<0.05）。在EBV陽(yáng)性組中，死亡病人的EBV-DNA含量為0.60（2.08）×1010 copies/L，生存病人的EBV-DNA含量為1.83（1.71）×108copies/L，死亡病人的EBV-DNA含量顯著高于生存病人（Z=4.76，P<0.05）。Kaplan-Meier生存分析顯示，與EBV陰性病人相比，EBV陽(yáng)性病人的生存期明顯縮短（圖1）。

與EBV陰性病人相比，EBV陽(yáng)性病人的生存期顯著縮短。

3討論

流行病學(xué)研究表明，多種潛在危險(xiǎn)因素與ML有關(guān)，其中最受關(guān)注的是免疫抑制和病毒感染，約15%的人類淋巴瘤與病毒感染（最常見的是EBV）有關(guān)[7]。有文獻(xiàn)報(bào)道，90%以上的人建立了EBV終生潛伏感染狀態(tài)[8]。研究已證明，EBV感染與傳染性單核細(xì)胞增多癥、鼻咽癌、BL等多種疾病密切相關(guān)[9-10]。另有研究發(fā)現(xiàn)，EBV感染與ML的發(fā)生密切相關(guān)[11]。故本研究探討了EBV感染與ML免疫分型、細(xì)胞遺傳學(xué)異常及預(yù)后的關(guān)系。

本文研究結(jié)果顯示，ML病人的EBV陽(yáng)性率為39.3%，明顯高于對(duì)照組，表明EBV感染與ML的發(fā)生密切相關(guān)。HL和NHL病人的EBV陽(yáng)性率分別為64.3%和36.7%，HL病人EBV感染率顯著高于NHL病人，這一結(jié)果與LIU等[12]的報(bào)道一致。與NHL相比，EBV感染與HL發(fā)病的關(guān)系更為密切。目前對(duì)于EBV的致瘤機(jī)制還不清楚，有兩種可能途徑：①EBV感染宿主細(xì)胞后，EBV基因整合到宿主基因組中[13]，使宿主基因組發(fā)生突變，引起腫瘤的發(fā)生;②EBV編碼的產(chǎn)物促進(jìn)腫瘤的發(fā)生，如EBV編碼的LMP1是一種致瘤性潛伏膜蛋白，它能夠抑制細(xì)胞DNA損傷修復(fù)[14]，激活PI3K/Akt通路及其他信號(hào)傳導(dǎo)通路[15]。EBV在ML發(fā)病中的作用及其分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

EBV主要通過CD21和病毒糖蛋白gp350/220感染B細(xì)胞[16]，但有研究表明，EBV也可以感染T細(xì)胞、NK細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞[9]。為探討EBV感染與NHL免疫分型的關(guān)系，本研究采用FCM對(duì)NHL進(jìn)行免疫分型，結(jié)果顯示，B-NHL和T-NHL病人的EBV陽(yáng)性率分別為36.4%和38.5%，兩者間差異無(wú)顯著性，與ABADI等[17]的結(jié)果一致。上述結(jié)果表明，EBV感染可能與ML的免疫表型無(wú)關(guān)。

有關(guān)研究報(bào)道，大約90%的ML有染色體異常[18]，某些染色體異常與ML的組織學(xué)及免疫學(xué)亞型相關(guān)，如t（14;18）（q32;q21）見于濾泡性淋巴瘤，而t（3;22）（q27;q11）常見于彌漫性大B淋巴細(xì)胞瘤等。本研究ML病人的染色體異常率為14.7%，這一結(jié)果低于有關(guān)報(bào)道[18]。一方面，可能是因?yàn)楸狙芯糠治龅氖枪撬杓?xì)胞，淋巴瘤細(xì)胞可能還沒有浸潤(rùn)到骨髓中;另一方面，可能是因?yàn)槌Ｒ?guī)的細(xì)胞遺傳學(xué)分析無(wú)法檢測(cè)到一些細(xì)微的染色體改變。最近有研究者利用熒光原位雜交（FISH）和分子遺傳學(xué)技術(shù)觀察到，EBV感染導(dǎo)致BL與鼻咽癌基因組的不穩(wěn)定[19-21]。本文沒有發(fā)現(xiàn)EBV感染與ML染色體異常相關(guān)的證據(jù)。因此，要想闡明EBV感染在ML相關(guān)染色體畸變中的作用，可能需要細(xì)胞遺傳學(xué)結(jié)合FISH和分子生物學(xué)等技術(shù)進(jìn)一步的研究。

苗紅霞等[22]研究結(jié)果表明，EBV感染是急性淋巴細(xì)胞白血病預(yù)后不良因素。本研究結(jié)果顯示，EBV陽(yáng)性ML病人復(fù)發(fā)率及病死率高于EBV陰性ML病人，EBV陰性ML病人的生存時(shí)間長(zhǎng)于EBV陽(yáng)性的ML病人，EBV陽(yáng)性ML病人的臨床預(yù)后較差。GRYWALSKA等[23]研究表明，EBV-DNA的拷貝數(shù)與慢性淋巴細(xì)胞白血病不良預(yù)后有關(guān)。本研究結(jié)果也顯示，在EBV陽(yáng)性ML病人中，死亡病人的EBV-DNA拷貝數(shù)高于生存病人，EBV-DNA含量與ML不良預(yù)后有關(guān)，表明檢測(cè)EBV-DNA含量對(duì)于評(píng)估病人病情及預(yù)后有重要意義。

總之，EBV感染參與了ML的發(fā)病過程并且與其預(yù)后不良有關(guān)，但對(duì)ML的免疫表型無(wú)影響，與ML的染色體異常也無(wú)明顯相關(guān)性。EBV感染在ML發(fā)病中的作用及其分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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（本文編輯 馬偉平）