閆飛 薛曉梅 李海龍 賀玉偉 李長(zhǎng)貴 崔凌凌

[摘要]目的構(gòu)建單核細(xì)胞特異性KCNQ1基因條件性敲除小鼠模型。方法將KCNQ1flox/flox轉(zhuǎn)基因小鼠與特異性表達(dá)cre酶的Lyz2-cre+工具鼠進(jìn)行雜交，鑒定其子代小鼠基因型，并檢測(cè)血尿酸（SUA）、空腹血糖（FPG）、三酰甘油（TG）、膽固醇（TC）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、尿素氮（BUN）、肌酐（CRE）等生化指標(biāo)和血清白細(xì)胞介素1β（IL-1β）水平。結(jié)果獲得KCNQ1flox/flox/Lyz2-cre+小鼠，其各項(xiàng)生化指標(biāo)與野生型小鼠比較差異無(wú)顯著性（P>0.05），但血清IL-1β水平顯著降低（t=3.622，P<0.05）。結(jié)論成功構(gòu)建單核細(xì)胞特異性KCNQ1基因條件性敲除小鼠模型;KCNQ1可能通過(guò)對(duì)單核細(xì)胞內(nèi)IL-1β的調(diào)節(jié)作用參與痛風(fēng)的炎癥反應(yīng)過(guò)程。

[關(guān)鍵詞]KCNQ1鉀通道;痛風(fēng);小鼠，基因敲除;模型，動(dòng)物;白細(xì)胞介素1β

[中圖分類(lèi)號(hào)]R-332[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A[文章編號(hào)]2096-5532（2019）03-0262-04

[ABSTRACT]ObjectiveTo establish a mouse model of conditional knockout of the monocyte-specific KCNQ1 gene. MethodsKCNQ1flox/flox transgenic mice were hybridized with Lyz2-cre+ mice that specifically expressed cre enzyme， and then the genotypes of their offspring were identified. Meanwhile， biochemical parameters， such as serum uric acid （SUA）， fasting plasma glucose （FPG）， triglycerides （TG）， total cholesterol （TC）， alanine aminotransferase （ALT）， aspartate aminotransferase （AST）， blood urea nitrogen （BUN）， and creatinine （CRE）， along with serum interleukin-1β （IL-1β） were also determined. ResultsKCNQ1flox/flox/Lyz2-cre+ mice were obtained， and there were no significant differences in biochemical parameters between the KCNQ1flox/flox/Lyz2-cre+ mice and wild-type mice （P>0.05）， but the KCNQ1flox/flox/Lyz2-cre+ mice had a significant reduction in serum IL-1β compared with the wild-type mice （t=3.622，P<0.05）. ConclusionThe mouse model of conditional knockout of monocyte-specific KCNQ1 gene was successfully established. KCNQ1 may participate in the inflammatory process of gout by regulating IL-1β in monocytes.

[KEY WORDS]KCNQ1 potassium channel; gout; mice， knockout; models， animal; ?interleukin-1beta

KCNQ1基因于1996年在人類(lèi)遺傳性LQT綜合征中首次被發(fā)現(xiàn)[1]，該基因位于染色體11p15.5區(qū)，包括17個(gè)外顯子。KCNQ1基因編碼的蛋白為電壓門(mén)控性鉀離子通道KQT樣亞家族成員，在人類(lèi)組織中廣泛表達(dá)[2-3]。KCNQ1和KCNE家族蛋白相互作用，裝配成功能性鉀通道，例如心肌細(xì)胞中KCNQ1/KCNE1裝配形成慢性激活延遲整流鉀通道，參與心肌細(xì)胞復(fù)極過(guò)程，胃黏膜細(xì)胞及腎小管上皮細(xì)胞中KCNQ1/KCNE2參與胃酸的分泌和水鹽代謝等重要生理作用[4-6]。因此，KCNQ1基因突變及其表達(dá)水平的變化與人類(lèi)多種疾病的發(fā)生密切相關(guān)。KCNQ1基因突變會(huì)導(dǎo)致遺傳性LQT綜合征和家族性心房顫動(dòng)，除此之外，KCNQ1基因多態(tài)性與2型糖尿病及糖尿病性腎病有關(guān)[7-9]。LI等[10]應(yīng)用全基因組關(guān)聯(lián)分析（GWAS）發(fā)現(xiàn)，KCNQ1基因單核苷酸多態(tài)性（rs179785，G>A）與痛風(fēng)發(fā)生緊密相關(guān)。王靜[11]的研究顯示，痛風(fēng)病人外周血單核細(xì)胞中KCNQ1的表達(dá)水平明顯高于健康人群，提示KCNQ1可能通過(guò)影響單核細(xì)胞功能參與痛風(fēng)的發(fā)病過(guò)程，但具體機(jī)制不清。為探討KCNQ1在痛風(fēng)發(fā)病中的作用及其機(jī)制，本研究應(yīng)用Cre-Loxp系統(tǒng)條件性基因敲除技術(shù)構(gòu)建外周血單核細(xì)胞KCNQ1基因條件性敲除小鼠模型，并對(duì)該小鼠模型的生化指標(biāo)及痛風(fēng)關(guān)鍵炎癥因子白細(xì)胞介素1β（IL-1β）的表達(dá)進(jìn)行初步分析。

1材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

KCNQ1 cKO小鼠（KCNQ1flox/flox）及特異性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的Lyz2-cre工具鼠均購(gòu)自上海南方模式生物有限公司。小鼠在青島大學(xué)附屬醫(yī)院科研實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)動(dòng)物房?jī)?nèi)進(jìn)行繁殖和實(shí)驗(yàn)。小鼠養(yǎng)殖的環(huán)境溫度為（23±2）℃，濕度為（48±5）%，每天光照時(shí)間為12 h。小鼠飼養(yǎng)籠、墊料及飲用水均經(jīng)過(guò)高溫高壓滅菌處理。小鼠喂以嚙齒類(lèi)動(dòng)物繁殖飼料，自由進(jìn)食和飲水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)獲得青島大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2主要的儀器和試劑

CFX 96熒光定量PCR 儀和凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)BIO-RAD公司），全自動(dòng)生化分析儀（日本東芝公司），酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒（NEO公司），低溫超速離心機(jī)（美國(guó)SIGMA公司）。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1獲得KCNQ1flox/flox/Lyz2-cre+小鼠的交配策略小鼠按雄∶雌=1∶2的比例交配。首先讓KCNQ1flox/flox小鼠與特異性表達(dá)cre酶的Lyz2-cre+工具鼠進(jìn)行交配，以獲得KCNQ1flox/+/Lyz2-cre+雜合子小鼠。然后讓KCNQ1flox/+/Lyz2-cre+雜合子小鼠互相交配，鑒定和篩選后獲得基因型為KCNQ1flox/flox/Lyz2-cre+的單核細(xì)胞KCNQ1基因條件性敲除小鼠（KCNQ1 cKO小鼠），以同窩出生的基因型為KCNQ1+/+/Lyz2-cre-的小鼠作為野生型（WT）對(duì)照。

1.3.2子代小鼠基因型鑒定待鑒定小鼠生長(zhǎng)至2周齡時(shí)剪取3 mm左右的鼠尾置于1.5 mL的EP管中，加入40 μL的NaOH溶液（50 mmol/L），在95 ℃金屬浴中以350 r/min離心20 min，再加入40 μL Tris HCl渦旋震蕩混勻，以12 000 r/min離心10 min，獲得基因組DNA產(chǎn)物，用于PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系為20 μL：2×Taq Plus Master Mix 1 10 μL，上、下游引物各0.5 μL，ddH2O 5 μL，含基因組DNA 的裂解產(chǎn)物4 μL。KCNQ1及Lyz2-cre引物由生工生物工程有限公司合成，序列見(jiàn)表1。KCNQ1和Lyz2-cre反應(yīng)條件：94 ℃、3 min;94 ℃、30 s，55 ℃、45 s，72 ℃、1 min，35個(gè)循環(huán);72 ℃、5 min。取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在15 g/L瓊脂糖凝膠中電泳，用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。當(dāng)KCNQ1基因擴(kuò)增產(chǎn)物僅在583 bp出現(xiàn)條帶時(shí)小鼠的基因型為KCNQ1flox/flox，僅在480 bp出現(xiàn)條帶時(shí)小鼠基因型為KCNQ1+/+，在583 bp和480 bp同時(shí)出現(xiàn)條帶時(shí)小鼠的基因型為KCNQ1flox/+;當(dāng)Lyz2-cre基因擴(kuò)增產(chǎn)物在700 bp出現(xiàn)條帶時(shí)小鼠的基因型則為L(zhǎng)yz2-cre+。

1.3.3KCNQ1 cKO小鼠和WT小鼠血生化指標(biāo)的檢測(cè)待KCNQ1 cKO小鼠和WT小鼠生長(zhǎng)至8周齡時(shí)，各取8只，經(jīng)內(nèi)眥靜脈取血500 μL，然后以3 500 r/min離心10 min后獲得血清。采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)兩組小鼠血尿酸（SUA）、空腹血糖（FPG）、三酰甘油（TG）、膽固醇（TC）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、尿素氮（BUN）、肌酐（CRE）的水平。

1.3.4KCNQ1 cKO小鼠和WT小鼠血清IL-1β水平檢測(cè)采用ELISA 法，按照試劑盒中提供的操作步驟進(jìn)行檢測(cè)。

1.4數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所得計(jì)量資料數(shù)據(jù)以±s表示，KCNQ1 cKO小鼠和WT小鼠間血生化指標(biāo)及IL-1β水平的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1基因型鑒定

對(duì)子代小鼠基因型鑒定顯示，KCNQ1flox/flox小鼠僅在583 bp處出現(xiàn)條帶，而KCNQ1flox/+小鼠在583 bp和480 bp處同時(shí)出現(xiàn)條帶，KCNQ1+/+僅在480 bp處出現(xiàn)條帶;Lyz2-cre+小鼠在700 bp處出現(xiàn)條帶，而Lyz2-cre-小鼠在350 bp處出現(xiàn)條帶。其中157號(hào)小鼠的基因型為KCNQ1flox/flox/Lyz2-cre+，表明單核細(xì)胞特異性KCNQ1基因條件敲除小鼠模型構(gòu)建成功。見(jiàn)圖1。

2.2KCNQ1 cKO小鼠和WT小鼠血生化指標(biāo)的比較

KCNQ1 cKO小鼠各項(xiàng)血生化指標(biāo)與WT小鼠比較差異均無(wú)顯著性（P>0.05）。見(jiàn)表2。

2.3KCNQ1 cKO小鼠和WT小鼠血清IL-1β水平比較

KCNQ1 cKO小鼠和WT小鼠血清IL-1β水平分別為（480.02±130.64）、（689.92±57.85）ng/L，KCNQ1 cKO小鼠血清IL-1β水平明顯低于WT小鼠（t=3.622，P<0.05）。

3討論

條件性基因敲除具有時(shí)間和空間可控性，可以實(shí)現(xiàn)體內(nèi)特定種類(lèi)器官或組織中的基因敲除，避免了因某些基因完全敲除所導(dǎo)致的胚胎死亡、發(fā)育畸形、早夭等問(wèn)題[12-13]。條件性基因敲除小鼠廣泛應(yīng)用于人類(lèi)疾病動(dòng)物模型建立及人類(lèi)疾病發(fā)病機(jī)制、基因功能鑒定和表型分析等研究[14]。本研究利用條件性基因敲除技術(shù)在國(guó)際上首次實(shí)現(xiàn)了單核細(xì)胞特異性KCNQ1基因條件性敲除。初步研究顯示，基因敲除小鼠發(fā)育良好，并沒(méi)有出現(xiàn)早期胚胎死亡、胚胎發(fā)育畸形等問(wèn)題，生化指標(biāo)正常。該動(dòng)物模型的建立是條件性敲除技術(shù)在痛風(fēng)功能基因研究領(lǐng)域中的一個(gè)重要應(yīng)用。

KCNQ1基因位于染色體11p15.5區(qū)，所編碼的電壓門(mén)控性鉀離子通道蛋白由676個(gè)氨基酸構(gòu)成，包括6個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域和1個(gè)具有離子選擇性的p-loop結(jié)構(gòu)域。KCNQ1基因廣泛表達(dá)于人類(lèi)組織中，該基因的突變及表達(dá)異常與人類(lèi)多種疾病的發(fā)生密切相關(guān)[2-3，15]。KCNQ1在心臟中表達(dá)水平最高，與KCNE共同形成慢性延遲整流性鉀通道，參與心臟的復(fù)極過(guò)程。KCNQ1突變會(huì)導(dǎo)致許多與心律失常有關(guān)的疾病，如LQT綜合征1型、JLN綜合征1型和嬰兒猝死綜合征等，猝死率高達(dá)10%～20%[7，16]。多項(xiàng)研究結(jié)果表明，KCNQ1基因多態(tài)性改變與2型糖尿病有關(guān)，KCNQ1危險(xiǎn)等位基因變異影響胰島β細(xì)胞分泌功能，導(dǎo)致胰島素的分泌減少，影響正常的血糖調(diào)節(jié)，使2型糖尿病的發(fā)生概率增加了30%～40%[8，17]。腎臟遠(yuǎn)曲小管分布有KCNQ1/KCNE3通道，參與K+分泌，調(diào)節(jié)機(jī)體的水電解質(zhì)平衡，抑制KCNQ1基因表達(dá)會(huì)引起腎臟發(fā)育異常及濾過(guò)率降低[9]。KCNQ1在內(nèi)耳、胃、胰腺等組織中也有一定的表達(dá)，KCNQ1基因突變或敲除的小鼠出現(xiàn)耳聾、胃腸發(fā)育異常、胰腺分泌異常等表型，但在人體中上述表型比較少見(jiàn)。本研究建立的單核細(xì)胞特異性KCNQ1基因條件性敲除小鼠模型發(fā)育良好，未出現(xiàn)上述表型，各血生化指標(biāo)與WT小鼠比較差異均無(wú)顯著性。分析原因可能為，該小鼠模型特異性敲除外周血單核細(xì)胞的KCNQ1基因，其心肌、胃腸、胰腺、腎臟等組織中KCNQ1基因表達(dá)正常，功能不受影響。

高尿酸血癥是痛風(fēng)發(fā)病的生化基礎(chǔ)，臨床上有10%～20%的高尿酸血癥病人可以發(fā)展為痛風(fēng)[18]。自然免疫系統(tǒng)被激活是高尿酸血癥導(dǎo)致痛風(fēng)的主要機(jī)制。尿酸濃度超過(guò)其在血中的飽和度（SUA>420 μmol/L）將形成尿酸鹽結(jié)晶，沉積在關(guān)節(jié)及其周?chē)M織等處。尿酸鹽晶體在關(guān)節(jié)及其周?chē)M織的沉積，導(dǎo)致單核細(xì)胞趨化并吞噬尿酸鹽晶體，釋放促炎因子，這些炎性遞質(zhì)會(huì)募集大量的單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞到達(dá)尿酸鹽晶體所在部位，放大炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，引起痛風(fēng)的發(fā)作[19-22]。炎性通路中任何環(huán)節(jié)的異常均可導(dǎo)致痛風(fēng)發(fā)作。研究表明，IL-1β是痛風(fēng)發(fā)病過(guò)程中具有關(guān)鍵調(diào)控功能的細(xì)胞因子，它能

3期閆飛，等. 單核細(xì)胞特異性KCNQ1基因條件性敲除小鼠模型的建立及初步分析265

引起中性粒細(xì)胞遷出至滑膜和關(guān)節(jié)液中，這是急性炎癥反應(yīng)的病理標(biāo)志[23]。MARTIN等[24]的研究發(fā)現(xiàn)，尿酸鹽晶體注入踝關(guān)節(jié)引起的炎癥反應(yīng)在IL-1受體敲除的小鼠中明顯降低。本文研究結(jié)果顯示，KCNQ1 cKO小鼠的血清IL-1β水平明顯低于WT小鼠，表明KCNQ1可能通過(guò)調(diào)節(jié)單核細(xì)胞中IL-1β水平參與痛風(fēng)的炎癥反應(yīng)過(guò)程。

綜上所述，本研究成功建立了外周血單核細(xì)胞特異性KCNQ1基因條件性敲除小鼠模型;初步分析KCNQ1基因可能通過(guò)影響單核細(xì)胞的炎癥反應(yīng)參與痛風(fēng)的發(fā)病過(guò)程，但具體機(jī)制尚不清楚。本研究為深入探討KCNQ1參與痛風(fēng)發(fā)病的機(jī)制，乃至后續(xù)的痛風(fēng)精準(zhǔn)醫(yī)療和痛風(fēng)治療藥物的開(kāi)發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

[參考文獻(xiàn)]

[1]WANG Q， CURRAN M E， SPLAWSKI I， et al. Positional cloning of a novel potassium channel gene： KVLQT1 mutations cause cardiac arrhythmias[J]. ?Nature Genetics， 1996，12（1）：17-23.

[2]景紅娟，何光源. KCNQ1通道的結(jié)構(gòu)和功能[J]. ?中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)， 2007，23（12）：1548-1551.

[3]SPLAWSKI I， SHEN J， TIMOTHY K W， et al. Genomic structure of three long QT syndrome genes：KVLQT1， HERG， and KCNE1[J]. ?Genomics， 1998，51（1）：86-97.

[4]SEIDLER U， BACHMANN O， JACOB P， et al. Na+/HCO-3 cotransport in normal and cystic fibrosis intestine[J]. ?JOP： Journal of the Pancreas， 2001，2（4）：247-256.

[5]ABRAMOCHKIN D V， HASSINEN M， VORNANEN M. Transcripts of Kv7.1 and MinK channels and slow delayed rectifier K+ current （IKs） are expressed in zebrafish （Danio rerio） heart[J]. ?Pflugers Archiv， 2018，470（12）：1753-1764.

[6]SONG P， GROOS S， RIEDERER B， et al. KCNQ1 is the luminal K+ recycling channel during stimulation of gastric acid secretion[J]. ?The Journal of Physiology， 2009，587（15）：3955-3965.

[7]MOSS A J， SHIMIZU W， WILDE A A， et al. Clinical aspects of type-1 long-QT syndrome by location， coding type， and biophysical function of mutations involving the KCNQ1 gene[J]. ?Circulation， 2007，115（19）：2481-2489.

[8]LIU Y， ZHOU D Z， ZHANG D， et al. Variants in KCNQ1 are associated with susceptibility to type 2 diabetes in the po-pulation of mainland China[J]. ?Diabetologia， 2009，52（7）：1315-1321.

[9]LIU C T， GARNAAS M K， TIN A， et al. Genetic association for renal traits among participants of African ancestry reveals new loci for renal function[J]. ?PLoS Genetics， 2011，7（9）：e1002264.

[10]LI Changgui， LI Zhiqiang， LIU Shiguo， et al. Genome-wide association analysis identifies three new risk loci for gout arthritis in Han Chinese[J]. ?Nature Communications， 2015，6：7041.

[11]王靜. 原發(fā)性痛風(fēng)易感基因KCNQ1基因的單核苷酸多態(tài)性對(duì)基因表達(dá)及單核細(xì)胞功能影響的研究[D]. ?青島：青島大學(xué)， 2017.

[12]孔維健，常宇鑫，昝春芳，等. 基于Cre-loxP系統(tǒng)條件性基因敲除小鼠的構(gòu)建及其應(yīng)用進(jìn)展[J]. ?中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)， 2017，21（12）：2208-2211.

[13]SUN Xiaodong， FU Xiaoying， LI Jie， et al. Heterozygous deletion of Atbf1 by the Cre-loxP system in mice causes preweaning mortality[J]. ?Genesis， 2012，50（11）：819-827.

[14]CASH-PADGETT T， SAWA A， JAARO-PELED H. Increased stereotypy in conditional Cxcr4 knockout mice[J]. ?Neuroscience Research， 2016，105：75-79.

[15]FAN Haiyan， ZHANG Meng， LIU Wei. Hypermethylated KCNQ1 acts as a tumor suppressor in hepatocellular carcinoma[J]. ?Biochemical and Biophysical Research Communications， 2018，503（4）：3100-3107.

[16]SKINNER J R， WINBO A， ABRAMS D， et al. Channelopathies that lead to sudden cardiac death：clinicaland genetic aspects[J]. ?Heart Lung and Circulation， 2019，28（1，SI）：22-30.

[17]BEEN L F， RALHAN S， WANDER G S， et al. Variants in KCNQ1 increase type Ⅱ diabetes susceptibility in South Asians： a study of 3，310 subjects from India and the US[J]. ?BMC Medical Genetics， 2011，12（1）：18.

[18]RICHETTE P， BARDIN T. Gout[J]. ?Lancet， 2010，375（9711）：318-328.

[19]MARTIN W J， HARPER J L. Innate inflammation and resolution in acute gout[J]. ?Immunology and Cell Biology， 2010，88（1）：15-19.

[20]MARTIN W J， SHAW O， LIU X， et al. Monosodium urate monohydrate crystal-recruited noninflammatory monocytes differentiate into M1-like proinflammatory macrophages in a peritoneal murine model of gout[J]. ?Arthritis and Rheumatism， 2011，63（5）：1322-1332.

[21]CHEN C J， SHI Y， HEARN A， et al. MyD88-dependent IL-1 receptor signaling is essential for gouty inflammation stimulated by monosodium urate crystals[J]. ?The Journal of Clinical Investigation， 2006，116（8）：2262-2271.

[22]ABHISHEK A， RODDY E， DOHERTY M. Gout-a guide for the general and acute physicians[J]. ?Clinical Medicine， 2017，17（1）：54-59.

[23]LANDIS R C， HASKARD D O. Pathogenesis of crystal-induced inflammation[J]. ?Current Rheumatology Reports， 2001，3（1）：36-41.

[24]MARTIN W J， WAITON M， HARPER J. Resident macrophages initiating and driving inflammation in a monosodium urate monohydrate crystal-induced murine peritoneal model of acute gout[J]. ?Arthritis Rheumatol， 2009，60（1）：281-289.

（本文編輯 馬偉平）