季 慧 陳 野

(臨沂大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院1，臨沂 276000)(天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院；教育部食品營養(yǎng)與安全實(shí)驗(yàn)室2，天津 300457)

脫脂花生粉是花生提取花生油后的副產(chǎn)品,含有高質(zhì)量的蛋白質(zhì)(47～55%)和低劑量的抗?fàn)I養(yǎng)因子。然而，脫脂花生粉由于其溶解度及其它功能性質(zhì)較差，主要用作動(dòng)物飼料，而未得到廣泛應(yīng)用?；ㄉ蛛x蛋白(PPI)蛋白質(zhì)含量較高(> 85%), 其功能性質(zhì)中乳化性能、發(fā)泡和凝膠特性等，與如大豆蛋白等相比，仍然具有較大差距[1]。溶解度是蛋白質(zhì)最重要的特性之一，它會(huì)影響蛋白質(zhì)的其他功能特性。改善花生分離蛋白的溶解性能對(duì)提高其在食品工業(yè)中的應(yīng)用至關(guān)重要。

為了提高花生蛋白的溶解特性，國內(nèi)外專家對(duì)花生蛋白的功能特性進(jìn)行了一系列的物理和化學(xué)改性研究，其中包括酶解、高壓、超聲波處理、微射流、微波和糖基化處理[2-5]。這些方法確實(shí)可以在不同程度地提高了花生蛋白的溶解性能，但容易引起反應(yīng)產(chǎn)物復(fù)雜、熱變性和食品安全性問題未被廣泛應(yīng)用。

常壓低溫等離子體(ACP)是一種全新的、無危害、無熱、高技術(shù)、前景廣闊的高新技術(shù)，目前在食品工業(yè)中備受關(guān)注。ACP被稱為非熱能電子，因?yàn)殡娔墚a(chǎn)生的高能電子直接作用于等離子體的電子元件，使得等離子體的處理組分保持在室溫[6]。低溫等離子改性蛋白的研究是近年來蛋白質(zhì)改性研究的熱點(diǎn)之一。ACP處理使乳清蛋白、小麥粉、玉米醇溶蛋白等的功能特性(蛋白乳化活性、溶解度、泡沫穩(wěn)定性)發(fā)生變化[7-9]。然而，通過ACP技術(shù)對(duì)花生蛋白粉進(jìn)行改性，特別是水合性質(zhì)的研究報(bào)道卻很少。Sinha[10]報(bào)道了等離子體修飾可以在高能離子轟擊下蝕刻高分子材料表面，并誘導(dǎo)一些極性自由基。因此，推測(cè)低溫等離子可以形成或暴露更多親水性的蛋白質(zhì)基團(tuán)，增加與水結(jié)合的位點(diǎn)，提高蛋白水合性質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)在研究低溫等離子對(duì)花生分離蛋白粉末的水合性質(zhì)的影響，以期探索提高蛋白溶解度的機(jī)理，為利用花生分離蛋白制備可控藥物緩釋載體蛋白水凝膠，新型高保水工業(yè)材料提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

低溫花生粕；血清白蛋白；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DBD-50低溫等離子體；PQ001核磁共振分析儀；F-4500熒光分光光度計(jì)；NicoletiS50傅立葉變換紅外光譜儀。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 花生分離蛋白的制備

參照J(rèn)i 等[11]的方法，提取花生分離蛋白，PPI的蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 83.0% (凱氏常數(shù)：5.46)。

1.3.2 低溫等離子處理樣品

將花生分離蛋白粉末過 80 目篩以保證顆粒大小的均勻性。稱取1.0 g左右的花生分離蛋白粉均勻平鋪于石英反應(yīng)槽內(nèi)，固定放電電壓到為 70 V，電流保持在(1.0±0.2)A，分別處理1、3、5、7、10 min，處理溫度為 25 ℃，得到不同處理時(shí)長的花生分離蛋白粉末樣品。

1.3.3 溶解度測(cè)定

根據(jù)Kong等[12]的方法，取1.00 g低溫等離子處理后的花生分離蛋白粉溶于100 mL 0.1 mol/LPBS (pH=7)溶液中充分溶解后，在3 000 r /min下離心15 min。取1 mL上清液加入4 ml雙縮脲試劑，旋渦充分混合。反應(yīng)30 min后，在540 nm下測(cè)定溶液的吸光度，不添加花生分離蛋白的樣品為空白。

1.3.4 凝膠的制備

將低溫等離子處理后的花生分離蛋白用含有 0.06 mol/L CaCl2，0.1 mol/L 的 PBS 緩沖液(pH=7.0)充分溶解，將其濃度調(diào)至 150 mg/mL 后，分別稱取50 g的蛋白液于100 mL燒杯中，用保鮮膜密封，放入90 ℃水浴鍋中保溫60 min后，立即取出冷水浴后，于4 ℃冰箱中放置 24 h后，進(jìn)行后續(xù)指標(biāo)測(cè)定。

1.3.5 凝膠持水性測(cè)定

稱取蛋白凝膠樣5 g左右，于15 mL干燥并已稱重的離心管(記離心管的重量為W0)中，凝膠樣品和離心管的總重量為W1。8 000 r/min 離心 15 min，將析出的水倒掉，并使用濾紙吸取殘留的水分后，稱重并記錄此時(shí)凝膠樣品和離心管的總質(zhì)量(W2)。凝膠持水能力(WHC)采用以下公式計(jì)算：

1.3.6 核磁共振分析

采用低場(chǎng)NMR 弛豫測(cè)定凝膠樣品的橫向弛豫時(shí)間 T2，測(cè)定條件：質(zhì)子共振頻率為 22.6 MHz，測(cè)量溫度為 32 ℃。取2花生蛋白凝膠直接放入直徑25 mm核磁管中，隨后立即放入PQ-001 核磁共振儀中進(jìn)行分析。采 用 Carr-Purcell- Meiboom-Gill(CPMG)脈沖序列進(jìn)行自旋-自旋弛豫時(shí)間 T2、T2峰面積比的測(cè)定。參數(shù)設(shè)定：Tw=2 000 ms; NS=8; NECH=10 000。

1.3.7 表面疏水性(H0)的測(cè)定

采用 ANS(1-苯胺基-8-萘磺酸)熒光探針法[13]，用 0.01 mol/L 的磷酸鹽緩沖液(pH7.0)配制不同濃度的樣品蛋白溶液(0.005%～0.2%)和 8 mmol/L的ANS溶液。取20 μL ANS 溶液加到4 mL蛋白溶液中，混合均勻，迅速測(cè)定混合液的熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為 390 nm 和 470 nm，以熒光強(qiáng)度對(duì)蛋白質(zhì)濃度作圖，直線斜率即為蛋白質(zhì)樣品的表面疏水性指數(shù)(H0)。

1.3.8 傅里葉紅外光譜分析

準(zhǔn)確稱量 0.001 g 花生蛋白樣品，加入一定量的KBr至0.15 g，用研缽研磨成均勻粉末，壓制成薄片，用傅里葉紅外光譜儀做全波段掃描 (4 000 cm-1～400 cm-1) ，掃描次數(shù)為32[14]。

1.3.9 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳

采用還原型聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)方法鑒定低溫等離子處理前后花生分離蛋白中亞基的變化情況[15]。分離膠和濃縮膠的濃度分別為 12%和 4%，樣品中加入 1 mmol/L β-巰基乙醇。電泳后，蛋白膠用考馬斯亮藍(lán) R250 染色。

2 結(jié)果與討論

2.1 水合特性

2.1.1 花生分離蛋白(PPI)溶解度的變化

圖1 低溫等離子處理對(duì)花生分離蛋白溶解度的影響

為了分析PPI的溶解度的變化，將未處理(對(duì)照)和ACP處理的PPI的溶解度和pH值繪制在圖1中。由圖1可以看出，隨著ACP處理時(shí)間的增加，蛋白的溶解度逐步提高，在處理7 min時(shí)，花生分離蛋白的溶解度與未處理時(shí)樣品相比增加9.74%，處理7 min后略有下降，0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.0) pH總體不變略有下降。ACP產(chǎn)生的高能粒子的蝕刻作用可以使蛋白比表面積增加，更多的活性位點(diǎn)被暴露，蛋白親水性增強(qiáng)，PPI的溶解度增加。7 min處理后PPI溶解度下降可能是隨著處理時(shí)間的持續(xù)延長，蛋白部分變性而聚集，蛋白溶解度降低。

2.1.2 PPI凝膠化性能

2.1.2.1 PPI凝膠持水能力(WHC)

WHC是評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)凝膠中持水能力的重要參數(shù)。WHC可以反映凝膠內(nèi)部結(jié)構(gòu)的粗糙度[16]。低溫等離子處理后的PPI凝膠體系的WHC如圖2所示。低溫等離子處理后，蛋白凝膠持水性隨著處理時(shí)間的延長而增加，處理3 min時(shí)，PPI凝膠的WHC達(dá)最高，從20.09%(0 min)增加到22.90%(3 min)，比未處理的樣品高出13.99%; 3 min后隨ACP處理時(shí)間的延長WHC下降。

圖2 低溫等離子處理對(duì)花生蛋白凝膠持水性的影響

2.1.2.2 核磁共振分析

注：從上到下代表處理時(shí)間分別為3、1、5、7、10.0 min圖3 低溫等離子處理對(duì)花生蛋白凝膠弛豫時(shí)間分布影響

從圖3、表1可以看出，花生蛋白凝膠的T2在0.1～2 000 ms的弛豫時(shí)間分布上均出現(xiàn)了3 種峰，分別用T2b、T21和T22表示，其水分分布與豆腐相似[17]。T22表示花生蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)以外可以自由移動(dòng)的水，受蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)的影響最小，稱為自由水[18]。 T21(中間水分)代表分布在蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)表面的水分子，受蛋白凝膠的氫鍵、疏水相互作用和靜電相互作用的影響，T21峰面積比例與WHC呈正相關(guān)。 T2b表示與蛋白質(zhì)等大分子表面的極性基團(tuán)以氫鍵相結(jié)合的單層水，以及位于大分子固有結(jié)構(gòu)的質(zhì)子，與WHC相關(guān)性最小[19]。

表1 低溫等離子處理時(shí)間對(duì)不同峰面積比例的影響

注：同一列數(shù)據(jù)標(biāo)注不同字母表示數(shù)據(jù)間有顯著性差異(P<0.05)。

隨著ACP處理時(shí)間的延長，T21的峰面積所占比例逐漸增大，在ACP處理3 min時(shí)，T21的峰面積比例達(dá)最大，從80.4%(0 min)上升到84.9%(3 min), 峰面積比例增加了5.6%。(圖3、表1)。結(jié)果顯示ACP處理可以明顯增加蛋白質(zhì)凝膠網(wǎng)絡(luò)表面的水基團(tuán)數(shù)量。3 min后，T21的峰面積略有下降，其趨勢(shì)與WHC 變化趨勢(shì)一致。

2.2 花生分離蛋白表面疏水性的影響(H0)

疏水力被認(rèn)為是維持蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)的主要作用力，在三級(jí)結(jié)構(gòu)的形成和穩(wěn)定中起著重要作用[20]。低溫等離子處理可能引起花生分離蛋白表面疏水區(qū)域分布的變化。以ANS為熒光探針，對(duì)花生蛋白表面疏水性的變化進(jìn)行表征。從圖4中可以看出, 在等離子處理前3 min內(nèi)，花生分離蛋白表面疏水性指數(shù)(H0)顯著降低(P<0.05)，H0從 9 978 ±328.4(0 min)下降到4 397±288.4(3 min)，3 min后H0值明顯增加，但在處理7 min內(nèi)，H0均低于未處理樣品。

圖4 低溫等離子處理對(duì)花生分離蛋白表面疏水性指數(shù)影響

等離子處理3 min內(nèi)，H0逐漸下降，說明花生分離蛋白的親水性增強(qiáng)，疏水性相互作用減弱，大量的水被結(jié)合到蛋白表面，該結(jié)果與花生分離蛋白的凝膠持水性(WHC)變化趨勢(shì)一致。處理3 min后表面疏水性的增加可能是由于高能粒子轟擊后，蛋白分子結(jié)構(gòu)展開，表面分子間疏水性增加。

2.3 花生分離蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)

選取紅外光譜中的酰胺Ⅰ帶(1 600～1 700 cm-1)進(jìn)行詳細(xì)研究，用Omnic軟件用對(duì)蛋白質(zhì)各二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行定量分析。對(duì)應(yīng)于二級(jí)結(jié)構(gòu)的譜帶如下：1 650～1 670 cm-1對(duì)應(yīng)于α-螺旋，1 610～1 640 cm-1對(duì)應(yīng)于β-折疊，1 660～1 700 cm-1對(duì)應(yīng)于β-轉(zhuǎn)角，1 640～1 650 cm-1對(duì)應(yīng)于無規(guī)則卷曲。每個(gè)二級(jí)結(jié)構(gòu)組分的百分比通過相應(yīng)峰的面積來計(jì)算[21]。蛋白質(zhì)各二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行定量分析結(jié)果如表2。

表2 低溫等離子處理時(shí)間對(duì)花生蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

從表2可以看出, 在等離子處理的前3 min內(nèi)，α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角所占比例呈上升趨勢(shì)，β-折疊呈明顯的下降趨勢(shì),從32.34% (0 min)下降至24.00% (3 min)。二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化與Dong等[9]和Ji等[11]報(bào)道一致。結(jié)果表明,β-折疊變成α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角, 蛋白分子間氫鍵增強(qiáng)，可能是由于低溫等離子處理產(chǎn)生的高能粒子(氧化劑)使花生分離蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)變緊密。Safonov等[22]的研究表明，花生分離蛋白較穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成可能與臭氧有關(guān)。處理3 min后, β-折疊和無規(guī)卷曲比例的增加,α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角的下降，預(yù)示著花生分離蛋白的結(jié)構(gòu)由緊密變松散。

圖5 等離子處理后花生分離蛋白的SDS-PAGE圖

2.4 SDS-PAGE結(jié)果

由圖5可知，花生蛋白亞基的電泳圖譜包含5個(gè)主要類別：伴花生球蛋白(>50 ku)、酸性花生球蛋白(38～49.9 ku)、中分子量蛋白質(zhì)(23～37.9ku)、堿性花生球蛋白(18～22.9 ku)、低分子量的花生球蛋白(14～17.9 ku)。與未處理的花生分離蛋白相比，等離子處理并沒有引起蛋白質(zhì)電泳圖譜的重大變化，表明低溫等離子處理花生分離蛋白粉末并沒有改變花生蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)。

3 結(jié)論

低溫等離子處理能顯著改善花生分離蛋白粉的水合性能。處理7 min時(shí)，花生分離蛋白溶解度最大，與未處理相比提高了9.74%; ，處理3 min時(shí)，花生分離蛋白的凝膠持水性達(dá)最高，比未處理的樣品高出13.99%。同時(shí)，花生分離蛋白表面疏水性降低，親水性增強(qiáng)。