周劍敏 尹方平 于 晨 湯曉智

(南京財經(jīng)大學食品科學與工程學院；江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心；江蘇高校糧油質量安全控制及深加工重點實驗室，南京 210023)

血管緊張素轉化酶抑制肽(ACEIP)與血管緊張素Ⅰ(AngI)的結構相似，都是ACE的競爭性底物，在體內與ACE結合阻止了血管緊張素ⅠAngII 的生成，從而緩解和抑制血壓的升高，所以ACEIP又被稱為降血壓肽[1]。1965年Ferreira等首次從蛇的毒液里分離出天然血管緊張素轉化酶(ACE)抑制肽，從此科學界開始了對天然來源ACE抑制肽的研究[2]。1979年，Oshima等首次由利用細菌膠原酶水解明膠獲得食源性ACE抑制肽，并且有較強抑制活性[3]。由于食源性ACE抑制肽與合成的ACE抑制肽相比，具備食用安全性高、低毒副作用、降壓效果溫和專一以及對血壓正常者無任何不良影響等優(yōu)勢，而受到研究者的廣泛關注，成為控制和治療高血壓研究的熱點。目前，國內外對ACE抑制肽研究成果豐富，多種動植物蛋白如魚皮明膠[4]、豬血紅蛋白[5]、毛蝦[6]、燕麥[7]、蕎麥[8]、芝麻[9]、花生[10]等中均分離純化得到ACE抑制肽。

中國是高粱主產國之一，有豐富的高粱種質資源，因此有可靠的高粱蛋白來源。但目前國內外關于高粱蛋白以及高粱蛋白肽的研究報道相對較少。Kamath 等用胰凝乳蛋白酶水解高粱醇溶蛋白后，從水解液中分離得到四種具有ACE抑制活性的組分[11]；Filho 等從高粱蛋白中分離純化出一種分子量為2 000Da的抗病毒肽[12]。本研究以高粱為原料，通過堿法提取高粱堿溶蛋白，研究不同蛋白酶以及酶解工藝對于ACE抑制肽的制備及ACE抑制率的影響，同時對ACE抑制肽在不同環(huán)境中的穩(wěn)定性進行研究，明確以高粱蛋白來源的ACE抑制肽的最佳提取工藝及其穩(wěn)定性，為高效合理利用高粱蛋白和開發(fā)ACE藥物提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗材料：高粱：安徽燕之坊食品有限公司；血管緊張素轉化酶(ACE)、N-[3-(2-呋喃基)丙烯酰]-L-苯丙氨酰-甘氨酰-甘氨酸(FAPGG)、胃蛋白酶、胰蛋白酶：Sigma-Aldrich公司；Alcase堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、風味蛋白酶、復合蛋白酶：諾維信公司；L-酪氨酸：索萊寶公司。

主要試劑：鹽酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氫氧化鈉、酪氨酸、碳酸鈉、福林酚試劑、三氯乙酸：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

上海嘉定糧油錘式旋風磨；Molecular酶標儀；D-3紫外檢測儀；pHS-3C精密數(shù)顯pH計；予華恒溫加熱磁力攪拌器；湘儀高速冷凍離心機。

1.3 方法

1.3.1 高粱堿溶蛋白的制備

脫殼高粱米經(jīng)粉碎過60目篩得到微細高粱粉。稱取高粱粉置于石油醚中(1 ∶7)在室溫條件下振蕩8 h后40 ℃低溫烘干。取脫脂后高粱粉于燒杯中，加入濃度為0.15% NaOH溶液使得料液比為(1 ∶14)，于40 ℃下反應1.5 h，5 000 r/min離心20 min，使用試劑盒測定上清液的蛋白含量。上清液冷卻后調節(jié)pH為5.0，靜置1.5 h，離心取沉淀，繼續(xù)將沉淀水洗并離心3次，棄去上清液，冷凍干燥后即得高粱堿溶蛋白質。

1.3.2 蛋白酶活力測定

酶活力單位是指在一定溫度和pH條件下，每分鐘水解酪蛋白產生1 μg酪氨酸的酶量。本實驗采用福林酚法測定蛋白酶活力[13]，通過繪制酪氨酸標準曲線對照測定酶活力。

圖1 酪氨酸標準曲線

1.3.3 酶解工藝流程

配制5 mg/mL的高粱蛋白溶液分散于各蛋白酶(胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、風味蛋白酶、復合蛋白酶和Alcase堿性蛋白酶)的最適pH緩沖液中。置于恒溫加熱磁力攪拌器上，反應溫度為各蛋白酶的最適溫度(各蛋白酶的最適pH和溫度見表1)，加入蛋白酶后低速攪拌反應2 h，沸水浴滅酶15 min。待溶液冷卻后于5 000 r/min，4 ℃條件下離心20 min，上清液即酶解液。

1.3.4 水解度的測定

取完全水解液0.1～1.0 mL于25 mL 比色管中，蒸餾水稀釋至4.0 mL，加pH 8 緩沖溶液1.0 mL，茚三酮溶液1.0 mL，混勻，沸水浴加熱15 min，冷卻，蒸餾水稀釋至25 mL。570 nm測吸光度(以水作參比)。另取100 mg蛋白加水100 mL，過濾，取相應體積的濾液，按上述方法測光密度值。相同體積樣品的光密度之差與蛋白質量做工作曲線，取線性部分做標準曲線。

取1.0 mL酶解液稀釋至100 mL，取稀釋后水解液4.0 mL，測吸光度。另取相同濃度未水解蛋白溶液3.0 mL，按上述方法測吸光度，以二者光密度之差從標準曲線上查蛋白質含量。按公式計算水解度[14]：

(1)

式中：A為由標準曲線得蛋白質量/mg，W為高粱蛋白粉質量/g，V1為水解液總體積/mL，V2為顯色時所用稀釋液體積/mL。

1.3.5 ACE抑制肽體外活性測定(FAPGG法)

參考Shalaby等[15]的方法，使用FAPGG為反應底物，通過酶標儀測定并計算ACE抑制率。將1.0 mmol/L FAPGG 溶解于pH為7.5、包含0.3 mol/L NaCl的50 mmol/L的Tris-HCl中配制底物溶液，置于37 ℃水浴鍋中保溫。取10 μL酶解液加入96孔酶標板中，然后加入 150 μL的底物溶液后，迅速放入酶標儀中，于340 nm下的測定吸光值，每30 s記錄一次，共30 min?？瞻捉M以10 μL的緩沖液代替酶解液，對照組以10 μL的0.25 U/mL的ACE溶液代替酶解液。以吸光值變化(ΔA) 對時間作出曲線，計算斜率。計算公式為：

(2)

1.3.6 不同蛋白酶水解高粱蛋白酶解液ACE抑制活性的比較

選取胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、風味蛋白酶、復合蛋白酶和Alcase堿性蛋白酶對高粱蛋白進行酶解反應。通過水解度、ACE抑制活性的測定，比較不同蛋白酶的水解效果，選擇制備高粱蛋白ACE抑制肽的最佳用酶。

1.3.7 高粱蛋白酶解工藝條件優(yōu)化

1.3.7.1 單因素實驗

固定其他反應條件，分別改變酶量(800～4 800 U/g蛋白質)、反應溫度(25～75 ℃)、pH(6.0～9.0)和酶解時間(0.5～5 h)，以酶解產物的ACE抑制率為指標，分析各因素對酶解產物ACE抑制活性的影響，確定各單因素的最佳條件。

1.3.7.2 響應面法優(yōu)化高粱蛋白酶解工藝條件

基于單因素實驗結果，采用Design-Expert8.0軟件與根據(jù)Box-Behnken中心組合設計原理，進行四因素三水平響應面實驗(RSM)，優(yōu)化工藝參數(shù)，確定制備ACE抑制肽的最佳工藝。

1.3.8 高粱蛋白ACE抑制肽的穩(wěn)定性測定

依據(jù)最佳條件制備高粱蛋白ACE抑制肽粗肽粉，配制5 mg/mL的高粱ACE抑制肽溶液，置于不同的環(huán)境中，以蛋白質水解液的ACE抑制率為考察指標，分別考察溫度、pH和體外模擬胃腸道酶系對ACE抑制穩(wěn)定性的影響。具體條件：將高粱蛋白溶液分別置于 20、40、 60、80、100 ℃水浴中保溫2 h，冰水浴冷卻，測定 ACE 抑制率；將高粱蛋白溶液的pH分別調至2.0、4.0、6.0、8.0和10.0，在4 ℃條件下冷藏保存 24 h 后，調節(jié) pH 為 7.0，測定 ACE 抑制率；將高粱 ACE 抑制肽溶解于0.1 mol/L的HCl緩沖液(pH 2.0)中，配制成5%(m/V)溶液并加入適量的胃蛋白酶。在37 ℃水浴條件下水解3 h后，沸水浴滅酶10 min，冷卻后用2 mol/L NaOH調pH值至7.0，5 000 r/min離心15 min，測定上清液的ACE 抑制率，取離心前pH值為7.0的溶液，加入適量胰蛋白酶，37 ℃水浴條件下繼續(xù)水解3 h后，沸水浴滅酶 10 min，冷卻后，5 000 r/min離心15 min，測定上清液的ACE抑制率。

1.3.9 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析

采用Origin8.0和SPSS18.0數(shù)據(jù)處理軟件對數(shù)據(jù)進行分析，并用Tukey法進行顯著性分析(P<0.05)，結果以XSD表示。

2 結果與分析

2.1 酶活力的測定結果

根據(jù)標準曲線結果，計算得到各蛋白酶活力如表1。

表1 酶活力的測定結果

2.2 不同蛋白酶水解高粱蛋白產物的水解度以及ACE抑制活性

由表2可知選擇不同的蛋白酶酶解高粱蛋白的水解物都有一定的ACE抑制活性，說明以高粱蛋白為原料可以有效制備ACE抑制肽。

相對于其他蛋白酶，堿性蛋白酶水解高粱蛋白的產物具有最高水解度和最高ACE抑制率，分別為12.22%和72.13%。堿性蛋白酶具有高溶解性和高耐熱性，其作用位點為羧基側具有芳香族或疏水性氨基酸[16]，這使得堿性蛋白酶能夠針對性的作用于高粱蛋白，從而提升了水解度和ACE抑制率[17]。所以本研究選擇堿性蛋白酶作水解高粱蛋白制備ACE活性肽，并以ACE抑制率作為評價指標設計單因素和響應面實驗優(yōu)化酶解工藝條件。

表2 不同蛋白酶水解高粱蛋白的水解度及ACE抑制活性

2.3 堿性蛋白酶酶解單因素實驗

由圖2可知，當堿性蛋白酶添加量在800～2 400 U/g范圍內，隨酶量的增加，水解產物的ACE抑制率顯著上升。當酶量大于2 400 U/g時，繼續(xù)增大酶量，水解產物的ACE抑制率之間無顯著差異。高粱蛋白在堿性蛋白酶的作用下水解成為具有功能活性的短肽，當?shù)孜餄舛炔蛔?，酶量處?00～2 400 U/g時，底物未能充分與堿性蛋白酶結合，生成的形成活性的水解產物少，ACE抑制率低；酶量增加時，更多的高粱蛋白被堿性蛋白催化水解，形成更多具有ACE抑制活性的短肽，使水解產物的ACE抑制率增加；當酶量大于2 400 U/g時，底物與堿性蛋白酶的結合達到飽和狀態(tài)，此時繼續(xù)加大酶量，水解產物的ACE抑制率變化不大。

圖2 酶量、pH、溫度和酶解時間對ACE抑制率的影響

堿性蛋白酶活性反應體系對pH值的變化較敏感。如圖2所示，pH值低于8.0時，水解產物的ACE抑制率隨體系pH值的上升而顯著增加，在pH值為8.0時有最大抑制率，為73.47%。當pH高于8.0時，水解產物的ACE抑制率開始降低?？赡芤驗閜H8.0是堿性蛋白酶進行酶促反應時的最適pH值，此時酶活性最強，水解效率最高，水解產物中含有更多的活性短肽，ACE抑制率高，但當pH低于或高于8.0時，堿性蛋白酶的活性下降，高粱蛋白被堿性蛋白催化水解效率下降，具有ACE抑制活性的短肽減少，ACE抑制率降低。

溫度是影響酶促作用的關鍵因素。如圖2所示，隨著反應溫度的升高，水解產物的ACE抑制率增加顯著，當反應溫度為55 ℃時，水解產物的ACE抑制率最大，為70.11%。隨著溫度的升高，堿性蛋白酶的活性增大，同時由于熱運動與底物的接觸幾率增大，水解效率增加，ACE抑制活性也隨之增加，但當溫度超過最適溫度55 ℃后繼續(xù)升高，過高的反應溫度導致堿性蛋白酶變性失活，底物不能被有效水解，進而降低了水解產物的ACE抑制率[18]。

由圖2可知，當反應時間在0.5～2 h范圍內，水解產物的ACE抑制率隨著酶解時間的增加而顯著增加，當反應時間超過2 h之后，水解產物的ACE抑制率變化不顯著。因為酶解初始階段，底物濃度較高，堿性蛋白酶未能與底物充分結合，水解產物的ACE抑制率低，隨著反應時間的延長，更多的底物被堿性蛋白酶水解為具有ACE抑制活性的短肽，水解產物的ACE抑制率增加；當?shù)孜镏饾u被轉化完全后，反應飽和，水解產物的中ACE抑制肽含量不再增加，水解產物的ACE抑制率保持穩(wěn)定。

2.4 酶解高粱蛋白制備ACE抑制肽的響應面優(yōu)化

根據(jù)單因素實驗結果，設計響應面實驗因素水平表如表3所示。并以ACE抑制率作為響應值，進行響應面實驗優(yōu)化酶解工藝條件。

表3 響應面實驗因素水平表

Box-Behnken實驗設計結果如表4所示，并利用Design-Expert對響應面實驗結果進行方差分析，結果見表5。各個因素經(jīng)過二次多項回歸擬合后，得到ACE抑制率(Y)與酶解溫度、酶解時間、酶解pH、酶活力4個因素的二次多項回歸方程為：

Y=69.68-0.917X1-4.633X2+0.960X3+3.139X4+0.230X1X2-0.754X1X3+0.246X1X4+0.197X2X3+4.015X2X4-1.5X3X4-2.093X12-3.684X22+2.193X32+0.529X42

表4 響應面實驗設計方案與結果

從表5的方差分析結果可知，模型極顯著，失擬項不顯著，說明回歸模型理想，可以用來擬合反應溫度(X1)、反應時間(X2)、pH(X3)和酶活力(X4)這4個因素對水解產物ACE抑制率的影響。R2=0.968 5；R2(Adj)=0.931 8證明回歸方程與實際數(shù)據(jù)之間的擬合性良好。方程的一次項X2、X4對高粱蛋白水解產物的ACE抑制率影響極顯著，X1影響顯著，影響順序依次為X2>X4>X1；二次項X12、X22、X32以及交互項X2X4、X3X4均有顯著的影響。這說明響應值的變化十分復雜，這4個因素對水解產物ACE抑制率的影響并不是簡單的線性相關關系，這4個因素之間存在交互作用。

通過分析計算得到堿性蛋白酶水解高粱蛋白制備ACE抑制肽的最優(yōu)酶解條件為：反應溫度55.5 ℃，酶解時間1.68 h，pH7.95，酶量2 360 U/g，水解產物的ACE抑制率預測值為76.84%。在該條件下重復3次，水解產物的ACE抑制率實測值為75.98%，與理論值誤差在1%以內，說明該模型預測性能較好，對實際操作有一定的指導意義。

表5 方差分析結果

注：*表示顯著(P<0.05)；**表示極顯著(P<0.01)。

2.5 高粱 ACE 抑制肽的溫度穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性和體外消化穩(wěn)定性

ACE抑制肽的穩(wěn)定性是決定其能否長期保存以及有效作用的重要影響因素。通常ACE抑制肽體外穩(wěn)定性的考察從溫度、pH 值和模擬胃腸道穩(wěn)定性等多方面進行考量，以作為判斷 ACE 抑制肽能否投入生產應用的重要標準，如圖3所示。

由圖3A可知，儲存溫度在20～100 ℃之間變化時，ACE抑制肽的ACE抑制率在70.31%～71.37%內小范圍波動，說明ACE抑制肽的抑制活性受溫度影響不顯著(P>0.05)，ACE抑制肽在一定范圍內具有良好的溫度穩(wěn)定性。

由圖3A可知，在pH 2～10范圍內，ACE抑制肽的ACE抑制率在68.08%～71.01%之間波動，當pH為10時，水解產物的ACE抑制率為68.08%，相對于pH 2～8時顯著降低，這可能ACE抑制肽在堿性環(huán)境下發(fā)生了消旋作用，改變了肽鏈結構，降低了多肽的活性?？傮w看來，ACE 抑制肽在酸性和堿性條件下都能夠保持良好的穩(wěn)定性。

由圖3B可知，相對于未消化的ACE抑制肽而言，經(jīng)過胃蛋白酶消化后，ACE抑制肽的抑制率顯著提升，再經(jīng)胰蛋白酶消化后，ACE 抑制率基本無變化。這說明ACE抑制肽能在胃蛋白酶的水解作用下，進一步降解產生更多具有ACE抑制活性的多肽，ACE抑制率上升，所以ACE抑制肽有良好的體外消化穩(wěn)定性。

注：不同的小寫字母代表ACE抑制率對于處理方式的差異顯著性差異(P<0.05)。圖3 ACE抑制肽的溫度穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性和體外消化穩(wěn)定性

3 結論

通過堿法提取制備高粱堿溶蛋白，利用不同蛋白酶對其進行酶解，篩選出Alcalase堿性蛋白酶作為高粱蛋白制備ACE 抑制肽的水解用酶。結果表明，在一定范圍內，水解產物的ACE抑制率隨著酶量和反應時間的增加而增加，且水解產物的ACE抑制率在pH 8.0和溫度55 ℃ 時有最大值。在此基礎上進行響應面優(yōu)化實驗，確定高粱蛋白ACE 抑制肽的最佳制備條件：酶解溫度55.5 ℃，酶解時間1.68 h，pH7.95，酶量2 360 U/g。在最佳條件下進行驗證實驗，實際值接近模型預測值，說明該模型可很好地用于高粱ACE抑制肽的制備。高粱ACE抑制肽具有良好的熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性和體外消化穩(wěn)定性。