劉婷婷 包佳微 李嘉欣 阮長青

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院；黑龍江省農(nóng)產(chǎn)品加工與質(zhì)量安全重點實驗室，大慶 163319)

2016年糧農(nóng)組織將豆類的定義限定于僅從干糧中收獲的作物[1]。豆類不僅富含蛋白質(zhì)、糖類和纖維等必需營養(yǎng)素，也含有酚類化合物和其他次生代謝產(chǎn)物。酚類是具有至少一個芳香環(huán)且環(huán)上至少連接一個或多個羥基的化合物，以游離，組合或結(jié)合的形式存在[2]。酚類有助于植物性食物整體的抗氧化活性，是很好的營養(yǎng)保健的功能成分[3]。大部分種皮帶有顏色的豆類提取物中總酚含量相對較高，它們比大多數(shù)普通的水果、蔬菜和谷類食品具有更高的抗氧化效果[4]。

浸泡處理是發(fā)芽的必要前處理過程，適當(dāng)?shù)慕菘梢允股官|(zhì)地變軟，便于加工并縮短處理時間，另外浸泡還可以減少蛋白酶抑制劑、植酸、胃脹氣因子等抗?fàn)I養(yǎng)成分的含量，同時浸泡過程中也會伴隨一些酚類物質(zhì)的變化[5-7]。豆類在適宜的溫度環(huán)境和水分條件下能夠萌發(fā)出胚芽，新生的胚芽可以增加生物活性化合物和減少抗?fàn)I養(yǎng)成分，并且提高了蛋白質(zhì)、淀粉等營養(yǎng)素的適口性、可消化性和可用性[8-9]。大豆在發(fā)芽過程中異黃酮的變化為近幾年的研究熱點，發(fā)芽可以使大豆中的異黃酮含量顯著增加[10-11]。Wu等[12]發(fā)現(xiàn)發(fā)芽大大增加了鷹嘴豆中的異黃酮含量和多樣性，特別是異黃酮含量增加了100多倍。由此可見發(fā)芽可以使豆類中的異黃酮的質(zhì)和量都發(fā)生變化。但目前缺少有色豆類發(fā)芽的研究，因此研究浸泡和發(fā)芽對有色豆類中酚類物質(zhì)的影響，對于進(jìn)一步選擇適宜的加工方式、保留酚類物質(zhì)具有一定的理論及實際意義。

本實驗選取黑龍江省6種主栽雜豆(黑大豆、黑小豆、紅小豆、綠豆、紫花蕓豆、紅蕓豆)為研究對象，研究浸泡和發(fā)芽過程中豆類總酚、總黃酮、總花青素和總縮合單寧的變化規(guī)律，通過抗氧化能力的測定，探究浸泡和發(fā)芽對豆類抗氧化活性的影響，分析酚類物質(zhì)與抗氧化活性的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑大豆(青仁黑豆)、黑小豆(小黑蕓豆)、紅小豆、綠豆(明綠)、紅蕓豆(英國紅)、紫花蕓豆：產(chǎn)地均為黑龍江省。

沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品、兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品、矢車菊素-3-葡萄苷標(biāo)準(zhǔn)品、福林酚試劑、DPPH、總抗氧化試劑盒；無水乙醇、無水碳酸鈉、亞硝酸鈉、三氯化鋁、氫氧化鈉、水楊酸、30%過氧化氫、硫酸亞鐵均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DYJ-S6365小熊雙層豆芽機；KQ-250E超聲波清洗器；723N可見分光光度計。

1.3 雜豆的浸泡處理

雜豆的浸泡時間通過浸泡含水率曲線確定。根據(jù)Xu[13]的方法稍作修改，稱取20 g雜豆用清水沖洗，去除雜質(zhì)灰塵，以豆水比為1 ∶3的比例用蒸餾水浸泡雜豆，在浸泡初始0～6 h的時間內(nèi)每小時測量一次雜豆的含水率，然后從6～12 h每2 h測量一次，之后從12～30 h每6 h測量一次。每次撈出的雜豆用紙巾吸干表面多余的水分，稱重并放回到浸泡水中，并按照如下公式計算浸泡后的含水率。

式中：X為含水率；m1為干豆的質(zhì)量/g；m2為浸泡后雜豆的質(zhì)量/g；MC為干豆的含水量/%。

以雜豆含水率為縱坐標(biāo)(y值)，時間為橫坐標(biāo)(x值)，繪制曲線。將飽和含水率曲線開始進(jìn)入平緩的時間確定為雜豆最終的浸泡時間。

1.4 雜豆的發(fā)芽處理

將浸泡后的雜豆撈出后置于豆芽機內(nèi)進(jìn)行避光發(fā)芽，豆芽機每1 h灑水一次，每隔12 h換水一次。每天進(jìn)行取樣，共發(fā)芽5 d。

1.5 提取物的制備

將上述浸泡、發(fā)芽后的雜豆置于40 ℃烘箱內(nèi)烘干。將得到的干燥樣品磨碎后過60目篩。粉碎后的豆粉用自封袋密封，豆粉置于4 ℃干燥條件下進(jìn)行保存。

精確稱取1 g雜豆粉，置于100 mL錐形瓶中，加入50 mL 80%乙醇溶液，封住瓶口。于超聲清洗儀中超聲30 min(溫度25 ℃、功率250 W)，提取液于3 000 r/min離心10 min，收集上清液。將沉淀按上述過程二次提取后合并上清液，于-20 ℃中保存待測。每個樣品平行3次提取。

1.6 指標(biāo)測定

1.6.1 總酚含量的測定

采用Folin-Ciocalteu法測定總酚含量，根據(jù)Singleton[14]和Xu[15]的方法稍作修改，取400 μL提取溶液，加3 mL去離子水、250 μL福林酚溶液，靜置5 min后加入750 μL 7%碳酸鈉和950 μL去離子水，旋渦混勻，避光反應(yīng)1 h,于765 nm處測定吸光度值。以沒食子酸(GAE)為標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果以沒食子酸當(dāng)量表示(mg/g干豆粉)。

1.6.2 總黃酮含量的測定

參照Zhishen[16]和Michalska[17]的方法測定總黃酮含量。取2 mL提取溶液，加入1.25 mL去離子水和75 μL 5%亞硝酸鈉，靜置5 min后加150 μL 10%三氯化鋁，靜置反應(yīng)6 min，加入500 μL 1mol/L氫氧化鈉和3 mL去離子水漩渦混勻，于495 nm處測定吸光度。以兒茶素(CAE)為標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果以兒茶素當(dāng)量表示(mg/g干豆粉)。

1.6.3 總花青素的含量

根據(jù)Lee[18]和Shao[19]的方法進(jìn)行改進(jìn)，取500 μL矢車菊素-3-葡萄苷標(biāo)準(zhǔn)液或者提取液，分別加入2 mL 0.025 mol/L 氯化鉀鹽酸緩沖溶液(pH 1.0)和2 mL 0.4 mol/L醋酸鈉溶液(pH4.5)。充分混合后靜置20 min，分別在510 nm和700 nm波長處測定吸光度值。結(jié)果以矢車菊素-3-葡萄苷當(dāng)量表示(mg/g樣品)，并且花青素含量計算公式如下：

式中：C為花青素含量；A為(A510 nm-A700 nm) pH1.0-(A510 nm-A700 nm) pH4.5;MW為花青素分子量(449.2)；DF為稀釋因子；ε為摩爾光吸收值(26 900)。

1.6.4 總縮合單寧的含量

縮合單寧含量根據(jù)Broadhurst[20]的方法進(jìn)行測定，將500 μL提取液與2 mL 4%香草醛甲醇溶液和1 mL濃鹽酸充分混合，混合物靜置15 min后在500 nm處測定其吸光度值。以兒茶素(CAE)為標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果以兒茶素當(dāng)量表示(mg/g干豆粉)。

1.6.5 總抗氧化能力(T-AOC)測定

使用南京建成生物工程研究所的總抗氧化能力試劑盒測定提取液的總抗氧化能力(T-AOC)，計算公式如下：

式中：T-AOC為總抗氧化能力/U/mg；OD為測定組吸光度值；OD′為對照組吸光度值；TRF為反應(yīng)液總量；SV為取樣量；DR為樣本測定前稀釋倍數(shù)；EC為提取液濃度。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

每個樣品均平行提取3次進(jìn)行測定，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，浸泡和發(fā)芽前后的雜豆樣品之間的差異采用單因素方差分析進(jìn)行顯著性分析，P<0.05為差異性顯著，采用Person相關(guān)分析對樣品的總酚含量、總黃酮、花青素、縮合單寧和總抗氧化能力進(jìn)行相關(guān)性分析。使用Origin 2017軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 雜豆浸泡時間的確定

由于干豆質(zhì)地堅硬，浸泡處理可以軟化雜豆，使其易于進(jìn)一步加工處理，且雜豆萌發(fā)前需進(jìn)行浸泡，然而浸泡時間過長會使部分酚類物質(zhì)流失，因此雜豆浸泡時間的確定尤為重要。參照Xu[21]的方法，雜豆在浸泡過程中的含水率達(dá)到飽和即可(含水率曲線開始進(jìn)入平緩)。由圖1可確定黑大豆、黑小豆、紅小豆、綠豆、紅蕓豆、紫花蕓豆的浸泡時間分別為18、10、24、18、12、12 h，6種雜豆在此浸泡條件下進(jìn)行發(fā)芽處理。

圖1 浸泡過程中的雜豆的飽和吸水率曲線

2.2 浸泡和發(fā)芽對雜豆總酚的影響

由表1可知，浸泡和發(fā)芽對6種雜豆中總酚含量均有顯著影響。浸泡過程中一些水溶性酚類物質(zhì)會溶出，造成浸泡過后的黑大豆、黑小豆、紅小豆、紅蕓豆、紫花蕓豆的總酚含量比干豆減少了15.13%～40.37%，而綠豆的總酚含量增加了23.17%，原因可能是綠豆的主要結(jié)合酚酸為咖啡酸，浸泡過程會破壞咖啡酸與其他物質(zhì)如蛋白質(zhì)、多糖的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，從而促使咖啡酸游離出來[22]。但咖啡酸微溶于水，卻易溶于熱水及乙醇，因此浸泡后的綠豆在超聲-乙醇提取條件下會有大量的咖啡酸溶出造成總酚含量的升高[23]。

浸泡之后的萌發(fā)處理顯著提高了雜豆總酚含量，在發(fā)芽過程中，雜豆總酚含量出現(xiàn)了升高后降低和降低后升高的不同現(xiàn)象，分析原因可能是隨著發(fā)芽時間的增加，新的植物細(xì)胞在新細(xì)胞壁形成的情況下增殖，合成的可溶性酚類物質(zhì)在細(xì)胞壁中形成新的結(jié)合酚類物質(zhì)。因此，結(jié)合的酚類物質(zhì)參與動態(tài)過程，并且它們的釋放和結(jié)合速率在不同的發(fā)芽種子和芽中可以是不同的[2]。綠豆在發(fā)芽過程中總酚的增加量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他五種雜豆，并且發(fā)芽五天后的綠豆的總酚含量是浸泡后綠豆的3.74倍，Huang等[24]在研究中也發(fā)現(xiàn)與發(fā)芽大豆相比，發(fā)芽過程中綠豆的總酚含量相對較高，表明發(fā)芽的綠豆相比于其他發(fā)芽豆類更容易獲得豐富的物質(zhì)。

2.3 浸泡和發(fā)芽對雜豆總黃酮的影響

在自然界中，黃酮類化合物以單糖或多糖部分通過OH基(O-糖苷)或通過碳-碳鍵(C-糖苷)連接的糖苷形式存在。由表2可知，浸泡和發(fā)芽加工方式對6種雜豆中總黃酮含量均影響顯著。浸泡處理后，黑大豆、紅小豆、綠豆、紅蕓豆、紫花蕓豆的總黃酮降低了6.52%～36.84%，而黑小豆中的總黃酮含量增加了24.47%，這與孫丹等[25]的研究結(jié)果相同，浸泡可以顯著提高總黃酮含量，原因可能是黑小豆中屬于黃酮類化合物的異黃酮含量高于其他豆類，并且異黃酮多以結(jié)合型糖苷化合物的形式存在，豆類內(nèi)部的物質(zhì)轉(zhuǎn)化和呼吸作用在浸泡過程中開始逐漸加強，細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)源酶被激活，復(fù)雜物質(zhì)能夠被酶水解成簡單物質(zhì)。例如如淀粉降解為可溶性糖，大量的結(jié)合型糖苷異黃酮被釋放出來，從而使總黃酮含量顯著升高[26-28]。

表1 浸泡和發(fā)芽對雜豆總酚的影響/mg/g

注：數(shù)據(jù)以干重表示。同行數(shù)據(jù)相同的小寫字母表示沒有顯著性差異(P>0.05)。余同。

表2 浸泡和發(fā)芽對雜豆總黃酮的影響/mg/g

6種雜豆在發(fā)芽過程中總黃酮變化幅度不大，因為糖苷配基化合物的濃度不受發(fā)芽的影響,并且在發(fā)芽的早期階段，碳水化合物和蛋白質(zhì)被降解，伴隨著單糖和游離氨基酸的增加，因此，與細(xì)胞壁成分結(jié)合的結(jié)合酚類也被釋放，而此過程釋放的結(jié)合酚類可能是雜豆中最多的結(jié)合酚類化合物-酚酸而不是黃酮類化合物[1]。

2.4 浸泡和發(fā)芽對雜豆總花青素的影響

花青素是水溶性類黃酮色素，浸泡可以使大量的花青素溶出，由表3可知，浸泡處理后的黑大豆、黑小豆、綠豆和紫花蕓豆的總花青素降低了18.14%～100% ，而浸泡后的紅蕓豆中的總花青素升高了196.56%，原因可能是花青素在多酚氧化酶存在下易被酶促降解，而這種酶可以通過浸泡抑制其活性[29]。此外，紅蕓豆中的一些花青素可能與其他帶色物質(zhì)發(fā)生了分子內(nèi)共色作用使其不易受到水的攻擊，但紅蕓豆在水分子的作用下由靜止?fàn)顟B(tài)轉(zhuǎn)向活躍狀態(tài)，不利于共色作用的穩(wěn)定，大量的花青素在超聲提取過程中流出，使測定結(jié)果升高[30]。

發(fā)芽過程中淋洗會造成花青素大量流失，但六種雜豆的總花青素含量出現(xiàn)了升高或降低的不同現(xiàn)象，Lopez等[31]在豆芽中檢測到兩種新合成甲氧基化的花青素，即牽牛花素和錦葵色素，二者的形成可能與甲氧基化化合物如阿魏酸及其衍生物的減少有關(guān)，這種升高現(xiàn)象歸結(jié)于酶的作用?；ㄇ嗨氐倪@些不同變化可以通過酚類代謝過程中酶的激活來解釋，并且這取決于豆科植物類型和發(fā)芽條件[32]。

2.5 浸泡和發(fā)芽對雜豆總縮合單寧的影響

由表4可知，浸泡使6種雜豆的總縮合單寧含量降低了15.52%～66.15%。

本實驗所用的香草醛-鹽酸法適用于測定間苯三酚A環(huán)型的原花色素及黃烷醇的含量，說明浸泡使這類縮合單寧大量流失[33]。另外結(jié)果表明，發(fā)芽后六種雜豆的單寧含量先降低后升高，分析原因可能為發(fā)芽可使雜豆內(nèi)部合成間苯三酚A環(huán)型的原花色素或黃烷醇，與花青素相同，新的酚類物質(zhì)生成可能與酶有關(guān)，并且縮合單寧的含量取決于它們的釋放和結(jié)合速率。

表3 浸泡和發(fā)芽對雜豆總花青素的影響

注：ND表示未檢測到。

表4 浸泡和發(fā)芽對雜豆總縮合單寧的影響

表5 浸泡和發(fā)芽對雜豆總抗氧化能力的影響

2.6 浸泡和發(fā)芽對雜豆總抗氧化能力的影響

由表5可知，黑大豆、黑小豆、綠豆在浸泡后總抗氧化能力比生豆顯著增加了14.00～53.29%，紅小豆、紅蕓豆、紫花蕓豆顯著減少了9.46%～36.32%。黑大豆在發(fā)芽過程中總抗氧化能力變化差異不顯著，其他5種雜豆的總抗氧化能力變化差異顯著，變化范圍為黑小豆0.30～0.39U·mg-1、紅小豆0.22～0.38U·mg-1、綠豆0.24～1.13U·mg-1、紅蕓豆0.24～0.38U·mg-1、紫花蕓豆0.37～0.48U·mg-1。

此變化規(guī)律大致與浸泡后雜豆的總酚、總黃酮變化一致，而其中一些加工后的雜豆雖然酚類物質(zhì)含量降低，其總抗氧化能力卻顯著升高，可能是雜豆中的活性多糖、蛋白質(zhì)、維生素等結(jié)合態(tài)物質(zhì)在加工處理后游離出來[34]。

2.7 相關(guān)系數(shù)

酚類物質(zhì)的抗氧化性來源于酚類物質(zhì)分子中大量的酚羥基，來源于多酚獨特的分子結(jié)構(gòu)[35]。由表6可知，生豆和加工后的雜豆的總酚含量與總黃酮和總抗氧化能力呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)?？傸S酮與縮合單寧和總抗氧化能力也呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)。然而，花青素與其他指標(biāo)無顯著相關(guān)性(P>0.05)，縮合單寧與總酚和總抗氧化能力無顯著相關(guān)性(P>0.05)。

表6 各指標(biāo)間的相關(guān)系數(shù)

注：*P<0.05差異顯著;**P<0.01差異極顯著。

加工過程中酚類物質(zhì)發(fā)生著復(fù)雜的生理生化反應(yīng)，間接影響抗氧化能力隨之變化，但花青素極易降解的特性，致使花青素可能不是加工后雜豆的抗氧化能力的來源，并且加工會促使一些具有抗氧化性的非酚類物質(zhì)流出，從而使部分酚類物質(zhì)含量與抗氧化能力不一定呈現(xiàn)相關(guān)性。

3 結(jié)論

浸泡處理顯著降低6種雜豆的總酚、總黃酮、總花青素、總縮合單寧和總抗氧化能力，但浸泡處理可以釋放一些結(jié)合型酚類物質(zhì)，從而使浸泡后的綠豆中總酚、黑小豆中總黃酮、紅蕓豆中總花青素顯著升高。與生豆相比，發(fā)芽可顯著提高黑大豆、黑小豆、綠豆和紅蕓豆酚類物質(zhì)含量且在發(fā)芽4天或5天出現(xiàn)最大值，對紅小豆和紫花蕓豆的酚類物質(zhì)無顯著影響或使其顯著降低。總抗氧化能力與總酚、總黃酮等指標(biāo)呈極顯著正相關(guān)。另外，發(fā)芽使雜豆中的花青素顯著降低，且花青素含量與其他指標(biāo)無顯著相關(guān)性。因此，黑大豆、黑小豆、綠豆和紅蕓豆可以通過發(fā)芽的加工方式來提高酚類物質(zhì)含量，而發(fā)芽不適用于紅小豆和紫花蕓豆的加工。