龔 頻,王思遠(yuǎn),陳雪峰,張濤濤,陳福欣

(1.陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,陜西西安 710021; 2.西安科技大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院,陜西西安 710054)

隨著食品工業(yè)的發(fā)展,食品安全問題愈發(fā)重要,逐漸成為一個(gè)全球重要的公共衛(wèi)生問題,主要表現(xiàn)為非法添加事件頻發(fā)、食源性致病菌引起的食品污染以及農(nóng)藥殘留等問題。近期在包括比利時(shí)、荷蘭、德國在內(nèi)的至少7個(gè)歐盟國家發(fā)現(xiàn)含有殺蟲劑氟蟲腈成分的污染雞蛋[1];常見的經(jīng)濟(jì)作物污染物霉菌毒素可以引起廣泛的毒性,包括致癌性、神經(jīng)毒性以及生殖和發(fā)育毒性[2],在全球范圍內(nèi),超過30%的食品和飼料樣品受到共同污染,與此污染相關(guān)的經(jīng)濟(jì)損失可能在每年數(shù)百萬至數(shù)十億美元之間[3],盡管在竭力控制,但產(chǎn)毒真菌無處不在且在易感農(nóng)作物中頻繁出現(xiàn),并引發(fā)了一系列全球食品安全問題[4];此外還有國內(nèi)的“三鹿奶粉事件”等。因此,快速對(duì)食品安全問題做出反應(yīng)是關(guān)鍵,作為食品安全保障的重要技術(shù)支撐,食品安全快速檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展備受關(guān)注。

膠體金免疫層析試紙條技術(shù)(colloidal gold immunochromatography strip CGIS)是一種新型的膠體金標(biāo)記免疫層析技術(shù),可用于間接定性或半定量的檢測(cè)[5]。膠體金免疫層析試紙條技術(shù)是結(jié)合膠體金檢測(cè)的可視化和免疫層析檢測(cè)的特異性強(qiáng)、快速便捷等特點(diǎn)于一體的一項(xiàng)新型免疫檢測(cè)技術(shù),已成為食品安全快速定量檢測(cè)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。該技術(shù)操作簡便、快速,檢測(cè)特異性強(qiáng)、靈敏度高,無需特殊儀器設(shè)備,對(duì)檢測(cè)人員要求較低,適合于臨床醫(yī)學(xué)、實(shí)驗(yàn)室、現(xiàn)場快速診斷及家庭的自我檢測(cè),已被廣泛地應(yīng)用于對(duì)微生物、農(nóng)藥殘留、激素、重金屬等類別的食品、藥品、化工、生物、臨床醫(yī)學(xué)諸多領(lǐng)域的檢測(cè)[6],因此,該技術(shù)具有良好的發(fā)展前景。本論文對(duì)膠體金免疫層析技術(shù)原理以及其在食品各領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)行了簡要的綜述,并對(duì)其未來發(fā)展趨勢(shì)進(jìn)行了展望。

1 膠體金免疫層析試紙條的原理

1.1 膠體金及其標(biāo)記原理

膠體金是繼熒光標(biāo)記、放射性核素標(biāo)記及酶聯(lián)免疫吸附法之后發(fā)展起來的固相標(biāo)記物[7]。1971年Faulk等[8]將膠體金作為標(biāo)記物用于免疫細(xì)胞學(xué)研究。解泉源等[9]利用熒光免疫微球標(biāo)記的試紙條檢測(cè)大腸桿菌O157∶H7。膠體金顆粒在電子顯微鏡下大多為較小的球形和大于30 nm的橢球形。膠體金也叫納米金,為分散粒子直徑在1～150 nm之間的疏水性金溶膠,屬于多相不均勻體系,顏色呈紅色到紫紅色,這種獨(dú)特的顏色使得在檢測(cè)過程中可以用肉眼快速去檢測(cè)樣品,而不需要顏色標(biāo)記[10]。另外,膠體金的納米尺寸使其具備獨(dú)特的免疫膠體金標(biāo)記特性,而膠體金免疫技術(shù)檢測(cè)的準(zhǔn)確率和應(yīng)用范圍也因納米粒徑大小及顆粒分散性等因素的不同而不同[11]。

膠體金標(biāo)記是由于膠體金在弱堿環(huán)境下帶負(fù)電荷[12],與蛋白質(zhì)分子的正電荷基團(tuán)形成牢固穩(wěn)定的結(jié)合,由于這種結(jié)合是靜電結(jié)合,所以不影響蛋白質(zhì)的生物特性[13]?？傊?蛋白質(zhì)與金顆粒的結(jié)合是基于三個(gè)獨(dú)立且相互依賴的非共價(jià)過程:帶負(fù)電荷的納米顆粒與蛋白質(zhì)上帶正電荷的位點(diǎn)之間的離子相互作用,蛋白質(zhì)與金屬表面之間的疏水吸引力以及金屬與蛋白質(zhì)上氮和硫原子導(dǎo)電電子之間的配位鍵合[14]。之所以此技術(shù)可以形成穩(wěn)定的膠體,是由于膠體金表面的負(fù)電荷金顆粒通過在水中的靜電排斥力而達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)[15],膠體金除了與蛋白質(zhì)結(jié)合以外,還可以與許多其它生物大分子非共價(jià)結(jié)合,可以作為探針進(jìn)行細(xì)胞表面及細(xì)胞內(nèi)部大分子如多糖、蛋白質(zhì)、多肽、核酸等的準(zhǔn)確定位及定量檢測(cè)。因此,近10多年來,膠體金標(biāo)記已經(jīng)成為一項(xiàng)重要的免疫標(biāo)記技術(shù),被廣泛地應(yīng)用于基礎(chǔ)研究及檢疫檢驗(yàn)中。

1.2 膠體金及免疫膠體金的制備

1.2.1 膠體金的制備 由于生物納米顆粒在免疫測(cè)定中性能取決于金顆粒的化學(xué)性質(zhì)以及蛋白質(zhì)的生物活性,所以制備出質(zhì)量好的膠體金顯得尤為重要,這關(guān)乎到試紙條的特性以及敏感性。膠體金的制備方法可以分為化學(xué)法和物理法,化學(xué)法是通過還原法制備膠體金,物理法則會(huì)用到熱分解方法、超聲化學(xué)、光化學(xué)、輻射分解等。但是最為常用的還是采用化學(xué)還原法,常用的還原劑有檸檬酸鈉、鞣酸、抗壞血酸及硼氫化鈉等,其基本原理是使金離子還原變成金原子,使用不同種類、不同劑量的還原劑,可制備出不同大小的膠體金顆粒,其中檸檬酸鈉還原法較為常用。劉亞東等[16]采用檸檬酸鹽還原法制備粒徑為25 nm的膠體金溶液;阮小蕾等[17]采用檸檬酸三鈉還原法制備粒徑為25 nm的膠體金溶液;Wang等[18]采用1973年Frens所得出的方法進(jìn)行制備,用檸檬酸鈉直接去還原氯金酸得到粒徑為17.46 nm的膠體金。膠體金的粒徑及膠體金溶液的顏色與制備時(shí)加入檸檬酸三鈉的量是密切相關(guān)的,因此,可以通過肉眼觀察膠體金溶液的顏色或者通過測(cè)定吸光度來確定膠體金顆粒的大小,其觀察依據(jù)見表1[19]。通常情況下通過外觀就可以判斷出膠體金的質(zhì)量,如果膠體金溶液為澄清透明,無懸浮物,無沉淀,說明膠體金質(zhì)量較好。

表1 四種粒徑膠體金制備檢測(cè)依據(jù)Table 1 Four particle size colloidal gold preparation test basis

1.2.2 免疫膠體金的制備 免疫膠體金的制備實(shí)際上是蛋白質(zhì)等膠體被吸附到膠體金表面的過程,該過程受到很多方面的影響,如:電解質(zhì)、蛋白質(zhì)的量及pH等。薛海燕等[20]確定了最佳標(biāo)記pH為8.0,最佳標(biāo)記蛋白濃度為10 μL。Astrid Foubert等[21]在單克隆抗體與金納米顆粒結(jié)合之前,構(gòu)建絮凝曲線以得到最好的結(jié)合條件,用K2CO3去調(diào)節(jié)膠體金溶液pH,然后加入用Tris緩沖液(pH8.5,10 mmol/L)稀釋的抗體反應(yīng)15 min,加入牛血清白蛋白BSA溶液(膠體金/BSA=40/1(v/v)),劇烈攪拌混合物10 min,將離心得到的沉淀重懸于含有1% BSA和1%蔗糖的10 mmol/L Tris緩沖液中,得到單克隆抗體與膠體金的結(jié)合物。

總之免疫膠體金的標(biāo)記過程常見的步驟如下[22]:

標(biāo)記前需將蛋白質(zhì)用雙蒸水透析以除去影響標(biāo)記的電解質(zhì);通過系列稀釋法(包括1管無蛋白質(zhì)的膠體金作為空白對(duì)照)找出能使膠體金穩(wěn)定的蛋白質(zhì)溶液的最低濃度,在此基礎(chǔ)上再加1%～20%,即為最佳標(biāo)記量;用0.1 mol/L的K2CO3或者0.1 mol/L的HCl調(diào)節(jié)膠體金的pH,使其盡量接近或者略高于包被蛋白質(zhì)的等電點(diǎn);將待標(biāo)記蛋白以最佳標(biāo)記量適當(dāng)稀釋后,緩慢滴加到膠體金中,繼續(xù)攪拌20 min,然后緩慢滴加10%的BSA至終濃度為0.5%或1%(或加入10% PEG 20000至終濃度為1%),繼續(xù)攪拌1 h。4 ℃靜置2～3 h(或過夜),終止反應(yīng);反應(yīng)結(jié)束后,4 ℃ 10000 r/min離心1 h,小心吸取清液,切忌傾倒;將沉淀懸浮于1/10原體積的1% BSA中,離心洗滌,加入等體積的1% BSA溶液,最后加入含0.02%疊氮鈉防腐劑的TBS緩沖液懸浮,即可獲得膠體金探針,也可加甘油混勻,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 膠體金免疫層析試紙條的原理及制備

膠體金免疫層析試紙條包括樣品墊、結(jié)合墊、層析膜、吸水濾紙、PVC板五部分構(gòu)成。其構(gòu)成如圖1。

圖1 膠體金免疫層析試紙條結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Colloidal gold immunochromatographic test strip structure diagram

膠體金試紙條的制備與膜和墊的處理、膠體金的制備有很大關(guān)系。楊波等[23]確定最佳包被抗原及抗體工作濃度,再將其包被于NC膜上的T線和C線上,再將免疫膠體金包被于結(jié)合墊,按上述圖制成長為9 cm、寬3 mm的試紙條。Yu等[24]通過采用直徑為40 nm的膠體金和兩種豬繁殖與呼吸綜合癥病毒蛋白質(zhì)外殼混合物的綴合來制備免疫膠體金,將0.8 mg/mL的蛋白質(zhì)混合物和2 mg/mL抗體包被于NC膜上作為T線和C線,由此組成的試紙條可以在4～30 ℃下保持1年。

膠體金免疫層析試紙條技術(shù)由于其試紙條的結(jié)構(gòu)以及其檢測(cè)原理,可廣泛應(yīng)用于大分子類蛋白質(zhì)以及小分子類毒素等的檢測(cè);試紙條的操作簡單,無需經(jīng)過專業(yè)訓(xùn)練,結(jié)果直觀;試紙條尺寸小攜帶方便,可實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場檢測(cè);標(biāo)記物膠體金毒性較其他標(biāo)記物低,安全性高。

2 膠體金免疫層析試紙條技術(shù)在食品各領(lǐng)域的應(yīng)用

食品安全問題已經(jīng)成為全球性問題,食品中的致病菌及其毒素、食品中加入非法化學(xué)成分以及外界環(huán)境對(duì)食品的污染等都是引起食品安全問題的主要原因。因此,必須建立一種特異、靈敏、快速的檢測(cè)方法以確保食品安全。目前,國內(nèi)在食品安全檢測(cè)方面還集中于傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)、ELISA及PCR等技術(shù),由于其檢測(cè)時(shí)間長、成本較高等缺點(diǎn)，不適宜檢測(cè)技術(shù)的現(xiàn)場實(shí)施。而膠體金免疫層析技術(shù)不需要特殊的檢測(cè)儀器,操作時(shí)間短,而且方便攜帶,適用于現(xiàn)場檢測(cè),檢測(cè)時(shí)間從樣品處理到結(jié)果處理大約在30 min之內(nèi),基本無假陽性的出現(xiàn),并且基本滿足食品安全食用標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)要求,在食品檢驗(yàn)檢疫方面具有較好的應(yīng)用價(jià)值。表2列出該技術(shù)在各領(lǐng)域的部分檢測(cè)情況。

表2 免疫層析試紙條技術(shù)在食品各領(lǐng)域的應(yīng)用Table 2 Application of immunochromatographic test strip technology in various fields of food

2.1 膠體金免疫試紙條技術(shù)在食品污染物檢測(cè)方面的應(yīng)用

盧守英[28]采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金,以金標(biāo)AFB1單克隆抗體作為探針,將AFB1-BSA(檢測(cè)線)和羊抗鼠IgG(質(zhì)控線)分別包被在硝酸纖維素膜上,構(gòu)建了間接競爭膠體金免疫層析檢測(cè)體系,研制出AFB1膠體金免疫層析試紙條,其檢出限為5 ng/mL,檢測(cè)時(shí)間為5～10 min,適用于對(duì)AFB1進(jìn)行現(xiàn)場檢測(cè)。

玉米赤霉烯酮是一類由鐮刀菌產(chǎn)生的次生代謝物,廣泛存在于玉米、大麥、燕麥、小麥、大米和高粱等作物中。它不僅影響農(nóng)作物的經(jīng)濟(jì)和營養(yǎng)價(jià)值,還對(duì)人畜有一定的毒害作用。趙紅艷[29]制備了赤霉烯酮的膠體金免疫層析試紙條,其最低檢測(cè)限為30 μg/kg。伏馬菌素是由輪枝鐮孢菌與串珠鐮孢菌所產(chǎn)生的一類水溶性代謝產(chǎn)物,具有生殖毒性和免疫毒性,能污染玉米、小麥、水稻等谷類及其制品。樊海新等[30]建立了快速檢測(cè)伏馬菌素B1的膠體金免疫層析試紙條,靈敏度可達(dá)到2 ng/mL,檢測(cè)時(shí)間僅需10 min。Fabio Di Nardo等[31]建立了基于金納米粒子的多色免疫層析試紙去測(cè)定黃曲霉毒素B1和伏馬菌素,可以同時(shí)快速測(cè)定玉米粉中的兩種霉菌毒素,黃曲霉毒素B1的視覺檢出限為2 μg/kg,伏馬菌素的視覺檢出限為1000 μg/kg,這是第一個(gè)基于使用不同顏色金納米粒子的多色免疫層析試紙,即通過使用藍(lán)色沙漠玫瑰狀金納米粒子(DR-GNPs)和紅色球狀金納米粒子(s-GNP)來作為標(biāo)記物。Yao等[32]成功制備了以膠體金為標(biāo)記的抗伏馬菌素B1單克隆抗體探針,用于建立免疫層析條帶,試紙條顯示出高靈敏度和特異性,檢出限為11.24 ng/mL。由于樣品制備過程簡單且與其他方法有高度一致性,該方法已廣泛運(yùn)用于全球范圍。

2.2 膠體金免疫試紙條技術(shù)在食品非法添加劑檢測(cè)方面的應(yīng)用

食品安全的另一大問題就是非法添加劑的使用,對(duì)牛奶、奶粉、飼料中所添加的三聚氰胺[33-34]、牛奶中新霉素[35]等的快速檢測(cè)就顯得至關(guān)重要。

目前,氯霉素、孔雀石綠和硝基呋喃類藥物在水產(chǎn)品中殘留最為嚴(yán)重,屬于必檢項(xiàng)目[36]。這些藥物簡單且廉價(jià)易得,因而在水產(chǎn)品養(yǎng)殖中使用較廣,在動(dòng)物體內(nèi)代謝時(shí)間較長,能夠不同程度地在水產(chǎn)品中蓄積,最后通過食物鏈的作用危害人體健康,主要表現(xiàn)為致癌、致畸、致突變等現(xiàn)象。硝基呋喃類藥物是一種廣譜性抗菌藥物,在低濃度下對(duì)大多數(shù)革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌、某些真菌和原蟲有抑制作用,高濃度則有殺滅作用,其抑菌作用機(jī)理是干擾細(xì)菌體內(nèi)的氧化還原酶系統(tǒng),致使細(xì)菌代謝紊亂,常用于治療和預(yù)防魚類及畜禽類因感染沙門氏菌和大腸埃希菌而引起的疾病,在畜牧業(yè)及水產(chǎn)養(yǎng)殖中使用廣泛。柳愛春等[37]建立了水產(chǎn)品中硝基呋喃代謝物GICA快速檢測(cè)方法,成功研制出了免疫膠體金快速檢測(cè)試劑盒,對(duì)3-氨基-2-唑烷基酮的最低檢出限是0.5 μg/kg,對(duì)氨基脲、1-氨基-2-內(nèi)酰脲的檢出限為1.0 μg/kg,并與LC-MS/MS法的檢測(cè)結(jié)果對(duì)比,符合率為98%。潘嘉慧等[38]制備了呋喃妥因代謝物膠體金免疫層析試紙條,其檢測(cè)限為1.0 μg/kg。

氯霉素是一種廣譜抗菌素,被廣泛用于治療傷寒等疾病。研究表明,如果人們長期食用含有氯霉素殘留的動(dòng)物源性食品,將對(duì)健康構(gòu)成直接或潛在的威脅。許多國家對(duì)食品中氯霉素殘留的最大允許檢出限量低至0.3 ng/g。許勝男[39]建立了磁固相萃取前處理與膠體金免疫層析試紙條聯(lián)用的方法,一方面了擴(kuò)大了試紙條的使用范圍,另外一方面實(shí)現(xiàn)了在蜂蜜和雞蛋樣品中的檢出限低至0.2 ng/g的水平。龔云飛等[40]制備的三聚氰胺膠體金檢測(cè)試紙條對(duì)牛奶、奶粉和飼料中的三聚氰胺殘留的檢出限分別為100 g/L、100 ng/g和200 ng/g,在常溫干燥環(huán)境下可至少保質(zhì)6個(gè)月,能夠檢測(cè)出三聚氰胺含量大于50 g/L的樣品,適用于現(xiàn)場實(shí)際樣品的三聚氰胺殘留水平監(jiān)測(cè),具有良好的應(yīng)用前景。Liu等[41]開發(fā)了基于抗體的膠體金免疫層析側(cè)向流動(dòng)試紙條,用于檢測(cè)牛乳和酸奶樣品中的游霉素(Nata)殘留物,將產(chǎn)生針對(duì)其殘留物的單克隆抗體(mAb)與金納米顆粒綴合形成免疫膠體金來達(dá)到標(biāo)記作用,并且這種半定量方法僅需15 min即可完成檢測(cè),包被抗原和mAb的最佳濃度分別為0.15、0.2 μg/mL,而基于光密度掃描儀,牛奶和酸奶樣品中Nata的視覺檢出限分別為5 μg/L和10 μg/kg。

2.3 膠體金免疫試紙條技術(shù)在食源性致病菌檢測(cè)方面的應(yīng)用

食源性致病菌也是食品安全的重大隱患之一,常見的有大腸桿菌、沙門氏菌、單增李斯特菌、副溶血性弧菌、金黃色葡萄球菌等,對(duì)致病菌快速高靈敏的檢測(cè)能夠有效阻斷其傳播途徑,因此對(duì)于食品中副溶血性弧菌[42-43]、氯霉素[44]等的檢測(cè)是關(guān)鍵。

潘秀華等[45]采用DNAStar軟件對(duì)單增李斯特菌inlA全長基因編碼蛋白進(jìn)行抗原表位分析,截取部分inlA基因片段構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒,誘導(dǎo)表達(dá)和純化獲得重組蛋白。以該蛋白免疫BALB/c小鼠,篩選高效分泌抗InlA單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株,制備單克隆抗體;以雙抗體夾心的原理研制膠體金免疫層析檢測(cè)試紙條,該試紙條對(duì)單增李斯特菌純培養(yǎng)物敏感性為2.4×105CFU/mL,模擬豬肉樣品敏感性為4.0×106CFU/mL,在4 ℃下的保存期可達(dá)16周以上。布日額等[46]將鼠抗S.aureusIgG進(jìn)行膠體金標(biāo)記,并噴涂于玻璃纖維上制備金標(biāo)墊,分別以兔抗S.aureusnEBPS重組蛋白IgG和羊抗鼠IgG作為檢測(cè)線和質(zhì)控線,組裝制備快速檢測(cè)牛乳中致病性S.aureus膠體金免疫層析試紙條,金黃色葡萄球菌試紙條能夠最低檢出1.0×105CFU/mL的S.aureus。海產(chǎn)品也是較易被污染的對(duì)象,Wu等[47]開發(fā)用于快速檢測(cè)羅非魚無乳鏈球菌的膠體金免疫層析試紙條,其靈敏度是1.5×105菌落形成單位(CFU),與其他常見的細(xì)菌沒有交叉反應(yīng)且與ELISA法檢測(cè)結(jié)果一致,檢測(cè)時(shí)間小于15 min,試紙條的有效性在4 ℃下保持6個(gè)月。Song等[48]利用膠體金免疫層析條帶成功開發(fā)了一種同時(shí)檢測(cè)志賀氏菌和大腸桿菌O157∶H7的模型條帶,用于檢測(cè)面包、果醬以及牛奶中的食源性致病菌,對(duì)于志賀氏菌和大腸桿菌O157∶H7條帶測(cè)試的靈敏度確定為106CFU/mL,并且沒有與其他相關(guān)細(xì)菌交叉反應(yīng)。目前膠體金免疫層析技術(shù)可較好地解決常規(guī)致病菌檢測(cè)流程所面臨的操作復(fù)雜、特異性低以及靈敏度低等問題,但對(duì)多種致病菌同時(shí)檢測(cè)是當(dāng)下的趨勢(shì)。

2.4 膠體金試紙條技術(shù)在食品中農(nóng)藥殘留檢測(cè)方面的應(yīng)用

在農(nóng)藥獸藥殘留檢測(cè)中,在對(duì)豬肉中磺胺類[49](磺胺二甲氧嘧啶、磺胺嘧啶和磺胺二甲基嘧啶)和克倫特羅藥物殘留[50-51]、豬肝中喹乙醇[52]、牛奶中氨基糖苷類藥物殘留[53]的快速檢測(cè),還包括在對(duì)水產(chǎn)品中孔雀石綠[54]、貝毒素[55]和水中殘留抑菌劑磺胺類藥物[56]、硝基呋喃類代謝物[57]及恩諾沙星[58]的快速檢測(cè)中,膠體金試紙條都發(fā)揮著重要作用。

氯噻啉是一種作用于煙酸乙酰膽堿酯酶受體的新煙堿類內(nèi)吸性殺蟲劑,因其活性高、毒性低、殺蟲譜廣,被廣泛應(yīng)用于水稻、小麥、蔬菜、果樹等作物中,用于防治蚜蟲、葉蟬、飛虱等刺吸式口器害蟲,對(duì)鞘翅目、雙翅目和鱗翅目害蟲也有效[5]。隨著氯噻啉使用量的提高,其殘留問題也日益受到關(guān)注。施海燕等[59]利用生物素-鏈霉親和素的高親和作用,將氯噻啉抗體和生物素化DNA與13 nm膠體金雙標(biāo)記,將鏈霉親和素與41 nm膠體金標(biāo)記,制備了氯噻啉膠體金增強(qiáng)免疫層析試紙條,試紙條可在10 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)可視化判讀,檢出限為25 ng/mL,氯噻啉在河水、大米、黃瓜、番茄、梨、甘藍(lán)和蘋果樣品中的添加濃度為0.05、0.5和5 μg/g時(shí),GICA的檢測(cè)結(jié)果均符合添加水平。Joel Isanga等[60]開發(fā)了阿米卡星敏感的單克隆抗體(MAb)測(cè)定和免疫色譜試紙條,并將其用于檢測(cè)牛乳和雞蛋中抗生素阿米卡星殘留,該免疫測(cè)定所使用的MAb對(duì)阿米卡星具有特異性且對(duì)其他氨基糖苷類抗生素沒有交叉反應(yīng),測(cè)試過程可在10 min內(nèi)完成且視覺檢出限為5.0 ng/mL。Laxmana Naik等[61]開發(fā)了一種快速,半定量側(cè)流測(cè)定(LFA)來篩選牛奶樣品中的土霉素(OTC)抗生素殘留物,通過將OTC摻加到無抗生素的牛奶樣品中驗(yàn)證測(cè)定,結(jié)果可在5 min內(nèi)完成,視覺檢測(cè)限為30 μg/mL。

2.5 膠體金試紙條技術(shù)在食品中重金屬污染檢測(cè)方面的應(yīng)用

近年來,我國發(fā)生多起重金屬污染事件,目前國內(nèi)重金屬的檢測(cè)方法主要有原子吸收光譜法、電感耦合等離子體質(zhì)譜法(ICP-MS)、原子熒光法、紫外可見分光光度法、高效液相色譜法等,但這些方法檢測(cè)時(shí)間長,所需樣品前處理較為繁瑣,對(duì)儀器及實(shí)驗(yàn)人員的要求較高。

朱旭東等[62]利用IEDTA螯合鎘離子,并與匙孔血藍(lán)蛋白KLH偶聯(lián),合成鎘離子抗原。經(jīng)過免疫小鼠及細(xì)胞融合后篩選到鎘離子的單克隆抗體細(xì)胞株。通過親和層析的方法制備得到鎘單克隆抗體,并建立了糧食樣本中競爭法原理的重金屬鎘膠體金免疫層析定量檢測(cè)方法,該方法檢測(cè)靈敏度為50 μg/kg,定量檢測(cè)范圍為50～400 μg/kg,為糧食中重金屬鎘檢測(cè)提供了一個(gè)有效的途徑。

王亞楠等[63]用異硫氰酯法合成Cr3+-i EDTA-BSA,細(xì)胞融合技術(shù)篩選Cr3+-EDTA mAb細(xì)胞株,體內(nèi)誘生腹水法制備Cr3+-EDTA mAb,建立了更加靈敏、特異的鉻離子膠體金免疫層析快速檢測(cè)方法。檢測(cè)特異性較好,檢出限為5 μg/L,檢測(cè)時(shí)間為10 min。

3 現(xiàn)有不足

免疫膠體金快速診斷技術(shù)的簡便、快速、相對(duì)靈敏以及較低基質(zhì)效應(yīng)[64]等優(yōu)點(diǎn),使其更適合于社會(huì)防疫、家庭生活、生物武器以及現(xiàn)場檢測(cè)等方面,也為膠體金標(biāo)記免疫技術(shù)同時(shí)檢測(cè)多種物質(zhì)提供了新的思路。然而,該技術(shù)目前的檢出限高于較其他標(biāo)記物,所以作為標(biāo)記物還存在一些缺陷。

研究表明標(biāo)記材料的不同對(duì)側(cè)向流動(dòng)測(cè)定靈敏度有很大的影響[65],與其他標(biāo)記物相比,用膠體金所標(biāo)記的試紙條,其視覺檢出限要高于其他標(biāo)記物,Hu等[65]首次系統(tǒng)地比較了時(shí)間分辨熒光納米珠(TRFN-LFA),熒光亞微球(FM-LFA)、量子點(diǎn)(QD-LFA)和基于膠體金(CG-LFA)的側(cè)向流動(dòng)測(cè)定,以基于競爭的方式定量檢測(cè)豬尿液中的萊克多巴胺,其檢出限分別為7.2、14.7、23.6和40.1 pg/mL;Tang等[66]利用膠體金和Eu3+摻雜的熒光微球用作標(biāo)記以開發(fā)用于檢測(cè)牛奶中三聚氰胺的免疫色譜條并對(duì)其進(jìn)行比較,結(jié)果表明利用膠體金所得視覺檢出限為150 μg/L,要高于Eu3+摻雜的熒光微球75 μg/L;Zhang[64]成功建立了時(shí)間分辨熒光納米珠(TRFN-ICA)和膠體金免疫層析法(CG-ICA),并對(duì)二者在間接競爭方式的基礎(chǔ)上對(duì)豬尿中克倫特羅定量檢測(cè)進(jìn)行了系統(tǒng)比較,TRFN-ICA的靈敏度優(yōu)于CG-ICA且前者的檢測(cè)時(shí)間少于后者。Li等[67]利用膠體金、量子點(diǎn)和聚苯乙烯微球作為三種側(cè)流免疫色譜測(cè)定(ICAs)中的標(biāo)記,用于檢測(cè)谷物樣品中的玉米赤霉烯酮,結(jié)果顯示膠體金標(biāo)記的檢出限為10 μg/L,量子點(diǎn)和聚苯乙烯微球基的檢出限為1 μg/L,用膠體金標(biāo)記的檢出限遠(yuǎn)高于其他兩種。由此可見基于膠體金標(biāo)記的免疫層析技術(shù)還有其不足之處。

4 展望

目前膠體金免疫層析試紙條技術(shù)在食品質(zhì)量與食品安全上都有廣泛應(yīng)用,但隨著現(xiàn)代生物技術(shù)和納米材料的發(fā)展,出現(xiàn)了多種新型的標(biāo)記材料,包括量子點(diǎn)、熒光微球、上轉(zhuǎn)磷光納米粒子、納米磁珠、鑭系稀土、碳納米顆粒[68]、脂質(zhì)體[69]等作為標(biāo)記材料將逐漸代替膠體金,成為免疫層析試紙條技術(shù)發(fā)展的新方向[70]。單一的標(biāo)記材料可能會(huì)影響到該技術(shù)的靈敏度,所以結(jié)合其他標(biāo)記材料以制成新型多功能材料來富集目標(biāo)物,提高該技術(shù)的靈敏度和檢測(cè)速度是研究趨勢(shì)之一;其定性檢測(cè)方式也會(huì)制約其發(fā)展,所以將該技術(shù)與相關(guān)讀數(shù)儀結(jié)合來開發(fā)出快速定量檢測(cè)試劑盒是必要的,這順應(yīng)了該技術(shù)的發(fā)展前景,使之成為更有效的食品檢測(cè)工具。