李 莉,李 碩,王海燕,丁 宏

(中國食品藥品檢定研究院,北京 100050)

生物毒素,是生物機(jī)體分泌的、不可復(fù)制的有毒化學(xué)物質(zhì),對其他生物物種有毒害作用,包括動(dòng)物、植物、微生物在其生長繁殖過程中或一定條件下產(chǎn)生的有毒物質(zhì)[1]。根據(jù)毒素產(chǎn)生的生物分類,分為細(xì)菌毒素、真菌毒素、植物毒素、動(dòng)物毒素和海洋生物毒素[2]。生物毒素具有較高的生物毒性,如致癌、致畸和肝腎毒性等,攝入被生物毒素污染的食品會對大眾健康造成極大危害[2]。近年來,生物毒素導(dǎo)致的食品安全問題受到世界各國和有關(guān)國際組織的高度重視[3]。真菌毒素(真菌有毒代謝物)對食品和飼料的污染、藻類毒素(藻類產(chǎn)生的毒素)對水產(chǎn)品的污染以及植物毒素對可食用植物的污染被世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)列為食源性疾病的重要根源[4]。

目前,生物毒素尤其是真菌毒素和藻類毒素引發(fā)的食品安全問題已經(jīng)成為各國食品監(jiān)管關(guān)注的重點(diǎn)。由于該類物質(zhì)具有高風(fēng)險(xiǎn)性,近幾十年來許多國家或國際組織制定了諸多有關(guān)食品中致癌類生物毒素的法規(guī),對其進(jìn)行嚴(yán)格控制。隨著檢測技術(shù)的發(fā)展和對生物毒素認(rèn)識的不斷提高,生物毒素的檢測標(biāo)準(zhǔn)也在不斷更新。本文梳理了各個(gè)國家部門和地區(qū)以及主要國際組織關(guān)于致癌性生物毒素限量和檢測方法標(biāo)準(zhǔn),并與我國現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了比較,找出存在的差異,并對發(fā)現(xiàn)的問題提出一些建議,以期為該領(lǐng)域檢測方法選擇和標(biāo)準(zhǔn)制修訂提供參考。

1 食品中常見的致癌性生物毒素

國際癌癥研究機(jī)構(gòu)(International Agency for Research on Cancer,IARC)自1971年以來開始對致癌因素進(jìn)行評估,其中有400多個(gè)被確定為對人類致癌或者可能致癌[5]。根據(jù)IARC的致癌物質(zhì)分級列表,目前已明確致癌或可能致癌的生物毒素類有:黃曲霉毒素(1,2012)、黃曲霉毒素M1(2B,1993)、赭曲霉毒素A(2B,1993)、伏馬毒素B1(2B,2002)、雜色曲霉毒素(2B,1987)、微囊藻毒素LR(2B,2010)等[5]。常見致癌性生物毒素種類以及化學(xué)和毒理學(xué)特征見表1。

表1 食品中常見致癌性生物毒素的種類及特征Table 1 Types and characteristics of carcinogenic biotoxins in foods

2 食品中致癌性生物毒素的限量規(guī)定

影響食品中真菌和污染物限量標(biāo)準(zhǔn)和法規(guī)制定的主要因素包括:食品安全風(fēng)險(xiǎn)評估數(shù)據(jù)、各類食品中真菌毒素含量范圍、可用的檢測方法、主要貿(mào)易伙伴國家現(xiàn)有的法規(guī)以及是否滿足足夠的糧食需求等[6]。全球各個(gè)國家和地區(qū)以及國際組織出臺的真菌毒素的限量標(biāo)準(zhǔn)各有差異,但均沒有覆蓋所有的真菌毒素種類。最重要的真菌毒素有:黃曲霉毒素、赭曲霉素A、棒曲霉素、伏馬毒素、玉米赤霉烯酮和一些單端孢霉烯族,如脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、T-2毒素等。表2[9-18]列出中國、歐盟、美國、加拿大和日本等國家和組織法規(guī)中給出限量的真菌毒素種類,可以看出,由于飲食結(jié)構(gòu)差異、主要食品種類和居民膳食暴露評估結(jié)果的不同,各個(gè)國家和地區(qū)及國際組織重點(diǎn)監(jiān)管的真菌毒素的類別有所不同。

表2 國內(nèi)外食品法規(guī)中涉及的主要致癌性真菌毒素Table 2 Major carcinogenic mycotoxins in food regulation at home and abroad

世界衛(wèi)生組織(WHO)規(guī)定微囊藻毒素-LR的每日耐受攝入量(TDI)為0. 04 μg/(kg·d),飲用水中微囊藻毒素-LR的最高限值為1 μg/L[7]。目前世界上大部分國家對于飲用水中微囊藻毒素-LR的限量都沿用了WHO的規(guī)定,我國生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)(GB 5749-2006)也規(guī)定飲用水中微囊藻毒素-LR的濃度不得高于0.001 mg/L[8]。但是對于食品中微囊藻毒素和結(jié)球藻毒素,目前世界各國均沒有制定限量標(biāo)準(zhǔn)。

3 食品中致癌性生物毒素的檢測標(biāo)準(zhǔn)

為了保障限量法規(guī)能夠得以有效實(shí)施,加強(qiáng)食品中致癌性生物毒素的風(fēng)險(xiǎn)控制,許多國家和國際組織出臺了配套的標(biāo)準(zhǔn)分析方法。目前,在標(biāo)準(zhǔn)方法制定方面比較有影響力的國際組織有:國際標(biāo)準(zhǔn)化組織(International Organization for Standardization,ISO)、美國分析化學(xué)家協(xié)會(Association of Official Analytical Chemists,AOAC)以及歐盟標(biāo)準(zhǔn)委員會(Comité Européen de Normalisation,CEN),它們在制定食品中致癌性生物毒素檢測方法標(biāo)準(zhǔn)方面都做了大量的工作[19]。近年來,我國在真菌毒素和藻毒素檢測國家標(biāo)準(zhǔn)制修訂方面也取得了長足進(jìn)步,積極和國際標(biāo)準(zhǔn)接軌,已經(jīng)達(dá)到較高的水平。

3.1 黃曲霉毒素的檢測標(biāo)準(zhǔn)

黃曲霉毒素作為世界上發(fā)現(xiàn)最早、危害最嚴(yán)重的強(qiáng)致癌性真菌毒素,一直受到國際社會的高度重視。ISO、AOAC 以及CEN真菌毒素官方標(biāo)準(zhǔn)中涉及黃曲霉毒素的檢測標(biāo)準(zhǔn)是最多的。相較于ISO和CEN而言,AOAC檢測方法的檢測對象覆蓋面廣,技術(shù)相對比較完善;CEN標(biāo)準(zhǔn)方法在引用了ISO的方法的基礎(chǔ)上,對于嬰幼兒食品等限量要求較高、適用于特殊人群一類產(chǎn)品另行給出了檢測方法。

我國目前現(xiàn)行的食品或糧油中黃曲霉毒素檢測標(biāo)準(zhǔn)共9個(gè),包括2個(gè)國家標(biāo)準(zhǔn)(GB)、3個(gè)出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(SN)、3個(gè)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(NY)以及3個(gè)糧食行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(LS)。食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB5009.22 和GB 5009.24為強(qiáng)制性國家標(biāo)準(zhǔn),其余為推薦性標(biāo)準(zhǔn)(見表3[20-33])。我國黃曲霉毒素檢測標(biāo)準(zhǔn)方法大致可以分為確認(rèn)方法和快速檢測方法兩大類。確認(rèn)方法主要是基于各種理化儀器設(shè)備,如高效液相色譜法、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法等實(shí)驗(yàn)室常規(guī)分析方法?？焖俸Y查方法主要是以免疫化學(xué)為基礎(chǔ)的檢測方法,包括免疫親和柱法、酶聯(lián)免疫吸附法等,適宜現(xiàn)場使用。由于樣品復(fù)雜多樣及免疫法所用酶的不穩(wěn)定性,快速篩查方法重現(xiàn)性不如確認(rèn)方法,容易出現(xiàn)假陽性。和國際主流的檢測方法相比較,我國黃曲霉毒素的檢測標(biāo)準(zhǔn)從目標(biāo)化合物到檢測技術(shù)都達(dá)到了國際先進(jìn)的水平(見表3)。根據(jù)近幾年標(biāo)準(zhǔn)修訂情況和國際主流檢測方法發(fā)展趨勢,目前液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)以其高準(zhǔn)確性、高靈敏度的優(yōu)勢,消除了液相色譜法存在的定性誤差,同時(shí)同位素內(nèi)標(biāo)法可以消除樣品提取的損失和基質(zhì)效應(yīng)的影響,定量準(zhǔn)確,是今后黃曲霉毒素檢測技術(shù)發(fā)展的主要方向。

表3 ISO、AOAC、CEN以及中國食品中黃曲霉毒素檢測方法對比Table 3 Comparison of determination methods of aflatoxins in food of ISO,AOAC,CEN and China

3.2 赭曲霉毒素的檢測標(biāo)準(zhǔn)

赭曲霉毒素的檢測標(biāo)準(zhǔn)多以檢測赭曲霉毒素A為主(見表4)。由于不同地區(qū)飲食習(xí)慣和主要糧食作物的不同,不同國家和地區(qū)食品中赭曲霉素A的檢測標(biāo)準(zhǔn)主要的適用范圍有所差距,ISO提供的赭曲霉毒素A檢測方法有2個(gè),適用于谷物及其制品,樣品經(jīng)過不同的前處理后采用高效液相法測定。歐盟在此基礎(chǔ)上,針對大麥、烘焙咖啡、葡萄酒、啤酒、葡萄干等干果以及嬰幼兒谷類食品等食品制定了各自的檢測標(biāo)準(zhǔn),都采用了免疫親和柱凈化高效液相色譜測定的方法。AOAC早期起草的檢測方法多以薄層色譜法為主,近幾年發(fā)布的方法也采用了目前較為主流的免疫親和柱凈化高效液相色譜法。我國現(xiàn)行的赭曲霉素A檢測標(biāo)準(zhǔn)中共有5個(gè),包括1個(gè)國家標(biāo)準(zhǔn)和4個(gè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[34-37],適用范圍包括谷物、油料、酒類、咖啡、辣椒、醬油等多個(gè)食品種類。檢測手段涉及高效液相色譜、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用等技術(shù),樣品前處理多采用免疫親和凈化。此外我國糧食部門根據(jù)我國糧食質(zhì)量安全監(jiān)管的需要還制定了用于快速測定的膠體金快速定量法和超高效液相色譜法,用于日常的監(jiān)測工作。膠體金試紙法檢測時(shí)間快,步驟簡單,靈活性高,適合大量樣品快速篩查,不足之處是容易出現(xiàn)假陰性和假陽性。高效液相色譜法和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)更適用于實(shí)驗(yàn)室中準(zhǔn)確的定性和定量檢測,結(jié)果較快檢方法更加準(zhǔn)確可靠。由于赭曲霉素A廣泛存在于谷物、及其制品、牛奶、咖啡、香料、酒類和中草藥中,樣品種類繁多,基質(zhì)復(fù)雜,日常檢測工作中可以結(jié)合實(shí)際需求,選擇最為合適的檢測方法。

表4 食品中赭曲霉素A的檢測方法Table 4 Determination methods of ochratoxin A in food

3.3 鐮刀菌屬毒素的檢測標(biāo)準(zhǔn)

鐮刀菌屬毒素是近幾年關(guān)注的重點(diǎn),該菌屬涉及的毒素種類較多,現(xiàn)行的檢測標(biāo)準(zhǔn)主要針對受關(guān)注度較高的幾種毒素,歐盟、AOAC及我國鐮刀菌屬毒素檢測標(biāo)準(zhǔn)見表5。ISO提供了動(dòng)物飼料中玉米赤霉烯酮的檢測標(biāo)準(zhǔn),但沒有涉及食品領(lǐng)域。歐盟標(biāo)準(zhǔn)中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮、伏馬毒素B1和B2、T-2毒素和HT-2毒素均制定了相應(yīng)的檢測方法,適用范圍為玉米、谷類及其制品,此外還給出了嬰幼兒食品中多種毒素的液相色譜-質(zhì)譜篩查方法。AOAC檢測標(biāo)準(zhǔn)主要關(guān)注脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮和伏馬毒素,檢測方法種類較全面,有薄層色譜法、氣相色譜法、液相色譜法和酶聯(lián)免疫法等,但發(fā)布日期都比較早,近幾年沒有更新新的方法。我國現(xiàn)行鐮刀菌屬毒素的檢測標(biāo)準(zhǔn)包括4個(gè)國家標(biāo)準(zhǔn)和7個(gè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[38-47],與AOAC和歐盟的檢測標(biāo)準(zhǔn)相比,我國的檢測方法涵蓋的食品種類較多,檢測手段也更為豐富,囊括了常用的檢測技術(shù),如薄層色譜法、酶聯(lián)免疫法、高效液相色譜、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用等。新修訂的國家食品安全標(biāo)準(zhǔn)采用了同位素稀釋液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法,極大地提高了檢測的準(zhǔn)確性和靈敏度。鐮刀菌屬毒素種類繁多,污染率高,毒性也較強(qiáng),是我國糧食、飼料及其制品主要的污染物之一,根據(jù)報(bào)道,除糧食、飼料外,在油料作物、調(diào)味品、乳和乳制品、肉類、發(fā)酵產(chǎn)品、干果、水果、蔬菜等都發(fā)現(xiàn)了不同程度的污染。由于真菌毒素的研究和監(jiān)管歷史并不長,相當(dāng)一部分鐮刀菌屬毒素仍缺乏毒性數(shù)據(jù),有待進(jìn)一步毒理學(xué)評估,目前已明確毒性較大的部分真菌毒素,由于缺乏檢測標(biāo)準(zhǔn),未被收錄進(jìn)法定檢驗(yàn)項(xiàng)目中。此外現(xiàn)有的檢測標(biāo)準(zhǔn)還存在檢測對象分散、適用范圍窄的問題,有待于進(jìn)一步的提高和改進(jìn)。

表5 食品中鐮刀菌屬毒素的檢測方法Table 5 Determination methods of Fusarium mycotoxins in food

3.4 其他致癌性生物毒素的檢測標(biāo)準(zhǔn)

棒曲霉素(展青霉素)在水果及其制品、飼料、蔬菜、谷物等中均被不同程度地檢測到,尤其是蘋果及其制品中污染較為嚴(yán)重[48]。歐盟、AOAC及我國都出臺了針對蘋果及其制品中展青霉素的檢測標(biāo)準(zhǔn)(見表6[49-53]),檢測方法以常規(guī)的薄層色譜法和液相色譜法為主。我國在新修訂的GB 5009.185-2016中首次引入同位素稀釋液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法,能夠更好地彌補(bǔ)液相色譜法和薄層色譜法的不足,處于世界領(lǐng)先水平。另外有些致癌性生物毒素,如雜色曲霉素、微囊藻毒素,目前國際上尚無該類毒素的限量標(biāo)準(zhǔn),為了更好地對該類物質(zhì)進(jìn)行食品安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測和評估,我國也出臺了部分檢測標(biāo)準(zhǔn),檢測方法采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測技術(shù)。

表6 食品中其他致癌性生物毒素的檢測方法Table 6 Determination methods of other carcinogenic biotoxins in food

4 結(jié)論與展望

食品安全問題直接關(guān)系到人類的身體健康和生命安全。目前世界各國及相關(guān)國際機(jī)構(gòu)致力于不斷完善食品中的致癌性生物毒素限量和檢測方法,根據(jù)大量的毒理、暴露量等方面的研究工作,將更多的生物毒素納入監(jiān)控范圍內(nèi)。近年來我國食品安全標(biāo)準(zhǔn)體系建設(shè)在“四個(gè)最嚴(yán)”的指導(dǎo)下,經(jīng)過不斷的完善和發(fā)展,已經(jīng)有了長足的進(jìn)展,生物毒素的標(biāo)準(zhǔn)檢測方法采用不同的分析手段,涵蓋了定量分析方法和定性分析方法,部分方法已經(jīng)達(dá)到世界先進(jìn)水平。但生物毒素種類繁多,性質(zhì)差異較大,部分物質(zhì)毒理學(xué)危害尚不明確,相關(guān)法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)尚需進(jìn)一步完善,仍存在部分致癌性生物毒素沒有制定限量以及檢測方法缺失或不足的問題。目前致癌性生物毒素檢測標(biāo)準(zhǔn)多采用免疫親和柱凈化技術(shù)和液相色譜檢測,但由于免疫親和柱專屬性較高,不適用于多種毒素的提取凈化,不利于大樣本量的快速篩查。此外,目前的檢測方法多適用于糧食、食用農(nóng)產(chǎn)品等初始食品種類,存在涵蓋食品種類范圍窄、存在安全隱患的問題,應(yīng)加強(qiáng)對其他食品種類中致癌性生物毒素檢測方法的開發(fā)和研究。近幾年發(fā)展起來的新型樣品富集和凈化技術(shù)如QuEChERS法、快速固相萃取技術(shù)等,以其高選擇性、成本低、操作簡單等優(yōu)勢,已廣泛應(yīng)用于生物毒素的檢驗(yàn)中,此外色譜-質(zhì)譜技術(shù)的普及為生物毒素的檢測提供了更有力的檢測和確證手段。相信在不久的將來,會有更多的基于新技術(shù)、適用于不同食品基質(zhì)的多種毒素標(biāo)準(zhǔn)檢測方法不斷出臺。新的檢測方法的出臺也將進(jìn)一步推進(jìn)致癌性生物毒素法規(guī)和限量標(biāo)準(zhǔn)的完善。