李盛菘, 鄭永超,2, 孟澍臨, 吳驪珠, 鐘近藝,2, 趙沖林,2

核殼型量子點-納米金顆粒組裝體高效檢測神經(jīng)性毒劑模擬劑

李盛菘1, 鄭永超1,2, 孟澍臨3, 吳驪珠3, 鐘近藝1,2, 趙沖林1,2

(1. 中國人民解放軍軍事科學(xué)院 防化研究院, 北京 102205; 2. 國民核生化防護國家重點實驗室, 北京 102205;3. 中國科學(xué)院 理化技術(shù)研究所, 北京 100190)

實驗設(shè)計制備了一種由12層硫化鋅包覆硒化鎘的核殼型量子點(CdSe/12ZnS QDs)和納米金顆粒(Au NPs)自組裝形成的CdSe/12ZnS QDs/Au NPs復(fù)合結(jié)構(gòu), 并將其應(yīng)用于神經(jīng)性毒劑模擬劑氰基磷酸二乙酯(Diethyl Cyanophosphonate, DCNP)的高效檢測。QDs由于與Au NPs存在熒光共振能量轉(zhuǎn)移作用(Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET)而發(fā)生熒光猝滅, 乙酰膽堿酯酶(AChE)水解氯化硫代乙酰膽堿(ATC)生成的硫膽堿能夠?qū)⒘孔狱c取代而使量子點熒光恢復(fù)。當(dāng)QDs與Au NPs的摩爾濃度比為20 : 1時, QDs熒光猝滅效果最佳, AChE濃度為1.0×10–3U/L時, QDs熒光恢復(fù)效果最好。DCNP的存在會抑制AChE的活性, 減少硫膽堿的生成并降低QDs的熒光恢復(fù)效率, 通過對QDs熒光恢復(fù)效率測定能夠檢測DCNP。在最優(yōu)條件下對DCNP的檢測結(jié)果表明, 量子點的熒光恢復(fù)效率與DCNP濃度的對數(shù)在5.0×10–9~5.0×10–4mol/L的范圍內(nèi)存在良好的線性關(guān)系, 檢出限達(dá)5.0×10–9mol/L。

量子點; 納米金顆粒; 神經(jīng)性毒劑模擬劑; 熒光共振能量轉(zhuǎn)移

神經(jīng)性毒劑是一類高毒性有機磷酸酯, 主要包括塔崩(GA)、沙林(GB)、梭曼(GD)和VX[1]。這類毒劑能夠通過呼吸或皮膚接觸進入人體, 抑制乙酰膽堿酯酶的活性, 從而造成神經(jīng)系統(tǒng)的嚴(yán)重?fù)p害[2]。在防化和反恐領(lǐng)域, 研究重點是對神經(jīng)性毒劑建立高效、簡單、快捷的檢測方法。利用神經(jīng)性毒劑對乙酰膽堿酯酶(AChE)的抑制作用, 對其進行光學(xué)檢測的方法由于具有靈敏度高、環(huán)境友好和操作簡單等特點而受到廣泛關(guān)注[3-5]。其中, 納米金顆粒(Au NPs)能夠與其配體通過相互作用形成復(fù)合結(jié)構(gòu), 使其表面電荷相互排斥并均勻分散, 而AChE水解硫代乙酰膽堿(ATC)產(chǎn)生的帶正電硫膽堿能夠取代配體, 使Au NPs表面電位由負(fù)變?yōu)橹行圆?dǎo)致其團聚, 表面等離子吸收紅移, 顏色由酒紅色變?yōu)楹谏玔3]。神經(jīng)性毒劑能夠抑制AChE活性, 進而阻礙配體被取代。通過觀察體系顏色及光譜測定, 可對神經(jīng)性毒劑或模擬劑進行檢測。該方法具有響應(yīng)速度快、裸眼可見和操作簡單等優(yōu)點。

近年來, 半導(dǎo)體量子點(QDs)因具有生物相容性好[6]、合成簡單[7]以及優(yōu)異的光譜性質(zhì)[8]等特點而備受關(guān)注。通過尺寸調(diào)控實現(xiàn)QDs的發(fā)射與Au NPs的吸收重疊, 發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移作用(Fluore-scence Resonance Energy Transfer, FRET), 從而導(dǎo)致QDs的熒光猝滅。AChE水解ATC產(chǎn)生的硫膽堿能夠抑制QDs與Au NPs的FRET作用, 促使熒光恢復(fù)。加入AChE抑制劑能夠減緩硫膽堿的生成, 最終降低熒光恢復(fù)效率?；谏鲜鲈? 利用QDs/Au NPs復(fù)合物檢測有機磷農(nóng)藥等AChE抑制劑的研究被相繼報道[9-11]。相比于有機磷農(nóng)藥, 化學(xué)毒劑毒性更強, 需要更高的檢測靈敏度。因此, Au NPs/QDs 復(fù)合物結(jié)構(gòu)的優(yōu)化尤為重要。已報道的體系大多基于單核量子點, 化學(xué)穩(wěn)定性和發(fā)光量子效率較低。另外, Au NPs與QDs主要通過靜電作用相結(jié)合, 硫膽堿本身所帶的正電荷會干擾兩者的結(jié)合, 降低體系的熒光穩(wěn)定性, 從而影響檢測效果[11]。

相比于單核量子點, 核殼量子點能夠?qū)⒐馍d流子限域在核內(nèi), 從而提高QDs的發(fā)光效率和穩(wěn)定性[12]。此外, 相比于靜電相互作用, 配體介導(dǎo)的納米顆粒組裝體能夠增強QDs與Au NPs相互作用, 進一步提高FRET效率[13]。基于上述考慮, 實驗設(shè)計合成了不同硫化鋅殼層數(shù)(0~18層)的核殼型量子點(CdSe/nZnS)[14], 與AuNPs組裝后, 使用巰基乙胺作為模擬物對量子點的熒光恢復(fù)效果進行了研究,最終選擇熒光恢復(fù)效率最高的12層硫化鋅包覆硒化鎘的核殼量子點(CdSe/12ZnS QDs)與Au NPs的組裝體作為研究對象, 優(yōu)化QDs/AuNPs濃度配比和AChE濃度后, 利用QDs/Au NPs-AChE-ATC體系對神經(jīng)性毒劑模擬劑氰基磷酸二乙酯(Diethyl Cyanophosphonate, DCNP)進行檢測。

1 實驗方法

1.1 材料與儀器

檸檬酸三鈉(分析純, Adamas公司); 四水合氯金酸(HAuCl4×4H2O, 分析純, Aladdin公司); 乙酰膽堿酯酶(AChE, 200 U/g, 北京索萊寶公司); 氯化硫代乙酰膽堿(ATC, 分析純, Sigma-Aldrich公司); 磷酸緩沖液(1×PBS, pH 7.4, 北京雷根公司); 氧化鎘(CdO)、氧化鋅(ZnO)、硒粉、硫粉和氫氧化鈉(NaOH)均來自Aladdin公司, 分析純; 氰基磷酸二乙酯(DCNP)、十八烯(ODE)、十八胺(ODA)、十八烯酸(OA)和3-巰基丙酸(3-MPA)均來自梯希愛(上海)公司, 分析純; 丙酮、正己烷來自北京化工廠, 分析純; QDs、Au NPs粒徑大小和濃度通過紫外可見吸收光譜儀(U-3900, 日本日立公司)測量得到。熒光光譜儀(F-4500, 日本日立公司)測定量子點及體系熒光光譜。

1.2 樣品制備

1.2.1 還原法制備Au NPs

參考文獻(xiàn)[15]將8.22 g HAuCl4×4H2O (0.02 mmol)溶解到20 mL水中, 加熱至沸騰, 加入2.0 mL溶解了22.82 mg檸檬酸三鈉的水溶液, 當(dāng)溶液顏色由黃色變?yōu)榫萍t色, 繼續(xù)回流10 min。自然冷卻, 用23 μm濾膜去掉不溶物, 得到Au NPs溶膠備用。

1.2.2 連續(xù)離子層吸附反應(yīng)法制備核殼型量子點CdSe/12ZnS QDs

參考文獻(xiàn)[14]將56 mg CdO加熱溶解于24 mL ODE和380 μL OA混合溶液中, 溶液澄清后冷卻至160 ℃; 加入1.4 g ODA, 重新加熱至240 ℃。隨后, 快速注入2 mL硒的ODE懸濁液(0.2 mol/L)。反應(yīng)60 s, 冷卻至室溫, 加入丙酮離心, 超聲溶于正己烷中。將ZnO和硫粉在氮氣保護下分別加熱至310和120 ℃溶于ODE, 得到濃度均為0.06 mol/L的前驅(qū)體溶液。將0.5 μmol CdSe量子點加入到2.25 mL ODA和8 mL ODE的混合溶液中, 在惰性氣氛下加熱至210 ℃, 交替注入硫和鋅前驅(qū)體?？焖倮鋮s至室溫, 加入丙酮離心, 超聲溶于正己烷備用。

1.2.3 制備QDs/Au NPs復(fù)合物組裝體

取一定量上述制備的CdSe/12ZnS QDs, 加入少量NaOH固體和3-MPA, 離心, 依次用正己烷、比例為1 : 5的水和丙酮、pH為2.0的HCl水溶液、丙酮超聲清洗, 除去量子點表面的長鏈有機配體。離心取量子點沉淀, 然后加入一定量制備的Au NPs溶膠, 攪拌、超聲30 min, 得到澄清QDs/Au NPs復(fù)合物組裝體水溶液。

1.3 檢測溶液中DCNP

向250 μL水中依次加入100 μL PBS緩沖液、100 μL濃度為10–2U/L的AChE和50 μL不同濃度的DCNP溶液, 25 ℃下孵育20 min。隨后加入10 μL濃度為5 mmol/L的ATC溶液, 25 ℃下孵育20 min。最后再加入500 μL制備的QDs/Au NPs復(fù)合結(jié)構(gòu)溶液。其中, AChE、ATC、CdSe/12ZnS QDs和Au NPs的最終濃度分別為1.0×10–3U/L、0.05 mmol/L、70 mmol/L和3.5 mmol/L, 在400 nm光激發(fā)下測定體系的發(fā)射光譜。

2 結(jié)果與討論

2.1 組裝體的形成及FRET作用機理

圖1為QDs/Au NPs組裝體形成過程示意圖, Au NPs表面的穩(wěn)定劑檸檬酸末端的帶負(fù)電荷的羧基(–COO–)陰離子會與量子點表面裸露的金屬原子(如Zn或Cd)配位(絡(luò)合常數(shù)~106M–1)[16], 形成組裝體。通過調(diào)節(jié)溶液中量子點與納米金顆粒的濃度, 可以輕松地調(diào)控組裝在單個納米金顆粒周圍的量子點數(shù)目。形成組裝體之后, 量子點與納米金顆粒間的距離被拉近, FRET作用顯著增強, 導(dǎo)致量子點發(fā)光猝滅。在QDs/Au NPs組裝體體系中引入AChE和ATC后, 硫膽堿上的巰基(–SH)與量子點表面金屬原子的配位作用(絡(luò)合常數(shù)~109M–1)比羧基更強[17], 破壞組裝體結(jié)構(gòu), 量子點與納米金顆粒分開, 兩者間的FRET作用減弱, 量子點發(fā)光一定程度上恢復(fù), 從而實現(xiàn)目標(biāo)分子的檢測。圖2為CdSe/12ZnS QDs、Au NPs及其復(fù)合物的TEM照片。從圖2(a)中可以看出, Au NPs為表面光滑的球形顆粒, 分散效果較好, 直徑約為13 nm。通過連續(xù)離子層吸附反應(yīng)法得到的QDs呈球形, 分布均一(約3 nm)、分散良好(圖2(b))。QDs和Au NPs混合裝配后, Au NPs較組裝前分散性提高(圖2(c))。HRTEM照片顯示Au NPs表面被QDs緊密包裹, 說明Au NPs與QDs能夠在混合后自發(fā)形成圖1所示的組裝體結(jié)構(gòu)。

2.2 組裝體熒光性能研究

圖 3(a)為Au NPs 的吸收光譜和CdSe/12ZnS QDs的發(fā)射光譜(ex=400 nm), 可以發(fā)現(xiàn), Au NPs的吸收峰在523 nm左右, 而CdSe/12ZnS QDs的發(fā)射峰在540 nm左右, Au NPs的吸收與QDs的發(fā)光在470~680 nm波長范圍內(nèi)明顯重疊, 兩者之間能夠有效發(fā)生FRET作用, 淬滅量子點發(fā)光。圖3(b)為不同體系的熒光發(fā)射光譜, 從圖中可看出, 與Au NPs組裝后, CdSe/12ZnS QDs發(fā)光強度急劇下降。當(dāng)加入AChE和ATC時, 體系熒光強度恢復(fù)至猝滅后強度的近4倍, 比文獻(xiàn)報道結(jié)果提高近一倍[10]。相同條件下, CdSe QDs與Au NPs的復(fù)合結(jié)構(gòu)在加入AChE和ATC后, 熒光強度不增反降(圖3(a)內(nèi)插圖), 這主要是因為硫膽堿上的巰基(–SH)與CdSe QDs配位而形成表面缺陷, 促進光生載流子的非輻射躍遷, 導(dǎo)致熒光猝滅。而對于核殼型CdSe/12ZnS QDs, 寬帶隙ZnS層的引入能夠鈍化并消除缺陷位點, 將載流子限域在核內(nèi), 增強熒光穩(wěn)定性。同時, 硫膽堿的結(jié)合可以促進QDs與Au NPs分離, 降低兩者間的相互作用, 從而抑制熒光共振能量轉(zhuǎn)移, 進一步提高熒光恢復(fù)的程度。結(jié)果表明核殼結(jié)構(gòu)以及組裝體形貌是高靈敏檢測的前提。

圖1 QDs/Au NPs組裝體形成過程示意圖

圖2 (a) Au NPs、(b) QDs和(c)Au NP/QDs復(fù)合物的TEM照片; (d) Au NP/QDs組裝體的HRTEM照片

圖3 (a) Au NPs 的吸收光譜和CdSe/12ZnS QDs的發(fā)射光譜(λex = 400 nm), 內(nèi)插圖為CdSe QDs與Au NPs復(fù)合結(jié)構(gòu)在加入AChE和ATC前(黑線)后(紅線)熒光強度對比; (b)不同體系的發(fā)射光譜, QDs、Au NPs、ATC、AChE和DCNP濃度分別為70 nmol/L、3.5 nmol/L、0.05 mmol/L、1.0×10–3 U/L、5.0×10–6 mol/L

2.3 組裝體中QDs與Au NPs配比的優(yōu)化

圖4(a)為不同CdSe/12ZnS QDs與AuNPs濃度配比下組裝前后的熒光發(fā)射強度對比, 可以看出與Au NPs組裝后, QDs熒光強度急劇下降。圖4(b)為相應(yīng)的猝滅效率, 可用Q/Q0表示, 其中Q和Q0分別是與Au NPs組裝前后QDs的熒光發(fā)射強度。隨著QDs濃度增大,Q/Q0呈現(xiàn)先減小后增大的趨勢, 并在QDs與Au NPs濃度比為20 : 1處出現(xiàn)最小值。這是因為當(dāng)QDs配比較小時, 體系的熒光強度較低, 信噪比差; 當(dāng)QDs與Au NPs濃度比繼續(xù)增大時, QDs不能與Au NPs充分結(jié)合, 溶液中依然有大量游離的QDs, 從而導(dǎo)致Au NPs對量子點的發(fā)光猝滅效率降低。當(dāng)QDs/Au NPs濃度比為20 : 1時, 熒光猝滅效率最高, 可高達(dá)97%, 相比文獻(xiàn)通過靜電作用結(jié)合的復(fù)合結(jié)構(gòu)分別提高7%和17%[10-11], 說明組裝體能夠有效提高熒光共振能量轉(zhuǎn)移的效率。

圖4 (a)不同Au NPs (7 nmol/L)與QDs配比組裝前后熒光對比; (b)不同Au NPs與QDs配比熒光猝滅效率(FQ/FQ0)

2.4 AChE濃度對組裝體熒光恢復(fù)效果的影響

圖5是不同AChE濃度下復(fù)合結(jié)構(gòu)的熒光恢復(fù)情況,I0和I分別為加入AChE和ATC前后體系的熒光強度。如圖所示,I/I0最初隨著AChE的濃度(10–7~10–1U/L)增加而增加, 在10–3U/L時達(dá)到平衡, 此時水解ATC產(chǎn)生的硫膽堿恰好使QDs的熒光恢復(fù)達(dá)到最佳效果。若AChE濃度較低, 體系熒光強度變化范圍窄, 檢測的靈敏度低; 若AChE濃度太高, 則起抑制作用的DCNP濃度也需要增大, 導(dǎo)致檢測限升高。因此, 在25 ℃、pH 7.4、Au NPs濃度為3.5 nmol/L且CdSe/12ZnS QDs與Au NPs濃度比為20 : 1的條件下, 體系中AChE的最佳濃度為1.0×10–3U/L。

圖5 不同AChE濃度下體系的熒光恢復(fù)效果

2.5 QDs/Au NPs-AChE-ATC體系檢測DCNP

在上述最優(yōu)條件下, 測試體系對神經(jīng)毒劑模擬劑DCNP的檢測性能。圖6(a)是QDs/Au NPs-AChE- ATC體系在不同DCNP濃度下的熒光光譜圖。圖6(b)為DCNP濃度與R/R0的關(guān)系圖,R0和R分別為CdSe/12ZnS QDs/Au NPs-AChE-ATC體系加入DCNP前后的熒光強度。從圖6(a)中可以明顯發(fā)現(xiàn), 隨著DCNP濃度的增大(5.0×10–9~5.0×10–4mol/L), 體系的熒光強度逐漸減弱, 恢復(fù)效率降低。從圖6(b) 的內(nèi)插圖可以看出,R/R0與DCNP濃度的對數(shù)呈現(xiàn)良好的線性相關(guān), 相關(guān)系數(shù)(2)為 0.994, 檢測限達(dá)5.0×10–9mol/L。

圖6 (a)不同DCNP濃度下(5.0×10–9~5.0×10–4 mol/L)體系熒光發(fā)射光譜(λex=400 nm), 內(nèi)插圖為相應(yīng)的溶液照片; (b)不同DCNP濃度下的體系FR/FR0值, 內(nèi)插圖為FR/FR0與DCNP濃度對數(shù)的線性關(guān)系

圖7 不同干擾物對體系檢測DCNP的影響, 其中DCNP和干擾物濃度均為5×10–4 mol/L

此外, 硫膽堿取代表面量子點與Au NPs結(jié)合后, 會改變Au NPs表面的電位正負(fù)性, 并導(dǎo)致其聚集, 從而引起表面等離子共振吸收紅移[18]。在實驗過程中, 當(dāng)引入不同濃度的DCNP時, 隨著其濃度升高, 硫膽堿生成速率減慢, Au NPs聚集程度也逐漸降低, 體系顏色也隨之發(fā)生相應(yīng)的變化。如圖6(a)內(nèi)插圖所示, 隨著DCNP濃度的增加, 體系顏色黑色變淺, 酒紅色加深。這一現(xiàn)象說明該體系有望實現(xiàn)對DCNP的比色–熒光雙通道識別。

2.6 干擾物對DCNP檢測性能的影響

為了檢驗復(fù)合物體系在實際應(yīng)用中對DCNP的檢測能力, 分別研究了環(huán)境中常見干擾物KCl、CaCl2、ZnCl2、AlCl3和FeCl2等對DCNP檢測效果的影響, 圖7為不同干擾物下含有和不含DCNP的體系熒光恢復(fù)情況, 其中,R為各干擾物(含空白)加入DCNP前后體系的熒光強度,0均為空白條件下加入DCNP前的體系熒光強度。結(jié)果顯示, 在兩種情況下, 相對于無干擾物, 添加不同的干擾物熒光恢復(fù)效率無顯著變化, 表明以上常見干擾物對FRET過程和DCNP的檢測無明顯影響, 體系具有較好的抗干擾性和在實際應(yīng)用中檢測DCNP的能力。

3 結(jié)論

研究利用Au NPs表面配體末端羧基與量子點裸露金屬原子的配位成功制備了核殼型量子點CdSe/12ZnS QDs/Au NPs組裝體, 并利用DCNP對AChE的抑制作用對DCNP進行高效檢測。光譜分析表明QDs與Au NPs能夠發(fā)生有效的FRET作用, 量子點的核殼結(jié)構(gòu)將載流子限域在核內(nèi), 增強熒光穩(wěn)定性, 提高熒光恢復(fù)倍率; 配位作用能夠拉近量子點與納米金顆粒之間距離, 顯著提高FRET熒光猝滅效率?；诮M裝體的上述優(yōu)勢, 通過條件優(yōu)化, 測定不同DCNP濃度下體系的熒光恢復(fù)強度, 將其應(yīng)用于DCNP的檢測。加入DCNP后量子點的熒光恢復(fù)效率R/R0與DCNP濃度的對數(shù)在5.0×10–9~ 5.0×10–4mol/L的濃度范圍內(nèi)存在良好的線性相關(guān), 檢測限達(dá)5.0×10–9mol/L。此外, 檢測過程中不同DCNP濃度下金顆粒聚集程度不同, 溶液顏色表現(xiàn)出黑色到酒紅色的差異, 也為DCNP的裸眼可見檢測提供了可能。

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Core/Shell Quantum Dots and Au Nanoparticles Assembly for Effective Detection of Nerve Agent Mimic

LI Sheng-Song1, ZHENG Yong-Chao1,2, MENG Shu-Lin3, WU Li-Zhu3, ZHONG Jin- Yi1,2, ZHAO Chong-Lin1,2

(1. Research Institute of Chemical Defense, Academy of Military Science, Beijing 102205, China; 2. State Key Laboratory of NBC Protection for Civilian, Beijing 102205, China; 3. Technical Institute of Physics and Chemistry, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100190, China)

A novel assembly of CdSe/12ZnS core/shell quantum dots (CdSe/12ZnS QDs) and gold nanoparticles (Au NPs) was constructed for highly sensitive detection of nerve agent mimicdiethyl cyanophosphonate (DCNP). Due to fluorescence resonance energy transfer (FRET) from CdSe/12ZnS QDs to Au NPs, the emission intensity of QDs was quenched. Thiocholine generatedfrom acetylcholinesterase (AChE) and acetylthiocholine (ATC) would destroy the assembly structure to recover the emission of QDs. However, diethyl cyanophosphonate (DCNP) could inhibit the activity of AChE, thus leading to the suppressed fluorescence recovery. Therefore, the detection of DCNP was achieved by evaluating fluorescence recovery efficiency of QDs. Optimally, a linear relationship between fluores-cence recovery efficiency of QDs and logarithmic concentration of DCNP was observed in a range of 5.0×10–9mol/L to 5.0×10–4mol/L. As a result, the limit of detection (LOD) was deternimed to be as low as 5.0×10–9mol/L.

quantum dots; gold nanoparticles; nerve agents mimic; fluorescence resonance energy transfer

TN304

A

1000-324X(2019)08-0893-06

10.15541/jim20180486

2018-10-15;

2018-12-16

國家自然科學(xué)基金(21603248) National Natural Science Foundation of China (21603248)

李盛菘(1994–)，男，碩士研究生. E-mail: dotasongge@163.com

趙沖林，副研究員. E-mail: Zhaochonglin@126.com