劉佳文 呂紅艷 丁北川 張治國(guó)

非結(jié)核分枝桿菌(NTM)，也曾稱為非典型分枝桿菌，是指除結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(Mycobacteriumtuberculosiscomplex， MTC)和麻風(fēng)分枝桿菌以外的分枝桿菌。現(xiàn)有的文獻(xiàn)提示我國(guó)分離最多的NTM菌種為胞內(nèi)分枝桿菌，在北方可達(dá)40%～60%[1]。近年來(lái)，隨認(rèn)識(shí)的提高和檢查手段的提高，出現(xiàn)一些不常見的NTM菌種。四川省自貢市在國(guó)內(nèi)首次報(bào)道外來(lái)分枝桿菌和奧巴涅分枝桿菌[2]。為探討NTM分子菌種鑒定方法臨床檢查的應(yīng)用意義,本研究對(duì)129株 NTM 臨床分離株的菌種鑒定結(jié)果進(jìn)行分析。

資料和方法

一、一般資料

NTM臨床分離株來(lái)源于2014年北京老年醫(yī)院(23株)、北京結(jié)核病控制研究所中心實(shí)驗(yàn)室(69株)、北京市昌平區(qū)結(jié)核病防治所(37株)，共計(jì)129株。

二、試劑及方法

采用芯片雜交法(中國(guó)江蘇獵陣生物科技有限公司)和16S rRNA基因測(cè)序法鑒定分枝桿菌(北京六合華大基因科技有限公司)，2種方法實(shí)驗(yàn)操作者之間采用雙盲法。芯片雜交法嚴(yán)格按廠家說(shuō)明書進(jìn)行操作。16S rRNA基因測(cè)序法來(lái)自文獻(xiàn)[3]。

(一)芯片雜交法鑒定分枝桿菌

1.主要儀器及試劑：分枝桿菌菌種鑒定試劑盒(膜芯片法)(江蘇獵陣生物科技有限公司)，ETC811基因擴(kuò)增儀，多孔板恒溫振蕩儀(型號(hào)：MB100-4A)。

2.分枝桿菌分離株DNA的提?。?1)取相應(yīng)數(shù)量的1.5 ml的提取管標(biāo)記。(2)向每個(gè)提取管中加入200 μl的“解液A”。(3)用Tip頭挑取少量培養(yǎng)的菌落，放到加了“解液A”的提取管中,蓋上蓋。(4)將提取管在超級(jí)恒溫混勻儀中進(jìn)行金屬浴10 min(恒溫混勻儀參數(shù)設(shè)置：振蕩強(qiáng)度1600 r/min,溫度95 ℃)。(5)金屬浴后，12 800×g離心3 min,上清液即可作為擴(kuò)增模板進(jìn)行擴(kuò)增。

3. PCR擴(kuò)增：PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系，17 μl擴(kuò)增反應(yīng)液，3 μl模板DNA，PCR擴(kuò)增程序：50 ℃ 2 min；94 ℃ 4 min；采用94 ℃ 30 s，53 ℃ 45 s，72 ℃ 20 s進(jìn)行35個(gè)循環(huán)后；再進(jìn)行94 ℃ 30 s，68 ℃ 45 s，72 ℃ 20 s，20個(gè)循環(huán)；保持4 ℃。完成擴(kuò)增反應(yīng)后，PCR產(chǎn)物可立即檢測(cè)；如不立即檢測(cè)則置于-18 ℃及以下保存，并在1周內(nèi)完成檢測(cè)。

4. 芯片雜交：(1)提前20 min打開恒溫振蕩儀，溫度設(shè)置在45 ℃。(2)拿出對(duì)應(yīng)樣本數(shù)量的晶格，分別進(jìn)行編號(hào)。(3) 每份樣本應(yīng)將600 μl 分枝桿菌菌種鑒定(MY)反應(yīng)液1和待檢樣本的20 μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物加入反應(yīng)槽中。(4)將晶格轉(zhuǎn)入恒溫振蕩儀，振蕩強(qiáng)度1500 r/min，振動(dòng)10 min。(5)反應(yīng)結(jié)束后將晶格取出，開蓋，將晶格略傾斜，吸凈每個(gè)反應(yīng)槽內(nèi)的液體。(6)向每個(gè)反應(yīng)槽內(nèi)分別加入1 ml MY反應(yīng)液1, 振蕩強(qiáng)度1500 r/min，振動(dòng)2 min。(7)反應(yīng)結(jié)束后將晶格取出，開蓋，將晶格略傾斜，吸凈每個(gè)反應(yīng)槽內(nèi)的液體。(8)根據(jù)檢測(cè)數(shù)量，先預(yù)混合反應(yīng)液1和反應(yīng)液2至15 ml準(zhǔn)備管中，反應(yīng)液1每人份用量為600 μl，反應(yīng)液2每人份用量為1 μl。(9)向每個(gè)反應(yīng)槽內(nèi)分別加入600 μl MY反應(yīng)液1和MY反應(yīng)液2預(yù)混合液, 振蕩強(qiáng)度1500 r/min，振動(dòng)3 min。(10)反應(yīng)結(jié)束后將晶格取出，開蓋，將晶格略傾斜，吸凈每個(gè)反應(yīng)槽內(nèi)的液體。(11)向每個(gè)反應(yīng)槽內(nèi)分別加入2 ml的MY 緩沖液，蓋上蓋，置于恒溫振蕩儀，振蕩強(qiáng)度1500 r/min，2 min。(12)重復(fù)“(10)、(11)”一次。(13)開蓋，將晶格略傾斜，徹底吸凈每個(gè)反應(yīng)槽內(nèi)的液體。(14)向每個(gè)反應(yīng)槽內(nèi)加入500 μl的MY反應(yīng)液3，保證充分浸沒(méi)MY獵陣芯片，通過(guò)恒溫振蕩儀振蕩，強(qiáng)度1500 r/min，反應(yīng)3 min。(15)每個(gè)反應(yīng)槽內(nèi)加入自來(lái)水，輕輕晃動(dòng)晶格5 s，終止反應(yīng)。直接在水中觀察每個(gè)MY獵陣芯片上的反應(yīng)結(jié)果。DNA的提取、PCR擴(kuò)增、芯片雜交及顯色操作參照試劑盒說(shuō)明書。

(二)16S rRNA基因測(cè)序鑒定分枝桿菌

1.分枝桿菌分離株DNA的提?。?1)取80 μl無(wú)菌水置于1.5 μl EP管中，挑取生長(zhǎng)良好的菌落4～5個(gè)(盡量不要取到培養(yǎng)基)于管中。(2)于100 ℃水中煮20 min，然后立即置于冰上10 min。13 000×g離心2 min。(3)取上清于新的1.5 μl EP管中，以此作為PCR擴(kuò)增的DNA模板，存于-20 ℃。

2. 試劑：2包TaKaRa的Taq酶(大連TaKaRa公司)；兩對(duì)引物，上下游引物各2管，每管50 μl；6×載樣緩沖液。

3.主要儀器：BIO-RAD My Cycler PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)伯樂(lè)公司)。

4.引物: 引物NT1.1F(GAGATACTCGAGTGGCGAAC)，NT1.1R(GGCCGGCTACCCGTC-GTC)可擴(kuò)增所有分枝桿菌16S rDNA基因，產(chǎn)生212 bp的目的片段；引物NT-3F(CACATGCAAGTCGAACGGAAAGG)，NT-3R(GCCCGTATCGCCCGCACGCT)擴(kuò)增可得到500～700 bp的目的片段，擴(kuò)增產(chǎn)物用于16S rRNA基因測(cè)序[3]。

5. PCR擴(kuò)增：PCR擴(kuò)增體系中，滅菌蒸餾水33.5 μl，TaKaRa Taq(5 U/μl)0.5 μl，10×PCR Buffer (Mg2+free) 5 μl，dNTP mixture(為dATP、dCTP、dGTP和dTTP的混合溶液)各2.5 mmol 4 μl，25 mmol MgCl23 μl，上游引物1 μl，下游引物1 μl，模板2 μl。擴(kuò)增條件：預(yù)變性94 ℃ 5 min，然后94 ℃ 1 min，64 ℃ 1 min，72 ℃ 40 s，34個(gè)循環(huán)后，72 ℃延伸5 min，保持4 ℃。

6. 瓊脂糖凝膠電泳：擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠電泳，M2000的DNA Marker 5 μl，PCR產(chǎn)物7 μl，6×載樣緩沖液2 μl。

7. 16S rRNA基因測(cè)序：擴(kuò)增產(chǎn)物送華大基因公司測(cè)序,送測(cè)序除PCR產(chǎn)物還送測(cè)序引物。測(cè)序引物既可送上游也可送下游引物。送“NT-3F”方向填 “正向”；送“NT-3R”方向填“反向”。測(cè)序樣本送30 μl。

8. 序列比對(duì)：使用的是北京胸科醫(yī)院國(guó)家結(jié)核病臨床實(shí)驗(yàn)室開發(fā)的分枝桿菌菌種鑒定DNA序列比對(duì)系統(tǒng)，序列比對(duì)網(wǎng)址：http://111.207.168.134/NLC，以未知序列與標(biāo)準(zhǔn)序列比對(duì)結(jié)果中最高得分值的比對(duì)結(jié)果為判定對(duì)象，16S rDNA相似度≥99.0%，標(biāo)準(zhǔn)序列對(duì)應(yīng)的細(xì)菌名稱即為未知序列的細(xì)菌名稱。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 17.0軟件對(duì)NTM臨床分離株不同菌種在3家機(jī)構(gòu)中的分布數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)、分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

已知7株結(jié)核分枝桿菌和1株瘰疬分枝桿菌作為質(zhì)控株，隨樣本一起隨機(jī)編號(hào)進(jìn)行16S rRNA基因測(cè)序和芯片雜交法全程操作，2種方法中8株質(zhì)控株檢測(cè)結(jié)果與目標(biāo)結(jié)果相符。

129株NTM臨床分離菌株中，有107株進(jìn)行分枝桿菌16S rRNA基因PCR擴(kuò)增(NT1.1F，NT1.1R)陽(yáng)性，并完成了16S rRNA基因測(cè)序(NT-3F，NT-3R)，其中59株為胞內(nèi)分枝桿菌(55.1%)；29株為堪薩斯分枝桿菌(27.1%)；5株為龜分枝桿菌/膿腫分枝桿菌(4.7%)；3株為鳥分枝桿菌(2.8%)；2株為偶發(fā)分枝桿菌；2株為戈登分枝桿菌(1.9%)。129株NTM菌株中，有116株進(jìn)行芯片雜交法鑒定分枝桿菌。結(jié)果見表1。

129株NTM菌株中，有96株同時(shí)進(jìn)行芯片雜交法和16S rRNA基因測(cè)序鑒定分枝桿菌。2種方法的符合率為88.5%(85/96)，結(jié)果見表1。

表1 不同菌種分別在芯片雜交和16S rRNA基因測(cè)序進(jìn)行菌種鑒定時(shí)的結(jié)果分析

注表中“其他NTM”為母牛分枝桿菌、明尼蘇達(dá)分枝桿菌、熊本分枝桿菌、提門分枝桿菌(M.temen)

11株NTM菌株采用芯片雜交法與16S rRNA基因測(cè)序的檢測(cè)結(jié)果不相符(表2)。16S rRNA基因測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)有3株外來(lái)菌株，分別為明尼蘇達(dá)分枝桿菌、熊本分枝桿菌、提門分枝桿菌(M.temen)。

表2 芯片雜交法和16S rRNA基因測(cè)序檢測(cè)結(jié)果

3家機(jī)構(gòu)NTM臨床分離株主要以胞內(nèi)分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌和龜分枝桿菌/膿腫分枝桿菌為主。除龜分枝桿菌/膿腫分枝桿菌外(χ2=12.867，P<0.05),其他種類分枝桿菌在3家機(jī)構(gòu)臨床分離菌株中的構(gòu)成比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表3)。

討 論

北京老年醫(yī)院為北京市海淀區(qū)結(jié)核病診療委托醫(yī)院，每年患者標(biāo)本中都能分離出NTM，但是由于條件限制，未及時(shí)準(zhǔn)確地進(jìn)行NTM菌種鑒定。沒(méi)有實(shí)驗(yàn)室及時(shí)準(zhǔn)確的NTM菌種鑒定，臨床不能做及時(shí)準(zhǔn)確的診斷，只能采用經(jīng)驗(yàn)用藥，療效往往欠佳[4]。分離出來(lái)的NTM菌株是哪種NTM,是否是致病菌，該怎樣用藥，臨床需要實(shí)驗(yàn)室的NTM數(shù)據(jù)來(lái)分析回答這些問(wèn)題[1]。

用2種分子生物學(xué)方法進(jìn)行NTM菌種鑒定，已有文獻(xiàn)報(bào)道[5-8]；還有采用MALDI-TOF MS(基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜)結(jié)合DNA測(cè)序方法進(jìn)行菌種鑒定的報(bào)道[9-10]。首先NTM鑒定需要快，本研究采用的芯片法全流程只需要4 h，也有報(bào)道需要6 h[5]。芯片法雖然鑒別能力較直接的基因序列分析弱，但簡(jiǎn)化了操作，并且具備鑒定臨床常見NTM的能力，能夠解決臨床大部分問(wèn)題[1]。本研究中96株同時(shí)進(jìn)行芯片雜交法和16S rRNA基因測(cè)序法鑒定分枝桿菌，兩種方法的符合率為88.5%(85/96)。用芯片雜交法解決了基因測(cè)序法88.5%的問(wèn)題。關(guān)于芯片雜交法與16S rRNA基因測(cè)序法鑒定分枝桿菌的符合率有不同報(bào)道，有83.6%[11]、94.59%[6]和95.4%[5]等，大部分符合率相當(dāng)高。這是選芯片雜交法用于初篩的理由。

表3 非結(jié)核分枝桿菌臨床分離株不同菌種在3家機(jī)構(gòu)中的分布

注表中“其他NTM”為母牛分枝桿菌、明尼蘇達(dá)分枝桿菌、熊本分枝桿菌、提門分枝桿菌

其次，NTM鑒定需要準(zhǔn)確，通過(guò)分析同源DNA序列組成差異可鑒定細(xì)菌至“種”的水平，是目前菌種鑒定的“金標(biāo)準(zhǔn)”[1]。因此，本研究在用芯片雜交法初篩后，選用16S rRNA基因測(cè)序法來(lái)確認(rèn)。選用的16S rRNA基因鑒別能力雖然相對(duì)較低，但由于目前其相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)最為完整，是推薦常規(guī)使用的方法[1]。這樣用兩種方法進(jìn)行NTM菌種鑒定得到的數(shù)據(jù)既有臨床價(jià)值，也有流行病學(xué)科研意義[12]。

在分枝桿菌菌種鑒定過(guò)程中，質(zhì)量控制至關(guān)重要[13]。用已知菌株來(lái)對(duì)測(cè)序和結(jié)果分析進(jìn)行質(zhì)量控制，以此來(lái)保證結(jié)果的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。

本研究基因測(cè)序和芯片雜交兩種方法實(shí)驗(yàn)操作者之間采用雙盲，最后由1名工作人員來(lái)揭盲，將每個(gè)標(biāo)本鑒定結(jié)果和標(biāo)本來(lái)源單位一一對(duì)應(yīng)。盲法最大限度地減少了個(gè)人主觀判斷對(duì)結(jié)果的影響[14]。

結(jié)果表明，3個(gè)單位的菌株，以肺部NTM 感染最常見的菌種(胞內(nèi)分枝桿菌、膿腫分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌)為主，超過(guò)80%。除龜分枝桿菌/膿腫分枝桿菌外,其他種類分枝桿菌在3家單位的構(gòu)成比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說(shuō)明在北京這3家機(jī)構(gòu)分枝桿菌感染譜是相似的，可以合并來(lái)進(jìn)行分析。合并3家菌株用測(cè)序進(jìn)行分析，胞內(nèi)分枝桿菌占55.1%，堪薩斯分枝桿菌占27.1%，龜分枝桿菌/膿腫分枝桿菌占4.7%，鳥分枝桿菌占2.8%，偶發(fā)分枝桿菌和戈登分枝桿菌均占1.9%,和蘇州地區(qū)報(bào)道的結(jié)果相似[15]。云南以鳥分枝桿菌為主[16]。胞內(nèi)分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、龜分枝桿菌/膿腫分枝桿菌用芯片雜交法和測(cè)序法之間的符合率為92.5%、92.3%、100.0%。芯片雜交法完全可以滿足初篩的需求[6-7, 11]。

綜上所述，先用芯片雜交法進(jìn)行快速診斷，然后結(jié)合臨床和測(cè)序法的結(jié)果確定診斷，如此的工作流程具有臨床實(shí)用性。

張潔等[17]報(bào)道北京地區(qū)NTM菌種多達(dá)13種，可見新金色分枝桿菌及熊本分枝桿菌，本研究中北京結(jié)核病控制研究所中心實(shí)驗(yàn)室送來(lái)的菌株中基因測(cè)序鑒定出3株外來(lái)菌株，分別為明尼蘇達(dá)分枝桿菌、熊本分枝桿菌、提門分枝桿菌。光產(chǎn)色菌“明尼蘇達(dá)分枝桿菌”主要來(lái)自周圍環(huán)境[18]；熊本分枝桿菌是不產(chǎn)色慢生長(zhǎng)菌，可從有肺部感染的潛伏性結(jié)核感染者中分離到[17, 19]；提門分枝桿菌有報(bào)道能從HIV感染者身上分離到[20-21]。芯片雜交只能分析常見的15種菌，對(duì)這3種菌的鑒定都出現(xiàn)了錯(cuò)誤。只有基因測(cè)序才能及時(shí)發(fā)現(xiàn),有利于及時(shí)分析外來(lái)菌株和評(píng)估外來(lái)菌株的生物安全風(fēng)險(xiǎn)，以便及時(shí)采取措施應(yīng)對(duì)外來(lái)菌種的侵害。

本研究中由于條件所限，如3家單位之間，以及單位內(nèi)部存在的信息孤島，臨床信息缺乏，即使發(fā)現(xiàn)有意義的菌種如提門分枝桿菌，也沒(méi)法進(jìn)行深入的研究。因此，加強(qiáng)與臨床的溝通與信息的互聯(lián)互通，是接下來(lái)要做的工作。