趙瑞鵬 李志強(qiáng) 顧曉東 韓鵬飛 李鵬翠 李春江 王小虎 段王平 衛(wèi)小春**

（1.山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院骨科，太原 030001；2.呂梁市人民醫(yī)院骨科，山西呂梁 033000）

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis,OA）是一種以關(guān)節(jié)軟骨慢性退變和繼發(fā)關(guān)節(jié)軟骨骨化為主要病理變化，關(guān)節(jié)間隙漸進(jìn)性狹窄、骨贅形成及關(guān)節(jié)脹痛、活動功能障礙為主要臨床表現(xiàn)的疾病[1,2]。隨著社會快速發(fā)展，車禍、建筑摔傷、體育競技等高能量外傷事故不斷增多，臨床上半月板損傷、交叉韌帶撕裂、髕骨骨折以及隨之而來的OA患者也逐漸增多。調(diào)查表明，至2020年OA可能成為全球第四大致殘疾病，給個人及國家?guī)沓林氐呢?fù)擔(dān)[3,4]。

膝關(guān)節(jié)是由股骨遠(yuǎn)端、脛骨近端、髕骨內(nèi)側(cè)關(guān)節(jié)面及周圍韌帶、肌肉包裹構(gòu)成的作用關(guān)鍵、功能復(fù)雜的承重關(guān)節(jié)，同時也是OA重要的病變部位[5,6]。傳統(tǒng)OA動物模型制備手術(shù)主要包括前交叉韌帶切斷術(shù)（anterior cruciate ligament transection,ACLT）、前交叉韌帶重建術(shù)（anterior cruciate ligament reconstruction,ACLR）、半月板失穩(wěn)術(shù)（destabilization of the medial meniscus,DMM）、髕骨脫位術(shù)（patella dislocation）等，制備的脛骨內(nèi)側(cè)平臺、股骨內(nèi)側(cè)髁、髕骨關(guān)節(jié)等單一間室OA模型都不能很好地模擬臨床發(fā)病率較高的多間室OA病變特征[7-9]。由此，本課題組采用巴馬小型豬建立ACLR聯(lián)合髕骨脫位術(shù)制備多間室OA模型。豬的生理特征、體液生化指標(biāo)、骨質(zhì)結(jié)構(gòu)更加接近人類。與鼠、兔、羊相比，豬軟骨組織中的膠原纖維排列更接近人軟骨。同時，由于圈養(yǎng)豬體格較大、攝食較多，不方便管理和手術(shù)操作。本課題組采用心血管、消化、泌尿、皮膚、口腔等學(xué)科常用的巴馬小型豬制備多間室OA模型[10,11]。此外，步態(tài)分析研究已廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，尤其在神經(jīng)系統(tǒng)疾病[12]。

本實(shí)驗(yàn)利用巴馬小型豬，建立ACLR聯(lián)合髕骨脫位術(shù)制備多間室OA病變模型，通過步態(tài)分析儀收集步態(tài)數(shù)據(jù)，旨在評估髕骨脫位狀態(tài)下多間室OA的步態(tài)特征，揭示多間室0A病變的影響因素，幫助OA 患者早期臨床診斷、治療及康復(fù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

18月齡健康雌性巴馬小型豬6只，體重（41.6±3.5）kg，購于北京市實(shí)創(chuàng)世紀(jì)小型豬養(yǎng)殖基地[許可證號SCXX(jing)2013-0008]。飼養(yǎng)于中國輻射防護(hù)研究院[許可證號SYXK(Jin)2016-0002]。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

舒泰50（virbac S.A），前交叉韌帶重建導(dǎo)向器（Arthrex，Inc.），軟骨環(huán)鉆（MOC Medizinische Gerate Gmbh，?8 mm），超聲脫鈣儀（VCare）步態(tài)分析儀器：Tekscan walkway.v.7.6x（Tekscan，Inc.307 West First Street，South Boston，MA 02127）。

1.3 動物模型的制備

實(shí)驗(yàn)動物術(shù)前12 h禁食，稱體重，舒泰50肌內(nèi)注射麻妥（1 ml/15 kg），左側(cè)臥位，右后肢（right hind,RH）膝關(guān)節(jié)剃毛備皮，碘伏消毒，鋪巾。

手術(shù)造模過程如圖1所示。取右后肢髕骨外側(cè)切口，以髕骨外緣2 cm為中心縱向切“S”形切口，長約8 cm，逐層切開膝關(guān)節(jié)外側(cè)支持帶和部分股四頭肌，切開關(guān)節(jié)囊，向內(nèi)側(cè)推開髕骨使其內(nèi)脫位，顯露膝關(guān)節(jié)前交叉韌帶。前交叉韌帶重建導(dǎo)向器鉤住韌帶股骨止點(diǎn)端與縱軸線成45°，插入克氏針套筒固定?？招你@（內(nèi)徑0.8 cm）以克氏針套筒為圓心從股骨外側(cè)髁外面鉆向前交叉韌帶附著處，鉆透前（深約1.8 cm）停止空心鉆，防止韌帶從股骨止點(diǎn)處斷裂?？耸厢槪ㄖ睆? mm）沿著孔道外圍不斷穿透，保證空心鉆鉆取得到的骨柱帶著前交叉韌帶完整分離。穿透后，向關(guān)節(jié)腔內(nèi)推出骨柱檢查前交叉韌帶完整附著于骨柱，附著前交叉韌帶的骨柱沿空心鉆骨道回退，恢復(fù)原位，2根克氏針（直徑1.5 mm）從股骨外側(cè)髁外面（空心鉆鉆口處）斜穿交叉固定骨柱徹底沖洗傷口，髕骨內(nèi)脫位狀態(tài)下部分縫合外側(cè)關(guān)節(jié)囊，手法屈伸膝關(guān)節(jié)觀察髕骨運(yùn)動軌跡并保證髕骨不能復(fù)位于股骨滑車溝內(nèi)，關(guān)節(jié)囊外層逐層縫合。術(shù)后行X線檢查，確保模型制備成功（圖2）。左后肢（left hind,LH）不做任何處理作為正常對照。

1.4 步態(tài)數(shù)據(jù)的采集

為了排除動物個體行走、學(xué)習(xí)技能之間的差異。所有實(shí)驗(yàn)動物術(shù)前10 d開始步態(tài)訓(xùn)練，全程勻速、正常步態(tài)通過步態(tài)分析儀記錄1 次（圖3），每只動物每天成功記錄5次，連續(xù)訓(xùn)練10 d。術(shù)前（圖4），術(shù)后7、15、30、45、60、75、90 d 采集實(shí)驗(yàn)動物步態(tài)數(shù)據(jù)，具體包括：體重（body weigth,BW）、后肢負(fù)重（%BW）、后肢觸地面積（cm2）、后肢觸地沖量（%BW·s）、后肢足底局部最大壓力（%BW）、后肢擺動相時間（s）、后肢支撐相時間（s）。為減小誤差，排除個體差異，負(fù)重指標(biāo)采用自身BW%表示。每個時間點(diǎn)記錄5次。

1.5 病理觀察

術(shù)后3 個月安樂處死所有動物，髖關(guān)節(jié)離斷，獲取LH 和RH。打開膝關(guān)節(jié)囊，應(yīng)用環(huán)鉆在股骨滑車處鉆取骨柱。骨柱在4%多聚甲醛固定48 h 后，超聲脫鈣儀中浸泡脫鈣10周。骨柱依次脫水、浸蠟、切片（6 μm），番紅“O”染色，光鏡下觀察。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

圖1 手術(shù)造模過程

圖2 造模后RH正位（A）、側(cè)位（B）X線檢查顯示髕骨處于內(nèi)脫位狀態(tài)

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)動物步態(tài)數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析均符合偏態(tài)分布，采用M（QR）表示。采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)法比較實(shí)驗(yàn)動物RH與LH步態(tài)數(shù)據(jù)差異。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

所有實(shí)驗(yàn)動物無麻醉意外，術(shù)后6 h內(nèi)實(shí)驗(yàn)動物清醒，無感染與死亡，切口愈合良好。

2.2 后肢負(fù)重結(jié)果

圖3 巴馬小型豬邁步模式圖

自然狀態(tài)下實(shí)驗(yàn)動物RH 與LH 負(fù)重基本相等，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。術(shù)后RH 負(fù)重明顯降低，LH 負(fù)重有所增加。術(shù)后60 d，RH負(fù)重恢復(fù)到最高水平，但與LH比較差異仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。術(shù)后各時間點(diǎn)RH負(fù)重均低于LH，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1）。

2.3 后肢觸地面積結(jié)果

自然狀態(tài)下實(shí)驗(yàn)動物RH與LH觸地面積基本相等，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。術(shù)后RH 觸地面積明顯減小，LH觸地面積有所增加。術(shù)后45、60 d，RH觸地面積恢復(fù)到最高水平，但與LH比較差異仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。術(shù)后各時間點(diǎn)RH 觸地面積均小于LH，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表2）。

圖4 術(shù)前應(yīng)用Tekscan walkway步態(tài)分析儀采集步態(tài)原始圖

2.4 后肢觸地沖量結(jié)果

自然狀態(tài)下實(shí)驗(yàn)動物RH與LH觸地沖量大小基本相等，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。術(shù)后RH觸地沖量明顯減小，LH觸地沖量有所增加。術(shù)后60 d，RH觸地沖量恢復(fù)到最高水平，但與LH比較差異仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。術(shù)后各時間點(diǎn)RH觸地沖量均小于LH，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表3）。

2.5 后肢足底局部最大壓力結(jié)果

自然狀態(tài)下實(shí)驗(yàn)動物RH與LH足底局部最大壓力基本相等，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。術(shù)后7、15、30、45 d RH足底局部最大壓力明顯降低，LH足底局部最大壓力有所升高，兩者比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。術(shù)后60 d，RH足底局部最大壓力恢復(fù)到最高水平，與LH比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但在術(shù)后75、90 d，RH足底局部最大壓力均低于LH，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表4）。

2.6 后肢擺動相時間結(jié)果

自然狀態(tài)下實(shí)驗(yàn)動物RH與LH擺動相時間基本相等，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。術(shù)后7、15、30 d RH 擺動相時間明顯延長，LH擺動相時間基本保持不變，兩者比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。術(shù)后45、60 d RH擺動相時間逐漸恢復(fù)到自然狀態(tài)水平，與LH比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但在術(shù)后75、90 d，RH擺動相時間均長于LH，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表5）。

2.7 后肢支撐相時間結(jié)果

自然狀態(tài)下實(shí)驗(yàn)動物RH與LH支撐相時間基本相等，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。術(shù)后7、15、30、45 d RH支撐相時間明顯縮短，LH支撐相時間有所增加，兩者比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。術(shù)后60、75 d RH支撐相時間逐漸恢復(fù)到自然狀態(tài)水平，與LH比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但在術(shù)后90d，RH支撐相時間短于LH，且差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表6）。

2.8 病理觀察結(jié)果

番紅“O”染色顯示，LH軟骨表面完整，蛋白多糖含量豐富，軟骨細(xì)胞數(shù)量、形態(tài)正常，纖維化不明顯。相反，RH軟骨表面破壞明顯，裂痕較深，蛋白多糖含量明顯下降，軟骨細(xì)胞數(shù)量顯著增多、形態(tài)各異，纖維化明顯（圖5）。

3 討論

OA是一種病因復(fù)雜、病理變化緩慢，多種生物力學(xué)和生物化學(xué)因素綜合作用導(dǎo)致的一種關(guān)節(jié)軟骨慢性退變性疾病,具體發(fā)病機(jī)制仍不明確[13]。目前研究較為明確的是炎癥因素在OA發(fā)病過程中較為關(guān)鍵，退變關(guān)節(jié)局部出現(xiàn)大量炎癥因子、基質(zhì)降解酶類，促使大量關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞異常凋亡，導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨進(jìn)一步退變[14]。在脛股OA動物模型制備方法中，ACLT較為常見。但ACLT 模型在模擬炎癥作用的同時破壞前交叉韌帶，破壞膝關(guān)節(jié)的穩(wěn)定性，改變膝關(guān)節(jié)的正常力學(xué)性能，不利于脛股OA獨(dú)立病因的分析。所以本實(shí)驗(yàn)采用ACLR模型，單一因素模擬脛股OA[15]。髕股關(guān)節(jié)為膝關(guān)節(jié)的重要組成部分，在臨床OA患者中其病變較常見，也較嚴(yán)重，本實(shí)驗(yàn)采用髕骨脫位術(shù)制備髕股關(guān)節(jié)炎模型。本實(shí)驗(yàn)采用ACLR 聯(lián)合髕骨脫位術(shù)制備多間室OA模型，其病變特征更符合臨床。

表1 術(shù)前與術(shù)后各時間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)動物RH與LH負(fù)重比較[n=6，M（QR），%BW]

表2 術(shù)前與術(shù)后各時間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)動物RH與LH觸地面積比較[n=6，M（QR），cm2]

表3 術(shù)前與術(shù)后各時間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)動物RH與LH觸地沖量比較[n=6，M（QR），%BW·s]

表4 術(shù)前與術(shù)后各時間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)動物RH與LH足底局部最大壓力比較[n=6，M（QR），%BW]

表5 術(shù)前與術(shù)后各時間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)動物RH與LH擺動相時間比較[n=6，M（QR），s]

表6 術(shù)前與術(shù)后各時間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)動物RH與LH支撐相時間比較[n=6，M（QR），s]

圖5 LH和RH病理觀察結(jié)果番紅“O”染色圖

步態(tài)是指人或動物通過肢體運(yùn)動并向前移動的一種周期性的形式和狀態(tài)特征。機(jī)體站立或步行時足底與支撐面之間的相互作用力能反映下肢及全身的生理、解剖及功能等方面的變化。步態(tài)分析即通過生物力學(xué)和運(yùn)動學(xué)手段，揭示步態(tài)異常的關(guān)鍵環(huán)節(jié)和影響因素，幫助早期臨床診斷，療效評估，指導(dǎo)康復(fù)[16,17]。目前Tekscan walkway系統(tǒng)應(yīng)用較為廣泛[18]。

本實(shí)驗(yàn)采用巴馬小型豬，四肢承重，十字交叉邁步，自然健康狀態(tài)下，LH與RH負(fù)重基本相當(dāng)。由于手術(shù)創(chuàng)傷、疼痛，導(dǎo)致術(shù)后RH疼痛不能負(fù)重，尤其術(shù)后7 d。隨著術(shù)后時間延長，RH負(fù)重不斷恢復(fù)，在術(shù)后60 d達(dá)到最高水平，但仍未恢復(fù)到正常，此時手術(shù)疼痛已經(jīng)不是主要原因，可能主要由于髕骨脫位，RH膝關(guān)節(jié)的正常屈伸、行走功能受到影響，導(dǎo)致RH負(fù)重仍恢復(fù)不到正常水平。而術(shù)后75、90 d RH的負(fù)重水平又明顯下降，其原因可能是炎癥因素已經(jīng)觸發(fā)膝關(guān)節(jié)軟骨病變，且較為嚴(yán)重。已有小動物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，膝關(guān)節(jié)創(chuàng)傷后1周甚至第二天，膝關(guān)節(jié)周圍炎癥因子水平開始顯著上升，已經(jīng)觸發(fā)軟骨降解、退變[19,20]。同時實(shí)驗(yàn)證實(shí)，RH膝關(guān)節(jié)受到創(chuàng)傷負(fù)重下降時，LH反而負(fù)重增加，起到代償作用，這一現(xiàn)象與臨床一致。一側(cè)肢體發(fā)生OA病變時，身體中心就不斷轉(zhuǎn)向?qū)?cè)肢體。觸地面積為機(jī)體行走時足底與支撐面的接觸面積，其變化趨勢類似于后肢負(fù)重變化趨勢，原因較為一致。術(shù)后7 d RH觸地面積最小，可能由于疼痛導(dǎo)致RH腳尖點(diǎn)地前行，術(shù)后60 d恢復(fù)到最大接觸面積。術(shù)后75、90 d可能是炎癥因素已經(jīng)觸發(fā)膝關(guān)節(jié)軟骨病變，觸地面積又出現(xiàn)下降趨勢。觸地沖量為足底踩踏地面過程中作用力的時間累積，是支持力與時間的乘積，影響因素為負(fù)重大小、支撐時間。其變化趨勢是負(fù)重趨勢和支撐相趨勢綜合作用的結(jié)果，其差異更加顯著。由于足底骨性構(gòu)造、足弓的存在，足底與支撐面接觸時受力并不均勻，人類足底外側(cè)受力明顯高于內(nèi)側(cè)[21]，四足動物足底受力類似人類，并不均勻。本研究得出術(shù)后早期RH足底最大壓力變化趨勢與負(fù)重變化趨勢較為一致，術(shù)后60 d恢復(fù)到較高水平，與LH比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。術(shù)后75、90 d可能是炎癥因素已經(jīng)觸發(fā)膝關(guān)節(jié)軟骨病變，RH足底局部最大壓力又出現(xiàn)下降趨勢，低于LH且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。盡管實(shí)驗(yàn)動物為四肢負(fù)重，十字交叉邁步，但其特征類似于人類，整個步態(tài)周期由支撐相和擺動相組成。由于手術(shù)的創(chuàng)傷、疼痛，導(dǎo)致術(shù)后RH支撐相顯著縮短，擺動相延長，尤其在術(shù)后7、15 d。其表現(xiàn)類似于臨床OA患者，病變肢體邁步緩慢，撐地時間縮短。擺動相期間肢體處于非負(fù)重狀態(tài)，其恢復(fù)較快，術(shù)后45 d恢復(fù)到自然狀態(tài)水平。術(shù)后75、90 d又出現(xiàn)惡化趨勢。LH在擺動相期間處于非負(fù)重狀態(tài)，不起代償作用，故LH的擺動相在術(shù)前、術(shù)后各時間點(diǎn)變化不明顯。支撐相期間，肢體處于負(fù)重狀態(tài)，其恢復(fù)相對較慢，術(shù)后60 d RH恢復(fù)到自然狀態(tài)水平。術(shù)后90 d又出現(xiàn)惡化趨勢。

番紅“O”染色結(jié)果顯示，RH有明顯的軟骨退變，其原因可能是炎癥因素已經(jīng)觸發(fā)膝關(guān)節(jié)所有間室軟骨病變，且較為嚴(yán)重；此外，髕骨處于脫位狀態(tài)，膝關(guān)節(jié)失去正常的力學(xué)性能。生物力學(xué)和生物化學(xué)因素綜合作用導(dǎo)致RH病變嚴(yán)重。LH單純起負(fù)重代償作用，其影響較小，軟骨退變不明顯。

本實(shí)驗(yàn)不足之處：OA 是一種慢性軟骨退變性疾病，其病程較長。而本實(shí)驗(yàn)術(shù)后90 d 安樂處死所有動物，不利于了解OA的全部病理過程。

本實(shí)驗(yàn)采用ACLR聯(lián)合髕骨脫位術(shù)制備大動物多間室OA模型，較為客觀、全面，同時采集、分析步態(tài)實(shí)驗(yàn)相關(guān)指標(biāo)和數(shù)據(jù)。初步確定多間室OA模型制備成功；初步明確多間室OA步態(tài)行為學(xué)變化，為今后動物模型制備、疾病機(jī)制基礎(chǔ)研究、臨床疾病治療及康復(fù)提供一定幫助。