章銀良，李鑫，蔡亞玲

(1.鄭州輕工業(yè)學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院，鄭州 450001；2.食品生產(chǎn)與安全河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，鄭州 450001)

防腐劑(Preservative)是指天然或合成的能夠殺滅或抑制微生物生長(zhǎng)和化學(xué)變化引起的腐敗的物質(zhì)[1]。通常根據(jù)防腐劑的來源可以將其分為天然防腐劑和化學(xué)防腐劑兩大類[2,3]。其主要是通過破壞微生物正常的新陳代謝，使微生物蛋白質(zhì)凝固和變性，抑制其體內(nèi)的酶類和代謝產(chǎn)物的排除，導(dǎo)致其失活，因此其被廣泛應(yīng)用于肉類、油脂、火腿、方便面等食品中。目前，在食品防腐保鮮過程中，主要添加的是化學(xué)防腐劑，但是由于化學(xué)防腐劑的使用不當(dāng)所引起的致癌、致畸、食品中毒等問題頻發(fā)，以及消費(fèi)者對(duì)食品安全問題的關(guān)注程度日益高漲，所以探索抑菌效果好、無毒性的天然防腐劑成為食品領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)問題之一[4-7]。

為了避免使用合成防腐劑，近年來，許多研究者已開發(fā)出一些天然提取物，如：精油、香酚乙酸酯、丁香酚、乳酸鏈球菌素(Nisin)、溶菌酶、納他霉素等[8-12]。盡管低濃度的溶菌酶、納他霉素和精油在體外研究中是有效的，但在食物基質(zhì)中需要更高的濃度以達(dá)到相當(dāng)?shù)男Ч?，并且它們的抗菌廣譜性較受限制[13]。

此外，精油的使用會(huì)對(duì)腌制食品的風(fēng)味產(chǎn)生很大影響[14]。與此同時(shí)，一些研究人員探索發(fā)現(xiàn)了具有抗微生物作用的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物(MRPs)也可作為天然防腐劑，當(dāng)羰基化合物如還原糖與游離或蛋白質(zhì)結(jié)合的氨基酸反應(yīng)時(shí)會(huì)形成MRPs，例如在牛奶或烘焙產(chǎn)品的熱加工過程中或在咖啡或可可豆的烘焙過程中[15]。

近年來，已經(jīng)研究了來自模型混合物(氨基酸和還原糖的加熱溶液)或來自食物提取物的MRPs的抗微生物作用。因此，檢測(cè)到來自模型混合物的MRPs對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌、鼠傷寒沙門氏菌、嗜水氣單胞菌或幽門螺桿菌等不同菌株的抗菌活性以及針對(duì)酵母的抗菌活性[16-18]。

本文主要將MRPs與2種化學(xué)防腐劑山梨酸鉀、雙乙酸鈉及3種天然防腐劑乳酸、乳酸鈉、Nisin(乳酸鏈球菌素)進(jìn)行對(duì)比研究，以評(píng)估它們?cè)谝志鷱V譜性、抗微生物活性方面的優(yōu)劣差別。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

L-賴氨酸、D-果糖、L-精氨酸、D-葡萄糖：生化試劑，Solarbio試劑公司；山梨酸鉀、雙乙酸鈉、乳酸鈉、乳酸、Nisin(乳酸鏈球菌素)：食品級(jí)，山東優(yōu)索化工科技有限公司；蛋白胨、氯化鈉、酵母粉、瓊脂：北京奧博星生物技術(shù)有限公司；氫氧化鈉、鹽酸、無水乙醇：分析純，國(guó)藥集團(tuán)有限公司；去離子水。

1.1.1 指示菌

細(xì)菌：枯草芽孢桿菌(BacillussubtilisBNCC188080)、大腸桿菌(Trans·T1、Top10、BL21)；真菌：酵母菌(MQ3-23、MQ1-23、MQ3-21、MQ3-18)、釀酒酵母(SaccharomycescarlsbergensisACCC20032)。

以上9種受試菌株均來自本實(shí)驗(yàn)室。

菌懸液的制備：細(xì)菌在37 ℃下?lián)u床培養(yǎng)約2 h，真菌在28 ℃下?lián)u床培養(yǎng)約4.5 h，得到濃度為(1.0～5.0)×106CFU/mL的菌液。

1.1.2 指示菌培養(yǎng)基

YPD培養(yǎng)基：蛋白胨2%，酵母粉1%，葡萄糖2%，瓊脂1.5%～2%。

LB培養(yǎng)基：NaCl 1%，蛋白胨1%，酵母粉0.5%，瓊脂1.5%～2%。

1.2 儀器與設(shè)備

牛津杯(內(nèi)徑6.0 mm，外徑8.0 mm，高10.0 mm)；檢測(cè)專用培養(yǎng)皿(內(nèi)徑90 mm，高15 mm)；美國(guó)Rainin瑞寧Pipet-Lite XLS移液槍 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；YZJ-SCT121超凈工作臺(tái) 東莞市華旗凈化工程有限公司；SQP電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；DNP-9162BS電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；HJ-3恒溫磁力加熱攪拌器 常州國(guó)華電器有限公司；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋 廣州越特科學(xué)儀器有限公司；pH計(jì) 瑞士梅特勒-托利多公司；T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；HH-1智能型數(shù)顯恒溫油浴槽 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；101-2型電熱鼓風(fēng)干燥箱 天津市泰斯特儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 抑菌效果最佳的MRPs制備

依據(jù)前期均勻試驗(yàn)以及單因素試驗(yàn)比較分析優(yōu)化得出制備MRPs的最佳反應(yīng)條件和反應(yīng)原料。參考章銀良等[19]的方法，準(zhǔn)確稱取D-葡萄糖3.6032 g和L-精氨酸10.4520 g(摩爾比1∶3)，溶解于90 mL的去離子水中，置于恒溫磁力攪拌器上攪拌至溶液清澈，再用3 mol/L的HCl和3 mol/L的NaOH調(diào)整溶液pH至12.0，最后將調(diào)好的pH值為12.0的溶液定容至100 mL，混合均勻后，取10 mL反應(yīng)液轉(zhuǎn)移到25 mL具塞試管中，旋緊試管后，置于120 ℃恒溫油浴鍋中反應(yīng)210 min，反應(yīng)結(jié)束后置于冰水中冷卻。再準(zhǔn)確稱取D-果糖10.8096 g和L-賴氨酸2.9238 g(摩爾比3∶1)溶解于90 mL的去離子水中，制備條件為加熱時(shí)間90 min、反應(yīng)初始pH值調(diào)至10.0、溫度120 ℃，其余制備步驟同上。

1.3.2 MRPs與不同種類防腐劑抑菌效果的研究

1.3.2.1 牛津杯法測(cè)定抑菌活性

參考Makhlouf-Gafsi I等[20]、張建華等[21]的方法，在無菌條件下，將經(jīng)過高壓蒸汽滅菌的固體培養(yǎng)基(真菌用YPD培養(yǎng)基，細(xì)菌用LB培養(yǎng)基)冷卻至40～45 ℃之間，倒6組平板，每組9個(gè)。取40 μL濃度為(1.0～5.0)×106CFU/mL的菌液轉(zhuǎn)移至固體培養(yǎng)基平板表面并用無菌涂布棒涂布均勻。用移液槍分別吸取MRPs、乳酸、山梨酸鉀、雙乙酸鈉、乳酸鈉、Nisin(防腐劑濃度均按國(guó)標(biāo)最大限量配制)各200 μL加入擺放于固體培養(yǎng)基中央的牛津杯內(nèi)(細(xì)菌加入果糖和賴氨酸MRPs，酵母菌加入葡萄糖和精氨酸MRPs)，同時(shí)做試劑空白對(duì)照。放入恒溫培養(yǎng)箱中平板倒置培養(yǎng)，測(cè)量抑菌圈直徑，并計(jì)算3次平行試驗(yàn)的平均值。

1.3.2.2 抑菌率的測(cè)定

參照楊曉韜等[22]、顧勝等[23]的方法，首先將5種防腐劑分別按國(guó)標(biāo)最大限量的100%進(jìn)行配制，用無菌水配制并且都在無菌操作臺(tái)中操作。在含有5 mL液體培養(yǎng)基的試管中，實(shí)驗(yàn)組加入200 μL防腐劑溶液、40 μL菌懸液；陽性對(duì)照組用無菌水代替防腐劑，陰性對(duì)照組只加入液體培養(yǎng)基和防腐劑(用比濁法調(diào)零，菌落總數(shù)法只做陽性對(duì)照)。

菌落總數(shù)法[24]：用于乳酸、MRPs、Nisin抑菌活性的測(cè)定。用稀釋不同濃度梯度(10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7)的菌懸液分別制備上述混合液，之后各取200 μL涂平板，真菌于28 ℃下培養(yǎng)48 h，細(xì)菌于37 ℃條件下培養(yǎng)24 h，計(jì)數(shù)，與陽性對(duì)照比較，并用于表征各種防腐劑的抑菌活性。

比濁法[25]：用于山梨酸鉀、雙乙酸鈉、乳酸鈉抑菌活性的測(cè)定。將上述體系充分混勻后，真菌于28 ℃下培養(yǎng)48 h，細(xì)菌于37 ℃下培養(yǎng)24 h。取出試管，充分振蕩，并對(duì)各個(gè)試管進(jìn)行逐一檢查，觀察每個(gè)試管的渾濁度。以陰性對(duì)照作為空白參比，用紫外分光光度計(jì)于適宜波長(zhǎng)處(真菌培養(yǎng)液在560 nm處測(cè)量，細(xì)菌培養(yǎng)液在600 nm處測(cè)量)測(cè)定培養(yǎng)液的濁度(OD 值)，與陽性對(duì)照比較，并用于表征各種防腐劑的抑菌活性。

菌落總數(shù)法抑菌率的計(jì)算：

抑菌率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組菌落數(shù)/陽性對(duì)照菌落數(shù))×100。

(1)

比濁法抑菌率的計(jì)算：

抑菌率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組OD值/陽性對(duì)照OD值)×100。

(2)

1.3.2.3 最小抑菌濃度(MIC)的測(cè)定

MIC的測(cè)定[26,27]：首先根據(jù)防腐劑5種水平添加量(國(guó)標(biāo)限量的0%、20%、40%、60%、80%、100%)的抑菌率初步確定其MIC范圍，在此百分比下設(shè)定密集的稀釋濃度梯度(稀釋2，4，8，16，32，64，128，256，512，1024倍)，培養(yǎng)后涂布平板測(cè)定其菌落總數(shù)，選擇無菌落生長(zhǎng)(即抑菌率為100%)時(shí)的防腐劑質(zhì)量濃度，即為防腐劑的最小抑菌濃度(MIC)。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛津杯法測(cè)定抑菌活性結(jié)果對(duì)比

以抑菌圈直徑作為抑菌活性指標(biāo)，測(cè)定MRPs與不同種類的防腐劑(天然防腐劑與化學(xué)防腐劑)對(duì)不同菌種的抑制效果，分別用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，試驗(yàn)結(jié)果見表1和表2。

表1 MRPs與防腐劑對(duì)不同真菌的抑菌圈直徑

注：表中“-”表示抑菌圈直徑Φ≤8 mm，無明顯抑菌作用；同一行中，不同字母表示差異顯著(p<0.05)，相同字母表示差異不顯著(p>0.05)。

表2 MRPs與防腐劑對(duì)不同細(xì)菌的抑菌圈直徑Table 2 The inhibition zone diameters of Maillard reaction products and preservatives to different bacteria

注：表中“-”表示抑菌圈直徑Φ≤8 mm，無明顯抑菌作用；同一行中，不同字母表示差異顯著(p<0.05)，相同字母表示差異不顯著(p>0.05)。

經(jīng)過方差分析和多重比較，觀察對(duì)5種真菌的抑菌效果，由表1可知6種防腐劑對(duì)5種酵母菌的抑菌作用大小為：山梨酸鉀>葡萄糖+精氨酸MRPs>乳酸>乳酸鈉>雙乙酸鈉>Nisin，其中，葡萄糖+精氨酸MRPs僅次于山梨酸鉀，對(duì)MQ3-21、MQ3-23、MQ3-18、MQ1-23、釀酒酵母的抑菌圈直徑分別達(dá)到(22.76±0.25)，(20.25±0.18)，(20.56±0.54)，(23.89±0.71)，(21.55±0.36) mm，可以看出MRPs擁有能與化學(xué)防腐劑相媲美的抑菌效果，同時(shí)在抑菌廣譜性方面又優(yōu)于天然防腐劑乳酸鈉；乳酸和乳酸鈉2種防腐劑對(duì)MQ3-21、MQ3-23、MQ3-18、MQ1-23的抑菌效果有差異但不明顯，但對(duì)于釀酒酵母的抑菌效果相差較大，乳酸對(duì)其抑菌圈直徑達(dá)到(28.42±0.23) mm，而乳酸鈉對(duì)其無明顯抑菌作用。

另外，由表2觀察對(duì)4種細(xì)菌的抑菌效果，可以得出6種防腐劑對(duì)4種細(xì)菌的抑菌作用大小為：雙乙酸鈉、乳酸>山梨酸鉀>果糖+賴氨酸MRPs>乳酸鈉>Nisin，果糖+賴氨酸MRPs的抑菌作用居中，對(duì)Trans·T1、Top10、BL21、枯草芽孢桿菌的抑菌圈直徑分別達(dá)到(20.49±0.22)，(21.63±0.41)，(23.82±0.37)，(20.05±0.28) mm，可見對(duì)4種細(xì)菌的抑菌強(qiáng)度較為均勻，其中Nisin的抑菌效果最弱，可能是由于Nisin在中性條件下溶解度太小，僅達(dá)到49.0 mg/mL，從而在牛津杯試驗(yàn)中形成的少量沉淀影響了它在培養(yǎng)基中的擴(kuò)散。

2.2 MRPs與不同防腐劑對(duì)不同菌株的抑菌率差異

以抑菌率為抑菌活性指標(biāo)，美拉德反應(yīng)產(chǎn)物與不同種類的防腐劑在不同添加量下對(duì)9種供試菌株的抑菌率見圖1和圖2。

圖1 MRPs與不同防腐劑對(duì)不同真菌的抑菌率Fig.1 The inhibition rates of MRPs and different preservatives on different fungi

圖2 MRPs與不同防腐劑對(duì)不同細(xì)菌的抑菌率Fig.2 The inhibition rates of MRPs and different preservatives on different bacteria

由圖1可知，6種防腐劑對(duì)5種酵母菌的抑菌率大小為：山梨酸鉀>乳酸>雙乙酸鈉>葡萄糖+精氨酸MRPs>乳酸鈉>Nisin。其中山梨酸鉀對(duì)MQ3-21和釀酒酵母這2株菌的抑菌率都為100%；雙乙酸鈉和乳酸2種防腐劑對(duì)MQ3-23、MQ3-18、MQ1-23這3株菌的抑菌效果有差異但不明顯，抑菌率相差不超過6%；葡萄糖+精氨酸MRPs對(duì)5株菌的抑菌效果相差較大，對(duì)MQ1-23的抑菌率達(dá)到52%，對(duì)MQ3-21的抑菌率為32%，而對(duì)釀酒酵母的抑菌率只有17%，對(duì)MQ3-23、MQ3-18的抑菌率不足10%；而國(guó)標(biāo)限量下的Nisin對(duì)5株菌均無抑制作用。

同時(shí)，由圖2可知，6種防腐劑對(duì)4種細(xì)菌的抑菌率大小為：乳酸>Nisin>雙乙酸鈉>果糖+賴氨酸MRPs>乳酸鈉>山梨酸鉀。乳酸對(duì)這4株細(xì)菌的抑菌率均達(dá)到100%；Nisin對(duì)各菌株的抑菌率僅次于乳酸；乳酸鈉對(duì)4株菌的抑菌率相差較大，它對(duì)BL21和枯草芽孢桿菌的抑菌率達(dá)到了80%和95%，而對(duì)Trans·T1、Top10的抑菌率不到2%；果糖+賴氨酸MRPs與雙乙酸鈉的抑菌效果相似，且它們的抑菌效果都優(yōu)于山梨酸鉀。

2.3 最小抑菌濃度(MIC)法測(cè)定結(jié)果分析

按照1.3.2.3所述試驗(yàn)方法及步驟，采用二倍連續(xù)稀釋法測(cè)定MRPs與5種防腐劑分別對(duì)9種常見腐敗菌的最小抑菌濃度(MIC)，結(jié)果見表3和表4。

表3 MRPs對(duì)供試菌的最小抑菌濃度Table 3 The minimal inhibitory concentration of MRPs to tested strains

注：“-”表示無供試菌生長(zhǎng)；“+”表示有供試菌生長(zhǎng)； 9號(hào)試管為陰性對(duì)照；10號(hào)試管為陽性對(duì)照。

表4 5種防腐劑對(duì)供試菌的最小抑菌濃度Table 4 The minimal inhibitory concentration of five preservatives on tested bacteria mg/mL

注：“-”表示防腐劑最終質(zhì)量濃度達(dá)到50 mg/mL 時(shí)仍不能完全抑菌。

由表3和表4可知，MIC值越低，即相應(yīng)食品防腐劑的抑菌作用越強(qiáng)。Nisin對(duì)革蘭氏陽性菌枯草芽孢桿菌有很強(qiáng)的抑菌作用，在5種防腐劑中，它的最小抑菌濃度與雙乙酸鈉相同，都是最小的，但是對(duì)于革蘭氏陰性的3種大腸桿菌，它的抑菌效果卻不明顯；且對(duì)以上5種酵母菌皆無抑菌作用，這與呂淑霞等[28]的研究結(jié)果一致。乳酸對(duì)革蘭氏陽性菌的最小抑菌質(zhì)量濃度雖然比Nisin和山梨酸鉀略大，但遠(yuǎn)優(yōu)于乳酸鈉，尤其是對(duì)3種革蘭氏陰性菌Top10、BL21和Trans·T1的最低抑菌質(zhì)量濃度是最小的。山梨酸鉀對(duì)5株酵母菌的最小抑菌質(zhì)量濃度明顯低于其他防腐劑，而它對(duì)4株細(xì)菌的抑菌效果一般，分析其原因可能有以下幾個(gè)方面：山梨酸鉀對(duì)霉菌、酵母和好氣性菌均有抑制作用，但對(duì)嫌氣性芽孢形成菌與嗜酸乳桿菌則幾乎無效[29]，即山梨酸鉀并不是廣譜的防腐劑；對(duì)比可以看出雙乙酸鈉的抑菌廣譜性較好，而乳酸鈉對(duì)細(xì)菌的抑菌效果在5種防腐劑中最差。

各防腐劑的最低抑菌質(zhì)量濃度綜合排序：對(duì)于細(xì)菌，乳酸<雙乙酸鈉<山梨酸鉀

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)用抑菌圈、抑菌率、最小抑菌濃度3個(gè)指標(biāo)來檢測(cè)MRPs、山梨酸鉀、Nisin等7種食品防腐劑對(duì)食物中常見細(xì)菌和真菌的抑制效果，結(jié)果表明7種防腐劑對(duì)各種供試菌都有不同程度的抑菌效果，防腐劑質(zhì)量濃度越高，其抑菌效果越好。總體來看，7種防腐劑對(duì)于真菌的抑菌作用強(qiáng)弱為：山梨酸鉀>乳酸>雙乙酸鈉>葡萄糖+精氨酸MRPs>乳酸鈉>Nisin；對(duì)細(xì)菌的抑菌作用強(qiáng)弱為：乳酸>雙乙酸鈉>山梨酸鉀>果糖+賴氨酸MRPs>Nisin>乳酸鈉。同一種防腐劑，特別是抑菌效果中等的防腐劑，不僅對(duì)不同種的細(xì)菌抑菌效果不同，而且對(duì)于同種不同株的細(xì)菌，其抑菌效果也不盡相同，甚至相差很大。因此，對(duì)于防腐劑的抑菌效果，不能單純以菌種來定論，應(yīng)具體到所涉及的每一株菌。對(duì)于大多數(shù)供試菌而言，山梨酸鉀、雙乙酸鈉、乳酸的抑菌效果最好。而2種MRPs的抑菌作用雖略低于化學(xué)防腐劑，但是優(yōu)于乳酸鈉和Nisin 2種天然防腐劑，且抑菌廣譜性也優(yōu)于其余幾種防腐劑。隨著人們生活和消費(fèi)水平的提高，人們對(duì)食品安全提出了更高的要求，食品防腐劑的開發(fā)與使用為了順應(yīng)市場(chǎng)的變化，其產(chǎn)品也越來越趨向“綠色”和“天然”等方向轉(zhuǎn)變，本實(shí)驗(yàn)也進(jìn)一步證明了MRPs作為食品防腐劑比生物防腐劑更高效，比化學(xué)防腐劑更廣譜。因此，天然、安全的MRPs防腐劑將是未來食品防腐領(lǐng)域研究的重點(diǎn)。