柯東平，毛俊倩，郭甲民，馬龍安

陜西省腫瘤醫(yī)院(西安 710061)

胃癌是一種起源于胃壁黏膜上皮細(xì)胞的惡性腫瘤，是發(fā)病率和病死率最高的消化道惡性腫瘤之一，全世界每年約有700，000例患者死于胃癌，其治療失敗的主要原因是腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[1]。研究顯示，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transitions，EMT)在腫瘤的發(fā)展過程中具有重要作用[2]。該過程上皮細(xì)胞失去細(xì)胞極性和細(xì)胞間粘附，同時(shí)獲得遷移和侵襲性，成為間充質(zhì)表型細(xì)胞，造成腫瘤的轉(zhuǎn)移。因此，探究影響胃癌細(xì)胞EMT的靶向分子對胃癌的治療具有重要意義。SCNN1B位于16p12.2號染色體上，編碼上皮鈉通道(ENaC)的β亞單位，與α、γ亞單位組成多蛋白復(fù)合物，控制不同器官中水和電解質(zhì)的跨上皮轉(zhuǎn)運(yùn)。同時(shí)，有報(bào)道顯示，包括SCNN1B編碼的β亞單位在內(nèi)，ENaC亞單位均參與細(xì)胞分化[3]，并且在多種癌細(xì)胞中編碼ENaC亞單位的基因啟動(dòng)子區(qū)發(fā)生高甲基化導(dǎo)致基因沉默[4-5]。近來研究發(fā)現(xiàn)，SCNN1B沉默與胃癌患者不良的疾病特異性和生存率顯著相關(guān)[6]。本研究擬采用SCNN1B過表達(dá)人胃癌細(xì)胞系SGC-7901細(xì)胞，建立胃癌裸鼠移植瘤模型，探究SCNN1B對胃癌移植瘤生長情況的影響及其與胃癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的相關(guān)性，為胃癌臨床治療提供新靶點(diǎn)。

材料和方法

1 主要材料 E-cadherin抗體、N-cadherin抗體(中國Proteintech)；Vinmentin抗體、β-actin抗體、全蛋白提取試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒(中國Wanleibio)；HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG、HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(美國ThermoFisher)；蘇木精、山羊血清、DAB顯色液、SYBR Green(中國Solarbio)；TRIpure、Super M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(中國BioTeke)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：人胃癌細(xì)胞系SGC-7901細(xì)胞采用含10 %胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基于37 ℃、5 % CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。構(gòu)建針對人SCNN1B過表達(dá)載體，待SGC-7901細(xì)胞生長至90 %融合時(shí)，進(jìn)行轉(zhuǎn)染，G418篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。

2.2 裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)：取4周齡雌性18～22 g，BALB/c裸鼠，隨機(jī)均分為未轉(zhuǎn)染組(Control)、空載體對照轉(zhuǎn)染組(Empty vector)、SCNN1B過表達(dá)轉(zhuǎn)染組(SCNN1B)。調(diào)整各組細(xì)胞密度，制備細(xì)胞懸液，于裸鼠右前肢皮下接種1×106個(gè)SGC-7901細(xì)胞，建立裸鼠移植瘤模型。常規(guī)飼養(yǎng)3周后處死裸鼠，剝?nèi)∧[瘤組織，觀察移植生長情況，部分用液氮凍存轉(zhuǎn)移至-70℃超低溫冰箱保存，部分用4 %多聚甲醛固定，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 Real-time PCR檢測移植瘤組織中SCNN1B和EMT標(biāo)志分子mRNA的表達(dá)：采用TRIpure總RNA抽提試劑提取各組移植瘤組織樣本總RNA，并通過反轉(zhuǎn)錄PCR合成cDNA樣本。根據(jù)人相應(yīng)基因序列，使用Primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)相應(yīng)引物。取上述cDNA產(chǎn)物作為模板，采用Real-time PCR檢測SCNN1B、E-cadherin、N-cadherin及Vimentin mRNA的表達(dá)。

表1 Real-time PCR引物序列

2.4 Western blot檢測移植瘤組織中SCNN1B和EMT標(biāo)志分子蛋白的表達(dá)：采用RIPA裂解液裂解各組移植瘤組織樣本，提取總蛋白。BCA法測定蛋白濃度，取40 μg蛋白樣本，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5 %脫脂奶粉溶液封閉，分別加入SCNN1B、E-cadherin、N-cadherin及Vimentin一抗4 ℃孵育過夜，HRP標(biāo)記二抗37 ℃孵育45 min。ECL顯影，暗室曝光。采凝膠成像分析儀采集圖片，并用Gel-Pro-Analyzer軟件分析條帶的光密度值。

2.5 免疫組化檢測腫瘤組織中EMT標(biāo)志分子蛋白表達(dá)：制備石蠟組織切片，常規(guī)脫蠟至水，蒸餾水和PBS清洗后，置于抗原修復(fù)液內(nèi)，低火持續(xù)加熱10 min；室溫下自然冷卻，滴加3 %過氧化氫溶液，孵育15 min；滴加山羊血清封閉15 min，完成后去除血清，勿洗，分別加入E-cadherin、N-cadherin及Vimentin一抗4 ℃孵育過夜，二抗37 ℃孵育30 min；DAB顯色、蘇木精復(fù)染、脫水透明處理；中性樹膠封片，晾干后于400×顯微鏡下觀察并攝圖記錄。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism 6.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，t檢驗(yàn)分析組間差異，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 SCNN1B過表達(dá)抑制胃癌移植瘤生長 采用BALB/c裸鼠皮下注射SCNN1B過表達(dá)SGC-7901細(xì)胞，培養(yǎng)3周。結(jié)果顯示，Control組和Empty vector組瘤體大小比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；與Empty vector組相比，SCNN1B組移植瘤的生長明顯受到抑制(圖1)。

2 SCNN1B過表達(dá)效果驗(yàn)證 采用Real-time PCR和Western blot檢測各組小鼠移植瘤組織中SCNN1B的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，與Control組相比，Empty vector組移植瘤組織中SCNN1B mRNA和蛋白表達(dá)水平比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；與Empty vector組相比，SCNN1B組移植瘤組織中SCNN1B mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖2)。

圖1 各組小鼠移植瘤瘤體情況

3 小鼠移植瘤組織中EMT標(biāo)志物的表達(dá)情況 Real-time PCR和Western blot檢測各組小鼠移植瘤組織中EMT標(biāo)志分子的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，與Control組相比，Empty vector組移植瘤組織中上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin、間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin及Vimentin mRNA和蛋白表達(dá)水平均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；與Empty vector組相比，SCNN1B組移植瘤組織中E-cadherin mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯升高，N-cadherin和Vimentin mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖3)。

圖2 移植瘤組織中SCNN1B表達(dá)情況(與Empty vector組相比，**P<0.01)

圖3 移植瘤組織中EMT標(biāo)志物表達(dá)情況(與Empty vector組相比，**P<0.01)

4 SCNN1B過表達(dá)抑制胃癌細(xì)胞EMT 免疫組化結(jié)果顯示，陽性染色為棕黃色顆粒。與Control組相比，Empty vector組移植瘤組織中E-cadherin、N-cadherin及Vimentin蛋白表達(dá)水平均無明顯變化；與Empty vector組相比，SCNN1B組移植瘤組織中E-cadherin蛋白表達(dá)水平明顯升高，N-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)水平均明顯降低(圖4)。

圖4 SCNN1B過表達(dá)對胃癌移植瘤上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響(400×)

討 論

胃癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，也是第三大致人死亡的腫瘤疾病，給社會帶來巨大的壓力。由于胃癌早期臨床表現(xiàn)不典型，不易發(fā)現(xiàn)，多數(shù)患者就診時(shí)已處于中晚期，加之治療手段有限，導(dǎo)致胃癌的治愈率并不高。當(dāng)前，隨著分子靶向治療的深入開展，探究影響胃癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵分子對于有效治療胃癌的轉(zhuǎn)移具有重要意義。

SCNN1B編碼上皮鈉通道(ENaC)的β亞單位，參與控制不同器官中水和電解質(zhì)的跨上皮轉(zhuǎn)運(yùn)及細(xì)胞分化過程。目前關(guān)于ENaC在癌癥中的研究顯示，在乳腺癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤中，編碼ENaC α亞單位的SCNN1A基因啟動(dòng)子區(qū)發(fā)生高甲基化引起的SCNN1A基因沉默，是上述腫瘤疾病患者預(yù)后較差的主要原因[4,7]。新近研究發(fā)現(xiàn)，SCNN1B可以抑制胃癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移，且SCNN1B表達(dá)水平與胃癌患者生存率正相關(guān)[6]，上述研究提示，SCNN1B在癌癥中發(fā)揮抑癌作用，然而，其作用機(jī)制卻鮮有相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行報(bào)道，因此，為進(jìn)一步闡明SCNN1B在胃癌中的作用與機(jī)制，本研究使用過表達(dá)SCNN1B的人胃癌細(xì)胞系SGC-7901細(xì)胞建立裸鼠移植瘤模型，觀察SCNN1B過表達(dá)對胃癌移植瘤生長情況的影響。上述結(jié)果顯示，SCNN1B過表達(dá)后，移植瘤的生長明顯受到抑制表明SCNN1B能夠抑制體內(nèi)胃癌細(xì)胞的生長。

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是指上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的過程，與胚胎發(fā)育、傷口愈合及腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移等過程密切相關(guān)[8]。越來越多研究顯示，EMT在胃癌細(xì)胞生長、侵襲和遷移等過程中發(fā)揮重要作用[9-10]。為明確SCNN1B對胃癌細(xì)胞的影響是否與EMT相關(guān)，本研究分別采用Real-time PCR和Western blot技術(shù)檢測過表達(dá)胃癌細(xì)胞形成的移植瘤組織中上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin、間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物N-cadherin和Vimentin mRNA和蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示，在SCNN1B過表達(dá)胃癌細(xì)胞形成的移植瘤組織中，E-cadherin mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯上調(diào)，N-cadherin、Vimentin mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯降低。同時(shí)，本研究進(jìn)一步采用免疫組化檢測移植瘤組織中EMT標(biāo)志分子蛋白的表達(dá)，結(jié)果同樣表明，SCNN1B過表達(dá)導(dǎo)致E-cadherin蛋白表達(dá)水平上調(diào)，N-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)水平下調(diào)。以上結(jié)果顯示，SCNN1B過表達(dá)抑制胃癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。

綜上所述，SCNN1B能夠通過抑制胃癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)程對胃癌細(xì)胞移植瘤的生長起到明顯的抑制作用。因此，SCNN1B可能成為治療胃癌的潛在分子靶點(diǎn)。