龐 敏，吳 志△，陳 森，牛銀波，李 勃，林冠杰

1.廣東省湛江市第四人民醫(yī)院骨科(湛江524008)，2.西北工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)院(西安710072)； 3.武警陜西省總隊(duì)醫(yī)院(西安710054)

骨質(zhì)疏松癥是一種以骨骼中礦物質(zhì)水平明顯降低、骨骼微結(jié)構(gòu)被破壞以及骨骼脆性增加為特征的疾病。隨著我國(guó)人口的老齡化，骨質(zhì)疏松癥已經(jīng)成為一種嚴(yán)重危害中老人身體健康和生存質(zhì)量的健康問題。2018年，中國(guó)衛(wèi)健委針對(duì)骨質(zhì)疏松癥進(jìn)行了我國(guó)第一次流行病學(xué)調(diào)查。此次調(diào)查結(jié)果顯示，年齡超過50歲的人群骨質(zhì)疏松癥患病率為19.2%，中老年女性骨質(zhì)疏松問題尤為突出，年齡超過50歲的女性患病率達(dá)32.1%，遠(yuǎn)高于同齡男性的6%，而年齡超過65歲的女性骨質(zhì)疏松癥患病率更是達(dá)到了51.6%。骨質(zhì)疏松癥引發(fā)的骨折(髖骨、股骨)嚴(yán)重影響了病人的生活質(zhì)量，增加了個(gè)人以及國(guó)家的醫(yī)療負(fù)擔(dān)，因此，尋找有效的防治措施已經(jīng)成為醫(yī)療科研領(lǐng)域一項(xiàng)亟待解決的問題。 我國(guó)的傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)，中醫(yī)學(xué)對(duì)于治療跌打損傷有著豐富的資源以及經(jīng)驗(yàn)。重樓又名“七葉一枝花”，為百合科植物，它主要分布在廣西、貴州、四川、廣東等省，有消腫止痛、敗毒抗癌、鎮(zhèn)咳平喘、清熱定驚等作用。研究者們發(fā)現(xiàn)，甾體皂苷是其中主要的生物活性成分；并著重研究以及闡明重樓的抗腫瘤作用與相關(guān)機(jī)制[1-2]。除了抗腫瘤作用外，重樓作為云南白藥的主要成分之一，對(duì)骨骼與肌肉的損傷也呈現(xiàn)出良好的效果。因此，重樓皂苷不僅能治療運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)的損傷，而且可能防治骨質(zhì)疏松癥的進(jìn)展。本實(shí)驗(yàn)研究重樓皂苷I(Polyphyllin I，PPL I)對(duì)小鼠成骨樣細(xì)胞MC3T3-E1的增殖與成熟及其β-catenin與BMP-2蛋白表達(dá)的影響，揭示PPL I防治骨質(zhì)疏松癥的作用并初步探討其可能的防護(hù)機(jī)制。

材料與方法

1 材料與試劑 PPL I(分子量為855.02，純度>98%)從上海瀚香生物科技有限公司購買。小鼠成骨樣細(xì)胞株MC3T3-E1 (中國(guó)科學(xué)院上海生化細(xì)胞所細(xì)胞庫)，胎牛血清(美國(guó)Thermo Fisher公司)，DMEM培養(yǎng)液(美國(guó)Thermo Fisher公司)，胰蛋白酶、EDTA、二甲基亞砜 (DMSO)、MTT (均購于美國(guó)Sigma公司)，骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(BMP-2)，β-連環(huán)蛋白(β-catenin)及β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)抗體均購自北京博奧森生物有限公司，堿性磷酸酶(ALP)試劑盒 (南京建成生物公司)，EdU試劑盒 (廣州瑞博公司)。

2 細(xì)胞培養(yǎng)與藥物處理 使用加入10% (v/v)胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液在37℃、5% CO2的條件中培養(yǎng)MC3T3-E1細(xì)胞。將PPL I溶解于DMSO中，配置成濃度為1 mol/L的儲(chǔ)藏液。臨用前，將其稀釋成工作濃度(1、3、10、30 μmol/L)。

3 MTT法觀察細(xì)胞的增殖 將細(xì)胞(2×103/孔)接種于96孔板中，隨后放在細(xì)胞孵箱中(5% CO2、37℃)培養(yǎng)12 h。隨機(jī)分為正常對(duì)照組：每孔中加入200 μl DMEM培養(yǎng)液(含0.54‰ DMSO)；給藥組：每空加入200 μl含PPL I (1、3、10、30 μmol/L) 的培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)1d或2d。每孔加入濃度為5 g/L 的20 μl MTT溶液， 繼續(xù)孵育4h，結(jié)束培養(yǎng)。吸干培養(yǎng)液，接著每孔加入150 μl DMSO，充分振蕩、完全溶解結(jié)晶物。立即使用Bio-Rad ELISA Reader讀取培養(yǎng)板在490 nm波長(zhǎng)處的吸光值。計(jì)算細(xì)胞增殖率：細(xì)胞增殖率/% =(試驗(yàn)組OD值-對(duì)照組OD值)/對(duì)照組OD值×100%。

4 EdU法檢測(cè)細(xì)胞增殖 細(xì)胞培養(yǎng)方法同上 (為了進(jìn)一步觀察驗(yàn)證PPL I對(duì)細(xì)胞增殖的作用，參考MTT結(jié)果，選擇3、10 μmol/L兩個(gè)促進(jìn)細(xì)胞增殖明顯，且對(duì)細(xì)胞特性無顯著影響的濃度)，將含不同濃度的PPL I (3、10 μmol/L)培養(yǎng)液孵育、處理MC3T3-E1細(xì)胞2d后，參考說明書進(jìn)行操作，實(shí)驗(yàn)完畢使用奧林帕斯顯微鏡捕捉處理圖像。

5 堿性磷酸酶(ALP) 活性測(cè)定 堿性磷酸酶是能夠反映成骨細(xì)胞分化程度的一種酶。ALP的活性越高，成骨細(xì)胞的成骨活性越強(qiáng)；反之亦然[3]。使用24孔板培養(yǎng)MC3T3-E1細(xì)胞(2×104/孔)12 h后，更換含有3、10 μmol/L PPL I的新鮮培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)2 d或3 d。參考?jí)A性磷酸酶試劑盒說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。使用瑞士梅特勒-托利多紫外分光光度計(jì)測(cè)定各組在520 nm處吸光度；檢測(cè)每個(gè)樣品的蛋白含量，結(jié)果用U/mg 蛋白表示。

6 茜素紅染色 以2×105/孔的密度將MC3T3-E1細(xì)胞接種于24孔板內(nèi)，培養(yǎng)14 d。1次/3d，換用含3、10 μmol/L PPL I的培養(yǎng)液。培養(yǎng)結(jié)束后，用預(yù)冷PBS 洗滌細(xì)胞，70%的酒精固定20 min，吸棄固定液， PBS 清洗細(xì)胞樣本兩次。滴加茜素紅 S 染色液(Solarbio公司)， 覆蓋樣本， 染色 5min。吸去染色液， PBS 洗滌2次。顯微鏡下觀察： 鈣沉積陽性細(xì)胞呈現(xiàn)桔紅色。

7 免疫印跡法檢測(cè)β-catenin與BMP-2的蛋白表達(dá) 待PPL I處理細(xì)胞2d后，使用細(xì)胞刮刮取收集細(xì)胞。以RIPA Lysis Buffer(江蘇碧云天公司)提取細(xì)胞蛋白，用Bradford 法測(cè)定蛋白濃度。確定每孔的蛋白上樣量為30 μg，接著在120 V電壓下，行凝膠電泳，分別使用6%的濃縮膠與12%的分離膠進(jìn)行樣本的濃縮與分離，采用NC膜進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。以PBST做溶劑，配置5%脫脂牛奶溶液，在室溫下封閉硝酸纖維素膜2 h后，加入β-catenin (1∶500)、BMP-2 (1∶500)及β-actin (1∶500) 一抗，放入冰箱冷藏室(4℃)中孵育12 h。使用PBST洗膜3次，10 min/次，加入HRP標(biāo)記二抗(稀釋比例1∶6000)，室溫孵育1 h，充分洗膜后，使用美國(guó)Millipore公司的ECL 發(fā)光液進(jìn)行化學(xué)發(fā)光，采用Bio-Rad凝膠成像儀采集分析條帶。

8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用單因素方差分析(ANOVA)比較組間差異，選擇SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

結(jié) 果

1 PPL I可促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞增殖 PPL I(1、3、10、30 μmo/L)作用細(xì)胞24 h、48 h后，成骨樣細(xì)胞均發(fā)生顯著地增殖(P<0.01)(圖1)：重樓皂苷(1、3、10、30 μmol/L)作用24 h后，MC3T3-E1細(xì)胞的增殖率分別為(111. 67 ± 2.52)%、(122. 00 ± 4.58)%、 (130. 33 ± 3.06)%、(142. 00 ± 2.65)% ；48 h后，分別為(123. 33 ± 3.51)%、( 132. 67 ± 2.08)%、(141. 00 ± 2.00)%、(146. 67 ± 3.21)%。 EdU實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖2)也顯示，PPL I可以有效地促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞的增殖。

2 PPL I可上調(diào)MC3T3-E1 細(xì)胞的ALP活性 將PPL I (3、10 μmol/L)加入培養(yǎng)液，處理細(xì)胞 1 d或2d后，細(xì)胞中的堿性磷酸酶(ALP)活性均明顯上調(diào)。在2d與3d時(shí)，正常組細(xì)胞的ALP活性分別為(0.22 ± 0.01)、(0.23 ± 0.02) U/mg蛋白。而PPL I(3、10 μmol/L)作用1d后，ALP活性分別為(0. 31 ± 0.03)、(0. 34 ± 0.03)U/mg蛋白；2d后，分別為(0.40 ± 0.04)、(0.51 ± 0.03) U/mg蛋白。與對(duì)照組相比，均有顯著升高(圖3)。

圖1PPL I對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增殖的影響(與對(duì)照組24 h比較，**P<0.01；與對(duì)照組48 h比較，##P<0.01)

圖2 EdU檢測(cè)PPL I對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增殖的影響 (×100，紅色信號(hào)顯示處于增殖狀態(tài)的細(xì)胞，藍(lán)色信號(hào)顯示細(xì)胞核)

圖3 PPL I對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞的堿性磷酸酶活性影響(與對(duì)照組48 h比較，**P<0.01；與對(duì)照組72 h比較，##P<0.01)

圖4 PPL I對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞鈣結(jié)節(jié)(橘紅色結(jié)節(jié)即為鈣結(jié)節(jié))形成的影響

3 PPL I可促進(jìn)MC3T3-E1 ALP細(xì)胞的成熟 鈣沉積和鈣化結(jié)節(jié)的形成是成骨細(xì)胞成熟的一種標(biāo)志。 茜素紅S鈣染色法是一種通過鰲和技術(shù)，使鈣離子和茜素紅 S 結(jié)合形成復(fù)合物，進(jìn)而分析細(xì)胞樣本中橘紅色鈣沉積現(xiàn)象的經(jīng)典方法。如圖4所示，PPL I(3、10 μmol/L)作用2周后，MC3T3-E1細(xì)胞的鈣結(jié)節(jié)形成明顯增高。

4 PPL I可促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞中β-catenin和BMP-2的蛋白表達(dá) 免印跡疫結(jié)果顯示，PPL I (3、10 μmol/L) 作用48 h后，MC3T3-E1細(xì)胞中β-catenin和BMP-2的表達(dá)呈濃度依賴性地升高 (圖4)。

圖5PPL I影響MC3T3-E1細(xì)胞β-catenin與BMP-2蛋白表達(dá)水平(與對(duì)照組比較，**P<0.01)

討 論

骨質(zhì)疏松癥已經(jīng)成為世界范圍內(nèi)的一個(gè)嚴(yán)重問題。其發(fā)病率高居各種疾病的第七位 ，且呈現(xiàn)出逐年增高趨勢(shì)，該病在65歲以上老年人群中的發(fā)病率≥50%[4-6]。骨質(zhì)疏松早期通常沒有明顯的臨床表現(xiàn)，假如不引起重視，隨著病情的進(jìn)展可引發(fā)疼痛、脊柱變形和骨折等情況。其嚴(yán)重并發(fā)癥是骨折，常見的骨折部位是腰背部、髖部和手臂，致殘致死率高，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。骨質(zhì)疏松癥的防治已經(jīng)成為一個(gè)亟待解決的問題。

重樓是我國(guó)的傳統(tǒng)藥材，是云南白藥的主要成分之一，在消腫止痛與抗跌打損傷方面有良效。藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)本品提取物有止血、抗炎、鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛等功效[1]。重樓中含量最為豐富的一種成分是甾體皂苷，其數(shù)量約占所有化合物的80%。因此，我們認(rèn)為：重樓皂苷不僅能治療運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)的損傷，而且可能防治骨質(zhì)疏松癥的進(jìn)展。

該實(shí)驗(yàn)中，MTT結(jié)果顯示：PPL I可時(shí)間、濃度依賴性地促進(jìn)成骨樣細(xì)胞MC3T3-E1增殖。EdU試驗(yàn)結(jié)果也再次提示PPL I可有效地促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞增殖。接著，我們通過檢測(cè)ALP的變化來研究PPL I調(diào)節(jié)MC3T3-E1細(xì)胞的成骨活性的作用。觀察到，PPL I明顯地升高了細(xì)胞中的ALP活性。成骨細(xì)胞，在骨基質(zhì)的合成、分泌和礦化扮演了重要角色，是骨發(fā)生與形成的主要功能細(xì)胞。茜素紅染色實(shí)驗(yàn)表明，PPL I可以顯著地促進(jìn)成骨細(xì)胞成熟，表現(xiàn)為鈣結(jié)節(jié)形成增多。上述實(shí)驗(yàn)表明，PPL I影響調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的增殖與成熟有可能是重樓修復(fù)骨骼與肌肉損傷的機(jī)制之一。接著，本實(shí)驗(yàn)采用分子生物學(xué)手段，觀察與研究PPL I究竟是怎樣影響MC3T3-E1細(xì)胞的增殖及分化，以便為重樓與重樓皂苷未來應(yīng)用于防治骨質(zhì)疏松的領(lǐng)域，提供一定的理論基礎(chǔ)。

Wnt/β-catenin信號(hào)通路在骨形成及骨代謝中發(fā)揮了重要作用：β-catenin一旦從細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入到細(xì)胞核內(nèi)，即可激活Wnt通路下游的一系列靶基因，隨后十分重要地參與調(diào)控成骨細(xì)胞的增殖、分化與成熟[7-9]。骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs)，可調(diào)控成骨細(xì)胞的增殖、分化和凋亡，能夠誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，十分重要地參與調(diào)控成骨細(xì)胞的分化過程[10-12]。免疫印跡結(jié)果表明，PPL I明顯地促進(jìn)了MC3T3-E1細(xì)胞中β-catenin與BMP-2的蛋白表達(dá)。提示PPL I促進(jìn)成骨樣細(xì)胞MC3T3-E1增殖的作用機(jī)制之一與其影響Wnt/β-catenin與BMP-2的通路有關(guān)。

綜上所述，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PPL I可促進(jìn)成骨樣細(xì)胞MC3T3-E1的增殖與分化，并上調(diào)其成骨活性；PPL I升高了β-catenin和BMP-2的蛋白表達(dá)。參考文獻(xiàn)以及實(shí)驗(yàn)結(jié)果：成骨細(xì)胞在運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)損傷修復(fù)中發(fā)揮了重要作用。我們認(rèn)為PPL I發(fā)揮促損傷修復(fù)的可能作用機(jī)制之一在于，它能促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖與分化。盡管，PPL I的骨保護(hù)作用仍需進(jìn)一步闡明，然而本研究結(jié)果為PPL I在運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)的損傷修復(fù)以及抗骨質(zhì)疏松中的應(yīng)用提供了一定實(shí)驗(yàn)線索與依據(jù)。