孫 強(qiáng)，李艷琴，何寶明

陜西省漢中市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科 (漢中 723000)

丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV)感染是在世界范圍內(nèi)廣泛分布的傳染性疾病，衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)顯示全球感染者數(shù)量約1.85億，感染率2.8%，且每年約35萬人因此發(fā)生死亡，亞太地區(qū)HCV患病率為0.1%～4.7%，其中我國丙型肝炎患者數(shù)量最多，共計(jì)約1000萬人[1-3]。隨著病情進(jìn)展，約一半HCV感染者可逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)槁愿窝咨踔烈鸶斡不蚋渭?xì)胞癌，我國HCV主要傳播途徑為血液和血制品，抗-HCV抗體檢測是目前早期診斷和血液篩查主要手段，不僅有利于切斷輸血傳播途徑和保障臨床用血安全，還可加強(qiáng)HCV感染者早期防治，故加強(qiáng)檢測質(zhì)量管理極為重要[4-5]。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enayme liked immunosorbent assay，ELISA)、化學(xué)發(fā)光法及時(shí)間分辨熒光免疫分析法等均是抗HCV檢測常用方法且多采用間接ELISA法，但因抗原制備和試劑生產(chǎn)工藝影響，常存在假陽性和漏檢等局限性，雙抗原夾心法是以酶標(biāo)記抗原代替間接法中酶標(biāo)記二抗的檢測方法，可檢測包括IgG和IgM在內(nèi)的總抗體，近年來在乙肝抗體、梅毒抗體及HIV抗體中均成功應(yīng)用[6-9]。本文主要研究雙抗原夾心法和間接法檢測丙型肝炎病毒抗體的結(jié)果，為尋找更為準(zhǔn)確有效的檢測方法提供依據(jù)。

資料與方法

1 研究對(duì)象 選取2018年4月至2019年4月我院輸血前、術(shù)前及孕前擬行HCV抗體檢測的患者1674例，其中男性851例(50.84%)，女性823例(49.16%)，年齡18～94歲，平均(52.71±13.06)歲。

2 試劑和儀器 addcare ELISA 1100全自動(dòng)酶免分析系統(tǒng)(山東煙臺(tái)生物科技有限公司)；Genesis RSP150加樣系統(tǒng)(瑞士TECEN公司)；北京拓普DEM-3洗板機(jī)；間接法ELISA診斷試劑盒(上?？迫A，生產(chǎn)批號(hào)為201709422；英科新創(chuàng)，批號(hào)為2016047583)；雙抗原夾心ELISA試劑(北京萬泰，批號(hào)為CS20150928)，所有試劑盒均經(jīng)衛(wèi)生部門檢驗(yàn)合格且在有效期內(nèi)。且均在有效期內(nèi)使用。

3 研究方法

3.1 樣本采集：采用促凝管取患者空腹肘靜脈血5 ml，以3000 r/min離心10 min后取上清分裝于無熱源的EP管中-20℃保存。

3.2 精密度驗(yàn)證：取高、中、低三個(gè)濃度樣本重復(fù)檢測20次(孔)并計(jì)算吸光度值/臨界值(S/CO)均值、標(biāo)準(zhǔn)差及批內(nèi)變異系數(shù)；另取高、中、低三個(gè)濃度樣本檢測單孔，重復(fù)檢測20 d并計(jì)算S/CO均值、標(biāo)準(zhǔn)差及批間變異系數(shù)。

3.3 檢測原理：①間接ELISA法：提前將HCV抗原肽片段包被于聚苯乙烯微孔板微孔板，實(shí)驗(yàn)時(shí)向微孔中分別加入樣本，其中的抗-HCV抗體會(huì)與相應(yīng)抗原結(jié)合，然后加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的親和素為示蹤劑，充分洗滌后加入3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)顯色，TMB在HRP酶催化下顯示為藍(lán)色，繼而酸化成黃色，且顏色的深淺與樣本中抗-HCV抗體濃度呈正相關(guān)性，采用用酶標(biāo)儀在450 nm處測定S/CO即可計(jì)算樣品濃度。②雙抗原夾心ELISA法：用純化抗-HCV抗體包被微孔板，然后向包被單抗的微孔中依次加入HCV抗原肽片段，再與HRP標(biāo)記的HCV抗原結(jié)合，形成抗原-抗體-酶標(biāo)抗原復(fù)合物，經(jīng)徹底洗滌后加入TMB顯色，先HRP酶催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，最終在酸的作用下轉(zhuǎn)化成黃色，且顏色深淺與樣品中抗-HCV抗體表達(dá)水平呈正相關(guān)，用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測定S/CO并計(jì)算樣品濃度。

3.4 檢測過程：將所有試劑和樣本緩慢恢復(fù)至室溫(18～25℃)，設(shè)置7個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣品孔，分別加入100μl按比例稀釋的不同標(biāo)品，零孔中加100 μl標(biāo)準(zhǔn)品，其它孔中加入100 μl檢測樣品，酶標(biāo)板加上覆膜后37℃反應(yīng)2 h，去液并甩干后再向各孔加檢測溶液1工作液100 μl，在相同條件下反應(yīng)1 h，甩干孔內(nèi)液體并用350 μl洗滌液浸泡1～2 min后進(jìn)行充分洗滌3次，最后1次洗滌時(shí)需將孔內(nèi)洗滌液完全甩干，完成后每孔加檢測溶液2工作液100 μl，酶標(biāo)板加上覆膜后在37℃下反應(yīng)30 min，之后重復(fù)甩干、洗板5次，再向各孔加入90 μl底物溶液，酶標(biāo)板加上覆膜后在37℃下避光顯色反應(yīng)，充分顯色后所有孔加入終止液50 μl終止反應(yīng)。確認(rèn)酶標(biāo)板底無水滴且孔內(nèi)無氣泡后立即在450 nm波長用酶標(biāo)儀測量各孔S/CO值即為抗-HCV抗體表達(dá)水平。

3.5 確證實(shí)驗(yàn)：三種檢測試劑種任意兩種陽性為陽性，單一試劑陽性者進(jìn)行核酸檢測(NAT)陽性為陽性，否則均為陰性，計(jì)算間接ELISA法和雙抗原夾心ELISA法對(duì)HCV檢出率并比較兩種檢測方法靈敏度和特異度。

結(jié) 果

1 三種試劑對(duì)HCV檢測結(jié)果比較 上?？迫A間接法、英科新創(chuàng)間接法和北京萬泰雙抗原夾心法HCV檢出率分別為4.30%、4.06%和3.52%(P>0.05)，三種檢測試劑S/CO比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 三種試劑對(duì)HCV檢測結(jié)果比較

2 間接ELISA法診斷準(zhǔn)確性 以確證實(shí)驗(yàn)結(jié)果為“金標(biāo)準(zhǔn)”，間接ELISA法檢測HCV靈敏度為94.00%，特異度為98.27%，陽性預(yù)測值為62.67%，陰性預(yù)測值為99.81%，準(zhǔn)確率為98.15%，一致性Kappa為0.743。

表2 間接ELISA法診斷準(zhǔn)確性分析(例)

3 雙抗原夾心ELISA法診斷準(zhǔn)確性 以確證實(shí)驗(yàn)結(jié)果為“金標(biāo)準(zhǔn)”，雙抗原夾心ELISA法檢測HCV靈敏度為97.91%，特異度為99.26%，陽性預(yù)測值為79.66%，陰性預(yù)測值為99.94%，準(zhǔn)確率為99.22%，一致性Kappa為0.875。

表3 雙抗原夾心ELISA法診斷準(zhǔn)確性分析(例)

4 間接法和雙抗原夾心法檢測HCV一致性 McNemar檢驗(yàn)結(jié)果顯示，間接法和雙抗原夾心法檢測HCV結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.095，P<0.05)。

表4 間接法和雙抗原夾心法檢測HCV一致性分析(例)

討 論

早期HCV感染常缺少典型癥狀，容易在不知情下通過手術(shù)或獻(xiàn)血等途徑造成傳播和感染，對(duì)人類健康造成巨大危害，因此輸血前、術(shù)前和孕前HCV檢測已在各級(jí)醫(yī)院普遍展開，目前臨床常用檢測方法包括核酸擴(kuò)增試驗(yàn)法、化學(xué)發(fā)光法以ELISA法等[10]。由于HCV基因序列突變而導(dǎo)致編碼的氨基酸序列大幅度改變，且國內(nèi)感染者常為多種基因系HCV混合感染，導(dǎo)致核酸擴(kuò)增試驗(yàn)早期診斷效果欠佳；化學(xué)發(fā)光法敏感性及特異性較高且檢測速度快，但成本偏高，難以作為常規(guī)檢測方法開展[11-12]。

ELISA法對(duì)HCV抗體檢出率可達(dá)99.0%，其中間接ELISA法是目前國內(nèi)外抗-HCV抗體檢測應(yīng)用最廣泛的方法，但容易受污染出現(xiàn)假陽性，且采用間接法原理檢測的ELISA診斷試劑盒為人工合成或基因工程制造的固相多肽抗原，檢測結(jié)果常因生產(chǎn)廠商不同而存在明顯差異[13-14]。我國《血站操作技術(shù)規(guī)程》規(guī)必須采用兩家ELISA抗體診斷試劑對(duì)獻(xiàn)血者進(jìn)行篩查，目前常用抗原包括HCV-core、NS3、NS4及NS5等，但由于間接法本身的局限性導(dǎo)致仍難以完全避免假陽性和漏檢發(fā)生，為避免血液資源浪費(fèi)和防止HCV經(jīng)輸血傳播，尋找更為準(zhǔn)確有效的HCV篩查方法勢在必行[15-16]。隨著丙型肝炎重組抗原技術(shù)進(jìn)步，雙抗原夾心法作為新型檢測手段近年來也逐漸推廣，雖然與間接法基本原理均為免疫性診斷，但檢測過程和所用試劑盒不同[17]。本研究比較兩種檢測方法三種ELISA診斷試劑對(duì)HCV檢出率顯示，上?？迫A間接法、英科新創(chuàng)間接法和北京萬泰雙抗原夾心法檢出率分別為4.30%、4.06%和3.52%且三種檢測試劑S/CO無明顯差異，表明不同試劑對(duì)HCV檢出率基本相同，但由于假陽性和假陰性存在，此結(jié)果尚不足以判斷各種試劑優(yōu)劣。

間接ELISA法采用HRP標(biāo)記抗-IgG抗體為第二抗體酶結(jié)合物，因血清中IgG產(chǎn)生的時(shí)間相對(duì)較晚，故而用于HCV早期篩查和診斷存在一定漏檢可能性，同時(shí)由于部分非特異性物質(zhì)吸附，檢測結(jié)果又可能產(chǎn)生假陽性[18]。隨著基因工程應(yīng)用和生產(chǎn)工藝改進(jìn)，ELISA診斷試劑盒質(zhì)量不斷提升，但由于窗口期和患者免疫功能影響，仍難以完全避免漏檢情況發(fā)生[19]。與間接ELISA法相比，雙抗原夾心ELISA法檢測抗-HCV抗體包括IgG和IgM的總抗體，且反應(yīng)時(shí)不受IgG亞型影響，有利于縮短HCV感染“窗口期”，提升早期感染患者檢出率，同時(shí)雙抗原夾心法采用兩種重組抗原分別標(biāo)記生物素及吖啶酯，可有效減少類風(fēng)濕因子及非特異抗體的干擾，從而減少假陽性產(chǎn)生[20]。陜柏峰[21]等研究顯示雙抗原夾心ELISA法檢測HCV結(jié)果與確證實(shí)驗(yàn)符合率達(dá)96.60%，假陽性率較間接法明顯降低且稀釋實(shí)驗(yàn)理論檢測下限≥0.007NCU/ml。周齊洋等[20]研究認(rèn)為雙抗原夾心ELISA法特異性和早期感染監(jiān)測能力明顯優(yōu)于間接ELISA法，因此有望成為HCV檢測主要方法。本研究結(jié)果顯示，間接法和雙抗原夾心法用于HCV檢測靈敏度分別為94.00%和97.91%，特異度為分別為98.27%和99.26%，陽性預(yù)測值分別為62.67%為79.66%，陰性預(yù)測值分別為99.81%和99.94%，準(zhǔn)確率分別為98.15%和99.22%，一致性Kappa為0.743和0.875，可見雙抗原夾心ELISA法在靈敏度和特異度方面均具有一定優(yōu)勢，診斷準(zhǔn)確率較間接法明顯提升，用于早期感染診斷可有效避免漏診或誤診，對(duì)及時(shí)干預(yù)和改善患者預(yù)后具有重要意義。周奕等[22]對(duì)198例慢性丙型肝炎患者臨床資料進(jìn)行研究顯示，HCV感染途徑包括輸血、靜脈藥癮和性接觸等，且輸血為主要傳播方式。因此雙抗原夾心ELISA法用于血液樣品篩查則有利于減少漏檢和假陽性，及避免血液資源浪費(fèi)，又可有效控制HCV經(jīng)輸血途徑傳播，從而降低感染率和控制疾病流行。此外本研究采用McNemar檢驗(yàn)比較雙抗原夾心ELISA法和間接ELISA法對(duì)HCV檢出率一致性顯示，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明雙抗原夾心法用于HCV檢測較間接法具有較大優(yōu)勢，可明顯提升HCV早期篩查和診斷準(zhǔn)確性。

綜上所述，雙抗原夾心ELISA法用于HCV檢測靈敏度和特異度均明顯高于間接ELISA法，對(duì)控制HCV感染和傳播具有較高臨床價(jià)值和應(yīng)用前景。