王 晶，張 珍，曹雅男，滕艷杰△

(牡丹江醫(yī)學(xué)院:1.醫(yī)藥研究中心；2.第一臨床醫(yī)學(xué)院，黑龍江牡丹江 157011)

心血管疾病是全球死亡的常見原因之一,近年來我國(guó)心血管病疾病的患病率和病死率逐年上升，心血管病已成為我國(guó)居民的首位死亡原因[1]。有研究表明，心肌肥厚是導(dǎo)致心血管疾病發(fā)生率和病死率增高的獨(dú)立危險(xiǎn)因子，是眾多心血管疾病的共同病理過程[2]，其發(fā)生機(jī)制尚未完全闡明，認(rèn)為與細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)失衡有密切關(guān)系。因此，抑制心肌肥厚對(duì)改善心臟損傷極其重要。線粒體是心肌細(xì)胞能量的來源，在細(xì)胞內(nèi)鈣的調(diào)節(jié)中起重要作用[3-4]。國(guó)外最新的研究結(jié)果表明，線粒體鈣單向轉(zhuǎn)運(yùn)體(mitochondrial calcium uniporter,MCU)是線粒體內(nèi)膜上的一個(gè)蛋白復(fù)合體，其成分由MCU、MCUb、MICU1 MICU2及EMRE構(gòu)成[5-6]，能夠介導(dǎo)Ca2+從細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入到線粒體基質(zhì)，在細(xì)胞內(nèi)Ca2+信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、Ca2+穩(wěn)態(tài)、線粒體能量代謝和細(xì)胞凋亡通路方面具有重要意義。異丙腎上腺素(isoproterenol，ISO)是β受體激動(dòng)劑，可以通過激活MAPK信號(hào)通路導(dǎo)致心肌肥厚，與手術(shù)造模方法相比較，皮下注射ISO對(duì)小鼠損傷小，動(dòng)物模型成功率高，同時(shí)也更加簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、可靠[7]。目前，MCU對(duì)心肌肥厚的作用研究多是通過體外實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)果，而在人體或動(dòng)物體內(nèi)MCU的作用研究較少，本實(shí)驗(yàn)旨在小鼠探討MCU基因敲除對(duì)ISO誘導(dǎo)心肌肥厚損傷的影響，為MCU在心肌肥厚損傷中發(fā)揮保護(hù)作用提供更多的理論依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1主要試劑與儀器 ISO(上海阿拉丁公司)；生理鹽水、Masson染色試劑盒(南京建成試劑公司)；RNA提取試劑盒(美國(guó)Omega試劑公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Roche公司)；蘇木素-伊紅(HE)染色試劑(北京中生瑞泰公司)；Bcl-2、Bax、caspase-3、caspase-9-PCR引物(上海生工生物工程公司)；熒光定量PCR儀、S100 PCR自動(dòng)系列化分析儀及Molecular Imager 凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)；光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與處理 無特定病原體(SPF)級(jí)雄性CD1野生型小鼠及MCU基因敲除小鼠各16只，體質(zhì)量(30±5)g，鼠齡12周，由中國(guó)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院潘欣博士后贈(zèng)送，動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(軍)2012-0004。按照體質(zhì)量分為4組，每組8只。分別為正常對(duì)照組、野生造模組、敲除對(duì)照組和敲除造模組。參照文獻(xiàn)[7]方法操作，在禁食12 h后，根據(jù)體質(zhì)量，造模組小鼠皮下注射ISO 5 mg/kg，每天早晚各注射1次，間隔12 h，對(duì)照組小鼠以等容積的生理鹽水進(jìn)行皮下注射，各組連續(xù)注射14 d。試驗(yàn)結(jié)束后，采用頸椎脫臼法將小鼠處死，取心臟和肺稱質(zhì)量并記錄。隨后將小鼠各組部分心臟的心房切掉，然后再分離左心室和右心室，將分離的左心室裝入1.5 mL的EP管中并放在液氮中保存，最后按順序放入指定的盒子里并放入-80 ℃冰箱冷凍；各組另一部分小鼠的心臟放入裝有4%多聚甲醛溶液的5 mL EP管中固定，等待組織包埋。

1.2.2心質(zhì)量/體質(zhì)量比(HW/BW)、肺質(zhì)量/體質(zhì)量比(LW/BW)檢測(cè) 據(jù)測(cè)量的小鼠心質(zhì)量、肺質(zhì)量及體質(zhì)量，計(jì)算HW/BW、LW/BW。

1.2.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR 用RNA提取試劑盒提取各組小鼠心肌組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。PCR反應(yīng)體系包括cDNA 2.0 μL、SYBR Green Mix 9.0 μL、引物各0.8 μL和超純水7.4 μL，總體積20.0 μL。PCR反應(yīng)擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸10 s,共40個(gè)循環(huán)。計(jì)算Ct 值、 2-△△Ct值 。以β-actin為內(nèi)參,引物序列如表1。

表1 PCR擴(kuò)增引物序列

1.2.4HE染色 將多聚甲醛固定的心臟組織常規(guī)脫水，透明，石蠟包埋，用feica旋轉(zhuǎn)式切片機(jī)切片，厚度4 μm，行HE染色。步驟如下，65 ℃ 烘片4 h。將石蠟切片放入二甲苯溶液中，浸泡6 min后取出，再放入另1個(gè)二甲苯溶液中浸泡6 min。乙醇水化，蘇木素染劑浸泡10 min，鹽酸乙醇溶液浸泡3 s，蒸餾水稍洗20 s，0.04% 氨水溶液返藍(lán)30 s，伊紅染色，自來水沖洗，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。

1.2.5心肌纖維化的檢測(cè) 同1.5切片，進(jìn)行Masson染色。步驟如下，65 ℃ 烘片4 h。將石蠟切片放入二甲苯溶液中，浸泡6 min后，再放入另1個(gè)二甲苯溶液中浸泡6 min。切片放入 Bouin 液，然后放入37 ℃的溫箱內(nèi)2 h ，取出后用蒸餾水沖洗，至切片上的黃色消失。青石藍(lán)染色液滴染2 min后，自來水沖洗。蘇木素染色液滴染 2 min后，自來水沖洗。酸性乙醇分化20 s后，蒸餾水沖洗10 min。麗春紅滴染10 min，蒸餾水沖洗。磷鉬酸溶液處理10 min，直接滴入苯胺藍(lán)染色5 min。將切片用弱酸溶液處理 2 min,95% 乙醇快速脫水,100% 乙醇溶液反復(fù)浸泡3次，每次10 s，二甲苯溶液反復(fù)浸泡3次，每次2 min，最后中性樹脂封片。

2 結(jié) 果

2.1ISO誘導(dǎo)的心肌肥厚模型的鑒定

2.1.1小鼠HW/BW和LW/BW的改變 與各自對(duì)應(yīng)的對(duì)照組比較，兩造模組小鼠HW/BW、LW/BW均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與野生造模組比較，敲除造模組小鼠HW/BW、LW/BW明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖1。

2.1.2小鼠心肌肥厚標(biāo)志物表達(dá)的改變 與各自對(duì)應(yīng)的對(duì)照組比較，兩造模組小鼠ANP、BNP mRNA的表達(dá)均明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與野生造模組比較，敲除造模組小鼠ANP、BNP mRNA表達(dá)明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖2。

2.1.3小鼠心肌組織形態(tài)學(xué)的改變 正常對(duì)照組小鼠心肌組織心肌肌原纖維細(xì)胞排列整齊、致密、形態(tài)完整，細(xì)胞核及核仁結(jié)構(gòu)清晰；野生造模組小鼠肌絲排列紊亂、松散心肌細(xì)胞體積明顯增大，形態(tài)不規(guī)整，細(xì)胞核深染、增大、畸形，核仁模糊；與野生造模組比較，敲除造模組小鼠心肌組織病理改變更為明顯，見圖3。

2.2MCU基因敲除對(duì)ISO誘導(dǎo)小鼠心肌肥厚心肌纖維化的影響 正常對(duì)照組小鼠心肌組織膠原分布均勻，相鄰的膠原纖維網(wǎng)完好，膠原纖維的含量少；野生造模組心肌內(nèi)膠原纖維明顯增多，膠原纖維網(wǎng)斷裂，排列紊亂；與野生造模組比較，敲除造模組小鼠心肌纖維化面積明顯增加。見圖4。

A:LW/BW;B:HW/BW;a：P<0.05，b：P<0.01

圖1ISO對(duì)HW/BW和LW/BW的影響

A:ANP;B:BNP;a：P<0.05

圖2ISO對(duì)小鼠心肌肥厚標(biāo)志物表達(dá)影響

2.3MCU基因敲除對(duì)ISO誘導(dǎo)小鼠心肌肥厚凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響 與各自對(duì)應(yīng)的對(duì)照組比較，兩造模組小鼠Bax、caspase-3、caspase-9 mRNA的表達(dá)明顯升高，Bcl-2的表達(dá)明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與野生造模組比較，敲除造模組小鼠Bax、caspase-3、caspase-9的表達(dá)明顯升高，Bcl-2的表達(dá)明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖5。

A：正常對(duì)照組；B：野生造模組；C：敲除對(duì)照組；D：敲除造模組

圖3MCU基因敲除ISO誘導(dǎo)的小鼠心肌胞厚心肌組織形態(tài)學(xué)的影響(HE×100)

A：正常對(duì)照組；B：野生造模組；C：敲除對(duì)照組；D：敲除造模組

圖4MCU基因敲除對(duì)ISO誘導(dǎo)小鼠心肌肥厚心肌纖維化的影響 (Masson×100)

A:Bax;B:Bcl-2;C:caspase-3;D:caspase-9；a:P<0.05；bP<0.01

圖5MCU基因敲除對(duì)ISO誘導(dǎo)小鼠心肌肥厚凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響

3 討 論

心肌肥厚是各種生理或病理刺激下心臟的適應(yīng)性反應(yīng)，但是，慢性心肌肥厚會(huì)使心臟功能逐漸減退，并最終發(fā)展為心律失常、心力衰竭，甚至猝死[8]。隨著分子生物學(xué)時(shí)代的到來，心肌肥厚在基因水平上研究的不斷深入，多個(gè)基因被發(fā)現(xiàn)在心肌肥厚中發(fā)揮重要作用[9]。小鼠心肌肥厚模型的構(gòu)建主要有手術(shù)和藥物兩種方式，手術(shù)方式死亡率高、效率低，藥物方法更為簡(jiǎn)單、方便。ISO是兒茶酚胺類β腎上腺素受體激動(dòng)藥之一，半衰期相對(duì)較長(zhǎng)，能更真實(shí)的模擬自然病程，而且皮下注射ISO也更為簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)。研究表明，交感神經(jīng)系統(tǒng)的過度興奮，主要的原因是通過增加壓力/容量負(fù)荷而誘導(dǎo)心肌肥厚的發(fā)生發(fā)展。而在構(gòu)建心肌肥厚的動(dòng)物模型中也證明了這一點(diǎn)，使小鼠的交感神經(jīng)系統(tǒng)興奮也成為構(gòu)建小鼠心肌肥厚模型的主要方法[7,10-11]。

MCU基因敲除小鼠，除體形上較野生型小鼠小表型上與野生型小鼠幾乎沒有變化。基礎(chǔ)代謝方面MCU敲除小鼠同野生型小鼠一樣。在離體心臟缺血-再灌注損傷中，MCU敲除小鼠與野生型小鼠比較，梗死面積無差異，且功能損傷也無差異；但在骨骼肌上，表現(xiàn)為產(chǎn)能的缺陷[12]。隨后的研究表明野生型小鼠和MCU基因敲除小鼠心功能在靜息和應(yīng)激情況下，二者心功能正常[13]。但近年來也有報(bào)道顯示，在心肌細(xì)胞中，敲除MCU基因，可增加MCU復(fù)合體的活性，促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡，降低心肌功能[14-15]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組小鼠HW/BW、LW/BW明顯增加，ANP、BNP mRNA的表達(dá)升高，HE染色出現(xiàn)肌絲排列紊亂、形態(tài)不規(guī)整，證實(shí)本實(shí)驗(yàn)ISO誘導(dǎo)心肌肥厚造模成功。實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)ISO干預(yù)后，MCU基因敲除小鼠HW/BW、LW/BW較敲對(duì)照組增加，ANP、BNP mRNA的表達(dá)較敲除對(duì)照組均顯著升高；Masson染色出現(xiàn)心肌組織纖維化病變，膠原沉積顯著；與各自對(duì)照組比較，兩模型組Bax、caspase-3、caspase-9 mRNA的表達(dá)均上調(diào)，Bcl-2的表達(dá)下降，而與野生造模組比較，敲除造模組以上變化更明顯。提示MCU基因敲除可加重ISO誘導(dǎo)的心肌肥厚損傷，使心肌纖維化面積增加，并促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡，說明MCU具有保護(hù)心肌的作用。