溫 萍,陳盛鐸,王家瑞,車 巍,鄭 兵,梁海莉

(湖北省中醫(yī)院花園山院區(qū)肝病科,武漢 430061)

肝纖維化是因肝炎病毒、乙醇、毒素等引起免疫炎性損傷誘發(fā)的慢性漸變型疾病病理變化，以不可逆細(xì)胞外基質(zhì)堆積引起肝臟組織重塑為主要病理特點(diǎn)[1]。臨床數(shù)據(jù)顯示，多種慢性肝臟疾病常在發(fā)病早期不可反轉(zhuǎn)、反復(fù)刺激損傷時(shí)，最終發(fā)展成纖維化病理變化，進(jìn)而引發(fā)肝功能喪失，威脅生命，而及時(shí)的干預(yù)可有效抑制纖維化的發(fā)生發(fā)展[2]。然而，目前以抗有絲分裂藥物秋水仙堿為主的抗纖維化藥物因?yàn)槠錈o(wú)限制性的細(xì)胞毒作用在臨床應(yīng)用中受限[3]。同時(shí)，研究證實(shí)，在肝纖維化發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，以轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)為主的由多種免疫細(xì)胞和肝細(xì)胞合成分泌的炎性相關(guān)細(xì)胞因子參與調(diào)節(jié)纖維化病程，促使炎性反應(yīng)向纖維化形態(tài)轉(zhuǎn)化[3-4]。且免疫調(diào)節(jié)劑在纖維化臨床干預(yù)治療中具有良好的應(yīng)用前景[5]。

傳統(tǒng)中草藥金蟬花(cordyceps cicadae)中提取的金蟬花多糖(cicadas polysaccharides)具有提高機(jī)體免疫力的功能，可在體外同時(shí)激活T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞，并促進(jìn)其增殖[6]。同時(shí)，其可有效減少腎臟細(xì)胞外基質(zhì)的合成，抑制腎纖維化[7]。金蟬花多糖安全性高，對(duì)正常細(xì)胞影響小[8]，因而，金蟬花多糖在纖維化治療中具有廣闊前景。然而，目前對(duì)金蟬花多糖的作用效應(yīng)及其機(jī)制尚不明確[8-9]。因此，本研究擬觀察金蟬花多糖對(duì)皮下注射四氯化碳誘導(dǎo)小鼠急性肝纖維化的保護(hù)作用，并探討其對(duì)Tregs的影響，為金蟬花多糖在臨床應(yīng)用于急性肝纖維化提供實(shí)驗(yàn)研究依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)藥物 金蟬花多糖為陜西斯諾特生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，含量65%，中國(guó)藥典CP2010，貨號(hào)snt3688。實(shí)驗(yàn)前用磷酸鹽緩沖液(PBS)配制成200 mg/mL溶液。秋水仙堿為西雙版納州醫(yī)藥有限責(zé)任公司產(chǎn)品，中國(guó)藥典CP2010，國(guó)藥準(zhǔn)字H53021369。實(shí)驗(yàn)前PBS配制成0.01 mg/mL溶液。

1.1.2動(dòng)物和分組 無(wú)特定病原體(SPF)級(jí)C57BL/6雄性小鼠90只(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)中心，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK20150012)，依體質(zhì)量均衡分組為：正常組，模型組，秋水仙堿組(0.1 mg/kg)和金蟬花多糖低劑量(0.5 mg/kg)、中劑量(1.0 mg/kg)和高劑量(2.0 mg/kg)組，每組15只。由于四氯化碳模型毒性高，致死性高(雖然本實(shí)驗(yàn)中動(dòng)物死亡較少)，其模型個(gè)別出現(xiàn)狀態(tài)較差，可能致使個(gè)別四氯化碳模型小鼠在給予干預(yù)后無(wú)明顯的變化，雖然總體統(tǒng)計(jì)有顯著性差異，但動(dòng)物實(shí)驗(yàn)差異大，因此在保證數(shù)據(jù)結(jié)果符合最初統(tǒng)計(jì)分析的基礎(chǔ)上，對(duì)個(gè)別小鼠數(shù)據(jù)進(jìn)行剔除，均保留10只小鼠作為最終數(shù)據(jù)展示。

1.1.3試劑 四氯化碳購(gòu)自德州潤(rùn)昕實(shí)驗(yàn)儀器有限公司，Masson染液購(gòu)自武漢塞維爾生物技術(shù)有限公司，小鼠血漿丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)和組織羥脯氨酸水平檢測(cè)試劑盒購(gòu)自天津碧云天生物技術(shù)有限公司，小鼠γ-干擾素(IFN-γ)、白細(xì)胞介素-4(IL-4)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)和α-肌動(dòng)蛋白(α-SMA)ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物技術(shù)有限公司，小鼠單核淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司，小鼠CD4-別藻藍(lán)蛋白(APC)和CD25-異硫氰酸熒光素(FITC)流式抗體購(gòu)自北京BioLegend公司。

1.1.4儀器 正置熒光顯微鏡和相差顯微鏡(日本 Olymics公司)；低溫高速離心機(jī)(德國(guó)Thermo Fisher公司);C6流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)；多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)BioTek公司)。

1.2方法

1.2.1模型建立與給藥 模型組、秋水仙堿組和金蟬花多糖組通過(guò)皮下注射四氯化碳(1.0 mg/kg)建立小鼠肝纖維化模型，每周2次，共7周。正常組同時(shí)給予橄欖油。隨后，秋水仙堿組灌胃給予秋水仙堿溶液300 μL，各金蟬花多糖組灌胃均給予金蟬花多糖300 μL，2次/d，共3周。期間小鼠自由飲食。

1.2.2體質(zhì)量、存活率和肝指數(shù)分析 實(shí)驗(yàn)期間，記錄小鼠體質(zhì)量，分析給藥前后小鼠體質(zhì)量變化，并于實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，處死小鼠去除肝臟，稱質(zhì)量后計(jì)算肝指數(shù)，公式為：肝指數(shù)=肝臟濕質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g)。

1.2.3羥脯氨酸水平檢測(cè) 稱取各組小鼠肝臟100 mg，加入濃鹽酸后高壓溶解，并用1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH=7.0。采用氯胺-T法檢測(cè)羥脯氨酸水平，于560 nm檢測(cè)吸光度(A)值，以每克肝組織中羥脯氨酸含量表示(μg/g)。

1.2.4組織病理學(xué)檢測(cè) 各組小鼠肝組織置于4%多聚甲醛溶液中48 h，常規(guī)石蠟包埋并5 μm切片后，進(jìn)行Masson染色。膠原沉積程度用Image-Pro Plus 6.0軟件分析。

1.2.5外周血ALT、AST水平檢測(cè) 眼球取血800 μL于肝素鈉抗凝采血管中，分取100 μL后3 000 r/min離心取血漿，吸取50 μL置于玻璃試管中，按照試劑盒說(shuō)明檢測(cè)血漿ALT和AST水平。

1.2.6外周血IFN-γ、IL-4和TGF-β水平檢測(cè) 取100 μL新鮮分離的血漿，按照ELISA試劑盒說(shuō)明，檢測(cè)肝組織勻漿液中IFN-γ、IL-4和TGF-β的水平。

1.2.6肝組織α-SMA、Ⅰ型膠原、TGF-β mRNA水平檢測(cè) 采用TRIzol一步法提取100 mg肝組織總RNA，并使用NanoDrop2000對(duì)RNA濃度和純度進(jìn)行檢測(cè)。參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Thermo fisher公司)操作步驟說(shuō)明將500 ng總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以TE溶液稀釋cDNA至10 ng/μL，按照RT-qPCR說(shuō)明，取10 ng cDNA作為反應(yīng)模版，15 μL PCR反應(yīng)體系，反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)35次；72 ℃終延伸5 min。擴(kuò)增結(jié)束后制作融解曲線，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參，計(jì)算α-SMA、Ⅰ型膠原和TGF-β mRNA水平。引物序列:TGF-β，正向5′-AAA ATC AAG TGT GGA GCA AC-3′，反向5′-CCA CGT GGA GTT TGT TAT CT-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物大小 224 bp；α-SMA，正向5′-ATC TGG CAC CAC TCT TTC TA-3′，反向5′-GTA CGT CCA GAG GCA TAG AG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物大小191 bp；Ⅰ型膠原，正向5′-GCT CCT CTT AGG GGC CAC T-3′，反向5′-CCA CGT CTC ACC ATT GGG G-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物大小103 bp；GAPDH，正向5′-AGG TCG GTG TGA ACG GAT TTG-3′，反向5′-TGT AGA CCA TGT AGT TGA GGT CA-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物大小123 bp。

1.2.7外周血Tregs比例分析 取加入400 μL單核淋巴細(xì)胞分離液的流式管，傾斜緩慢加入400 μL抗凝血于流式管中，3 000 r/min離心取中間單核淋巴細(xì)胞層于新流式管中，PBS洗2次后，以400 μL PBS重懸，每100微升分為4管，分別加入PBS、CD4-APC、CD25-FITC和CD4-APC與CD25-FITC流式抗體各2 μL。室溫避光孵育30 min，PBS洗2次后，以100 μL PBS重懸，上機(jī)檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1金蟬花多糖對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)肝纖維化小鼠體質(zhì)量和存活率的影響 在給予四氯化碳7周時(shí)，模型組小鼠體質(zhì)量明顯低于正常組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；灌胃至10周，模型組體質(zhì)量明顯低于秋水仙堿組、金蟬花多糖中劑量、金蟬花多糖高劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠體質(zhì)量變化情況

a：P<0.05，與正常組比較；b：P<0.05，與模型組比較

A:正常組；B：模型組；C：秋水仙堿組；D：金蟬花多糖低劑量組；E：金蟬花多糖中劑量組；F：金蟬花多糖高劑量組

圖1金蟬花多糖對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)肝纖維化小鼠肝組織形態(tài)和病理特征的影響(×100)

2.2金蟬花多糖對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)肝纖維化小鼠肝指數(shù)和組織重構(gòu)的影響 模型組肝指數(shù)明顯高于正常組。通過(guò)Masson染色發(fā)現(xiàn)，模型組肝組織切片的藍(lán)色膠原沉積(黑色箭頭所指)面積，即纖維化比例較正常組更大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。金蟬花多糖低、中、高劑量組肝指數(shù)均明顯低于模型組(P<0.05)，金蟬花多糖中、高劑量組纖維化比例明顯低于模型組(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與秋水仙堿組相比，金蟬花多糖中、高劑量組肝指數(shù)及纖維化比例明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2、圖1。

表2 各組小鼠肝指數(shù)和組織結(jié)構(gòu)情況

a：P<0.05，與正常組比較；b：P<0.05，與模型組比較；c：P<0.05，與秋水仙堿組比較

2.3金蟬花多糖對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)肝纖維化小鼠ECM的影響 模型組小鼠羥脯氨酸、α-SMA和Ⅰ型膠原均高于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。秋水仙堿組，金蟬花多糖中、高劑量組羥脯氨酸、α-SMA和Ⅰ型膠原均明顯低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與秋水仙堿組相比，金蟬花多糖高劑量組羥脯氨酸、α-SMA和Ⅰ型膠原明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 各組小鼠ECM的情況

a：P<0.05，與正常組比較；b：P<0.05，與模型組比較；c：P<0.05，與秋水仙堿組比較

2.4金蟬花多糖對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)肝外周血纖維化小鼠ALT、AST的影響 模型組小鼠外周血中ALT和AST水平明顯高于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；秋水仙堿組，金蟬花多糖中、高劑量組ALT和AST均明顯低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與秋水仙堿組相比，金蟬花多糖高劑量組ALT和AST明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 各組小鼠ALT/AST的情況

a：P<0.05，與正常組比較；b：P<0.05，與模型組比較；c：P<0.05，與秋水仙堿組比較

2.5金蟬花多糖對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)肝纖維化小鼠外周血IFN-γ、IL-4及Th1/Th2的影響 相比于正常組，模型組小鼠外周血中IFN-γ水平和Th1/Th2明顯降低，IL-4水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。金蟬花多糖中、高劑量組IFN-γ水平和Th1/Th2均明顯高于模型組(P<0.05)，IL-4水平明顯低于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與秋水仙堿組相比，金蟬花多糖中、高劑量組外周血IFN-γ、IL-4及Th1/Th2變化明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表5。

表5 各組小鼠外周血IFN-γ、IL-4及Th1/Th2的情況

a：P<0.05，與正常組比較；b：P<0.05，與模型組比較；c：P<0.05，與秋水仙堿組比較

表6 各組小鼠TGF-β和Tregs的情況

a：P<0.05，與正常組比較；b：P<0.05，與模型組比較；c：P<0.05，與秋水仙堿組比較

A:正常組；B：模型組；C：秋水仙堿組；D：金蟬花多糖低劑量組；E：金蟬花多糖中劑量組；F：金蟬花多糖高劑量組

圖2各組小鼠Tregs的流式細(xì)胞檢測(cè)

2.6金蟬花多糖對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)肝纖維化小鼠TGF-β和Tregs的影響 模型組小鼠外周血TGF-β水平和Tregs比例、肝臟組織TGF-β mRNA水平明顯高于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。金蟬花多糖中、高劑量組外周血TGF-β水平和Tregs比例、肝臟組織TGF-β mRNA水平均明顯低于模型組(P<0.05)。與秋水仙堿組相比，金蟬花多糖中、高劑量組外周血TGF-β水平和Tregs比例、肝臟組織TGF-β mRNA水平變化明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表6、圖2。

3 討 論

肝纖維化是臨床發(fā)生比例較高的威脅患者愈合和存活的重要病理變化之一，其多由毒性物質(zhì)、乙醇、藥物及病毒感染引起，病情發(fā)展迅速，短期造成肝組織壞死、硬化，引起肝功能喪失，嚴(yán)重威脅人類健康。然而，目前針對(duì)肝纖維化的治療缺乏有效的藥物，秋水仙堿作為可明顯抑制成纖維細(xì)胞增殖的藥物被普遍用于肝纖維化的治療，未能取得滿意的效果。金蟬花是一種菌體珍貴中藥材，其味甘性汗，無(wú)毒，具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎抗氧化等作用[6]。多糖作為金蟬花的主要活性物質(zhì)，已被證實(shí)是金蟬花藥理作用的主體，其可以增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬病原體，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫應(yīng)答[8]。早期研究證實(shí)，金蟬花多糖對(duì)肝纖維化的保護(hù)作用與其抗氧化、抑制NF-κB作用相關(guān)，且其對(duì)腎臟纖維化亦具有明顯的保護(hù)作用[10]。更有研究發(fā)現(xiàn)，纖維化與免疫炎性反應(yīng)平衡密切相關(guān)，其中，Th1、Th2反應(yīng)是介導(dǎo)纖維化病程的重要機(jī)制之一[11-12]。同時(shí)，金蟬花多糖的免疫調(diào)節(jié)作用是否影響Th1、Th2反應(yīng)平衡及在肝纖維化中的作用少見(jiàn)報(bào)道。

本研究通過(guò)皮下注射四氯化碳建立肝纖維化小鼠模型。灌胃給予金蟬花多糖3周后，明顯抑制肝纖維化小鼠體質(zhì)量減輕，提示其可能具有治療作用。隨即，實(shí)驗(yàn)中通過(guò)肝指數(shù)和組織病理切片Masson染色發(fā)現(xiàn)其可減輕肝纖維化引起的細(xì)胞外基質(zhì)堆積、重構(gòu)及肝指數(shù)增加。同時(shí)，通過(guò)檢測(cè)羥脯氨酸、α-SMA和Ⅰ型膠原等細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)單體[9]，金蟬花多糖具有顯著抑制其合成的作用。再者，金蟬花多糖顯著改善肝纖維化小鼠肝功能，降低AST和ALT。而且，其上調(diào)肝纖維化小鼠外周血中降低的Th1細(xì)胞因子IFN-γ，下調(diào)升高的Th2細(xì)胞因子IL-4，引起Th1/Th2平衡向Th1傾斜[13]，可能調(diào)控精氨酸的代謝，影響鳥(niǎo)氨酸循環(huán)，對(duì)抗纖維化病程[14]。這可能與金蟬花多糖下調(diào)肝纖維化小鼠外周血中升高的Tregs細(xì)胞及其細(xì)胞因子TGF-β有關(guān)。

綜上所述，本研究證明了金蟬花多糖對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠具有治療保護(hù)作用，且該效應(yīng)可能與免疫調(diào)節(jié)功能密切相關(guān)，包括下調(diào)Tregs細(xì)胞比例進(jìn)而降低促纖維化因子TGF-β水平，同時(shí)調(diào)控Th1/Th2反應(yīng)平衡，促進(jìn)Th1反應(yīng)及其相關(guān)效應(yīng)分子拮抗肝纖維化。目前，肝纖維化已經(jīng)成為危害國(guó)人健康的主要病因，秋水仙堿等傳統(tǒng)的臨床藥物雖然可改善患者生存率，但其不良反應(yīng)和非特異性可引起一系列后遺癥。本研究選取四氯化碳誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠模型為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)金蟬花多糖具有明顯的抑制肝纖維化作用，且優(yōu)于秋水仙堿。同時(shí)其安全性高，免疫調(diào)節(jié)功能顯著。因此，本研究為其應(yīng)用于肝纖維化治療提供一定新依據(jù)，具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值。