劉 艷，邵阿末，曾金艷，胡亞玲， 許 路△

(1.無錫衛(wèi)生高等職業(yè)技術(shù)學(xué)校，江蘇無錫 214028；2.江蘇省無錫市人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室 214023)

膠質(zhì)瘤是人顱內(nèi)常見的原發(fā)惡性腫瘤，其主要特點(diǎn)是腫瘤細(xì)胞彌漫性浸潤生長、邊界不清、無限增殖且有高度侵襲性，治療困難，嚴(yán)重影響人類的健康。盡管膠質(zhì)瘤的治療方法已取得很大的進(jìn)展，但膠質(zhì)瘤患者的5年生存率仍較低[1]。微RNA(microRNA，miRNA/miR)是一種內(nèi)源性長20～25個(gè)堿基的非編碼小分子單鏈RNA,可調(diào)控人類約1/3編碼蛋白的基因。越來越多的研究表明miRNA異常表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，miRNA既可作為癌基因促進(jìn)腫瘤生長，又可作為抑癌基因抑制腫瘤相關(guān)靶基因的表達(dá)[2]。近年來，與腫瘤相關(guān)的miRNA被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，多種miRNA參與膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展。其中，miR-186在包括膠質(zhì)瘤在內(nèi)的多種腫瘤中低表達(dá)，功能實(shí)驗(yàn)顯示其具有抑癌作用[3-5]。本研究通過生物信息學(xué)方法預(yù)測miR-186靶基因包括Smad6，并利用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)進(jìn)行活性檢測，通過分子生物學(xué)技術(shù)證實(shí)miR-186是否通過作用于Smad6對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖產(chǎn)生影響，以期解釋兩者在腦膠質(zhì)瘤發(fā)病機(jī)制中的作用。

1 材料與方法

1.1材料 人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞所；DMEM培養(yǎng)液、青-鏈霉素混合液購自美國HyClone公司；LipofectamineTM2000、TRIzol等試劑購自美國Invitrogen公司；M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、DNA聚合酶及緩沖體系購自美國Promega公司；dNTP和相關(guān)引物購自上海生工生物工程有限公司；苯甲基磺酰胺(PMSF)、RIPA裂解液、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳配制相關(guān)產(chǎn)品、CCK-8細(xì)胞毒性檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)研究所；胎牛血清購自以色列Biological Industries公司；GAPDH、Smad6抗體購自美國Cell Signaling公司；聚偏氟乙烯碳(PVDF)膜、化學(xué)發(fā)光底物ECL購自美國Millipore公司。野生型和突變型Smad6基因3′-非編碼區(qū)(3′-UTR)螢光素酶表達(dá)載體的構(gòu)建和測序由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司提供。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) U87細(xì)胞用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)傳代培養(yǎng)，定期觀察細(xì)胞密度，每2～3天換液1次。實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞均為對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組 制備終濃度為80 nmol/L miR-186 mimics 或80 nmol/L miR-186 inhibitor LipofectamineTM2000脂質(zhì)體復(fù)合物。細(xì)胞分別加入miR-186 mimcs 或miR-186 inhibitor脂質(zhì)體復(fù)合物(miR-186 mimcs 組、miR-186 inhibitor組)，同時(shí)設(shè)置對(duì)應(yīng)的對(duì)照組(分別為miR-186 mimcs NC組、miR-186 inhibitor NC組)。購建Smad6過表達(dá)質(zhì)粒(Smad6組)，以及對(duì)應(yīng)的對(duì)照質(zhì)粒(vector組),細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染相應(yīng)質(zhì)粒；用Smad6過表達(dá)質(zhì)?；?qū)φ战M質(zhì)粒與miR-186 mimics或miR-186 mimics NC共轉(zhuǎn)染，再分miR-186 mimics NC+vector組、miR-186 mimics NC+Smad6組、miR-186 mimcs+vector組和miR-186 mimics+Smad6組4個(gè)組。將對(duì)數(shù)生長期的U87細(xì)胞以每孔2 ×105/mL密度接種于六孔板，待細(xì)胞融合度達(dá)70%左右時(shí)行共轉(zhuǎn)染，置于37 ℃、含5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.2.4定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)檢測 收集各組細(xì)胞，用TRIzol裂解并提取各組細(xì)胞總RNA。應(yīng)用紫外分光光度計(jì)測定各組細(xì)胞的總RNA濃度，然后取2 μg總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，最后取1 μL cDNA模板于25 μL反應(yīng)體系中進(jìn)行RT-qPCR，其中分別以U6和GAPDH為內(nèi)參。擴(kuò)增條件為95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，采集數(shù)據(jù)，最后以2-ΔΔCt相對(duì)定量法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。具體引物序列見表1。

表1 引物名稱和序列

1.2.5Western blot檢測蛋白水平 收集各組細(xì)胞，用含1% PMSF的RIPA裂解液裂解細(xì)胞提取總蛋白，BCA 法檢測各組蛋白濃度，每組取等量蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離后并將其轉(zhuǎn)移至PVDF膜，以5%脫脂奶粉-TBST封閉液封閉1 h，一抗4 ℃孵育過夜， TBST洗3遍，HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h，TBST洗3遍，最后掃描PVDF膜并進(jìn)行結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析，其中以GAPDH作為內(nèi)參。

1.2.6CCK-8法檢測細(xì)胞活力 將細(xì)胞按5×103密度接種于96孔板中，每孔加入10 μL CCK-8試劑，37 ℃條件下孵育2 h后酶標(biāo)儀檢測各孔在490 nm波長下的吸光度(A)值。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔取平均值，另設(shè)單孔作為空白對(duì)照。細(xì)胞活力(%)=(檢測時(shí)間點(diǎn)A值-0 hA值)/(0 hA值-空白對(duì)照A值)×100%。

1.2.7集落形成實(shí)驗(yàn) 計(jì)數(shù)細(xì)胞懸液，將細(xì)胞接種于6孔板中(每孔1×103個(gè)細(xì)胞)，置細(xì)胞于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3周，除去培養(yǎng)液，用PBS洗滌2次，加4%多聚甲醛固定細(xì)胞15 min，然后去除固定液，加適量結(jié)晶紫染色15 min，然后洗去染色液，自然環(huán)境中干燥，最后計(jì)算集落形成率。集落形成率(%)=集落形成數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.8雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) 構(gòu)建野生型和突變型Smad6基因3′-UTR的報(bào)告基因質(zhì)粒(wt-Smad6和mut-Smad6)，依照轉(zhuǎn)染試劑說明將miRNA-186 mimics和wt-Smad6、miRNA-186 mimics NC和wt-Smad6、miRNA-186 mimics和mut-Smad6、miRNA-186 mimics NC和mut-Smad6、miRNA-186 inhibitor和wt-Smad6、miRNA-186 inhibitor NC 和wt-Smad6、miRNA-186 inhibitor 和mut-Smad6、miRNA-186 inhibitor NC和mut-Smad6 共轉(zhuǎn)染細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h后,根據(jù)試劑盒說明書建議的方法檢測上述各組細(xì)胞的相對(duì)熒光強(qiáng)度值。

2 結(jié) 果

2.1miR-186通過結(jié)合Smad6的3′-UTR調(diào)控Smad6的表達(dá) 通過生物信息學(xué)軟件預(yù)測miR-186與Smad6的3′-UTR區(qū)結(jié)合位點(diǎn)。熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相比miR-186 mimcs NC組，miR-186 mimcs組降低了野生型Smad6 3′-UTR轉(zhuǎn)染細(xì)胞的熒光素酶活性(P<0.05)；而與miR-186 inhibitor NC組比較，miR-186 inhibitor組 Smad6 3′-UTR轉(zhuǎn)染細(xì)胞的熒光素酶活性增強(qiáng)(P<0.05)。但在轉(zhuǎn)染突變型Smad6 3′-UTR的細(xì)胞中，相比各自對(duì)照組，miR-186 mimcs組、miR-186 inhibitor組都不能改變突變型Smad6 3′-UTR細(xì)胞的熒光素酶活性(P>0.05)，見圖1。

A：生物信息學(xué)軟件預(yù)測miR-186的下游靶基因；B、C：熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)；a：P<0.05

圖1miR-186與Smad6的靶向關(guān)系

2.2miR-186負(fù)向調(diào)控U87細(xì)胞Smad6蛋白的表達(dá)水平 qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，miR-186 mimics組miR-186的表達(dá)水平較miR-186 mimics NC組顯著升高(P<0.05)；miR-186 inhibitor組miR-186的表達(dá)水平較miR-186 inhibitor NC組明顯降低(P<0.05)，見圖2A。Western blot 實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果顯示，與miR-186 mimics NC組比較，miR-186 mimics 組Smad6蛋白表達(dá)水平下降(P<0.05)；與miR-186 inhibitor NC組比較，miR-186 inhibitor 組Smad6蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)，見圖2B、C。

A：PCR分析圖；B：Western blot;C:Western blot分析圖；1:miR-186 mimcs NC組；2:miR-186 mimcs組；3:miR-186 inhibitor NC組；4:miR-186 inhibitor組；a:P<0.05

圖2miR-186對(duì)U87細(xì)胞Smad6蛋白表達(dá)水平影響

A:轉(zhuǎn)染Smad6過表達(dá)質(zhì)粒后U87細(xì)胞Smad6 mRNA的表達(dá)變化；B:轉(zhuǎn)染Smad6過表達(dá)質(zhì)粒后U87細(xì)胞Smad6蛋白的表達(dá)變化；C:Smad6過表達(dá)質(zhì)?；?qū)φ战M質(zhì)粒與miR-186 mimics NC組或miR-186 mimics共轉(zhuǎn)染后Smad6蛋白的表達(dá)變化；1：miR-186 mimics NC+verctor組；2：miR-186 mimics+vector組；3：miR-186 mimics NC+Smad6組；4：miR-186 mimics+Smad6組；a:P<0.05

圖3Smad6過表達(dá)恢復(fù)miR-186對(duì)Smad6蛋白表達(dá)的抑制作用

A:CCK-實(shí)驗(yàn)；B：細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)及其定量分析；1：miR-186 mimics NC+verctor組；2：miR-186 mimics+vector組；3：miR-186 mimics+Smad6組；4：miR-186 mimics NC+Smad6組；a:P<0.05,b:P<0.01

圖4miR-186靶向Smad6對(duì)U87細(xì)胞增殖的影響

2.3Smad6過表達(dá)可恢復(fù)miR-186對(duì)Smad6的抑制作用 U87細(xì)胞轉(zhuǎn)染Smad6質(zhì)粒后，Smad6 mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)均增加(P<0.05)，見圖3。

2.4miR-186靶向Smad6抑制U87細(xì)胞增殖 CCK-8檢測結(jié)果顯示，與miR-186 mimics NC+vector組比較，miR-186 mimics+vector組U87細(xì)胞增殖能力明顯降低，miR-186 mimics NC+Smad6組細(xì)胞的增殖能力顯著升高(P<0.05)；與miR-186 mimics+vector組比較，miR-186 mimics+Smad6組細(xì)胞的增殖能力顯著升高(P<0.05)，見圖1A。細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)顯示，與mimics NC+vector組相比，miR-186 mimics+vector組U87細(xì)胞克隆形成率明顯降低，miR-186 mimics NC+Smad6組細(xì)胞克隆形成率顯著升高(P<0.05)；與miR-186 mimics+vector組相比，miR-186 mimics+Smad6組細(xì)胞克隆形成率顯著升高(P<0.05)，見圖4。

3 討 論

膠質(zhì)瘤具有高發(fā)病率和低生存率的特點(diǎn)[6]。雖然膠質(zhì)瘤的手術(shù)、放化療等治療技術(shù)已取得長足的發(fā)展，但膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后仍不理想。隨著膠質(zhì)瘤分子學(xué)的研究，發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤的本質(zhì)是一種多基因異常疾病，包括抑癌基因的突變?nèi)笔Ъ霸┗虻倪^表達(dá)。因此尋求新的分子基因靶點(diǎn)成為治療膠質(zhì)瘤新的突破點(diǎn)。

miRNAs具有高度的保守性、組織特異性，可通過3′-UTR堿基互補(bǔ)的方式識(shí)別特異靶基因，在轉(zhuǎn)錄后水平降解靶基因mRNA或抑制靶基因的翻譯，從而在細(xì)胞增殖、分化、凋亡中發(fā)揮重要作用。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，在膠質(zhì)瘤中存在大量miRNA的異常表達(dá)，并參與了膠質(zhì)瘤的增殖、凋亡與侵襲等生物功能[7]。BAO等[8]研究表明miR-519a在膠質(zhì)瘤標(biāo)本和細(xì)胞系中多表達(dá)降低，低表達(dá)的miR-519a與膠質(zhì)瘤患者較差的預(yù)后呈正相關(guān)。XUE等[9]研究發(fā)現(xiàn)，與正常組織相比，膠質(zhì)瘤組織中miR-221/222的表達(dá)明顯升高，惡性程度高的膠質(zhì)瘤組織的表達(dá)高于惡性程度低的組織，高表達(dá)miR-221/222的膠質(zhì)瘤患者生存期較短。miR-186作為miRNAs中的一員，近年已成為研究的熱點(diǎn),CAI等[10]研究發(fā)現(xiàn)miR-186在口腔鱗狀細(xì)胞癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)明顯降低，發(fā)揮抑癌作用。SU等[11]實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明與正常細(xì)胞系相比，miR-186在人皮膚惡性黑色素瘤細(xì)胞系中的表達(dá)明顯降低，過表達(dá)后可抑制腫瘤細(xì)胞增殖，同時(shí)也降低細(xì)胞的遷移和侵襲能力。另有研究表明該基因在膠質(zhì)瘤中也是低表達(dá)，發(fā)揮抑癌功能，但是具體的機(jī)制并不明確[12]。本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)，與正常星形膠質(zhì)細(xì)胞相比，miR-186在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)明顯降低。筆者通過miRanda、miRDB、 miRWalk、 Targetscan數(shù)據(jù)庫預(yù)測出能與Smad6結(jié)合的miRNAs包含miR-186，推測miR-186可能通過靶向調(diào)節(jié)Smad6的表達(dá)來發(fā)揮作用。

Smad6是抑制性Smad蛋白，是轉(zhuǎn)化生長因子-β(transformation growth factor-β,TGF-β)信號(hào)通路的一類關(guān)鍵調(diào)控分子。TGF-β家族成員具有廣泛的細(xì)胞功能，比如調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖與分化、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞遷移和細(xì)胞間粘連。另外,它們?cè)谂咛グl(fā)育、免疫監(jiān)督及干細(xì)胞自我更新和分化中也起著重要的作用。多個(gè)證據(jù)表明Smad6對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展發(fā)揮一定的作用。比如Smad6在胰腺癌、口腔鱗狀細(xì)胞癌中存在過表達(dá)現(xiàn)象,可能是導(dǎo)致該腫瘤發(fā)生的原因之一[13]。Smad6影響非小細(xì)胞肺癌的生存期，敲降該基因可引起肺癌細(xì)胞活力下降、凋亡增加，同時(shí)抑制細(xì)胞周期，從而重建肺癌細(xì)胞TGF-β信號(hào)通路的平衡[14]。另有研究表明Smad6在肝癌CD133+干細(xì)胞中表達(dá)增加[15]。前期研究發(fā)現(xiàn)Smad6在膠質(zhì)瘤中表達(dá)亦增加[16]。本研究通過雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-186能直接結(jié)合到Smad6 3′-UTR，與生物信息學(xué)方法的預(yù)測結(jié)果一致。與文獻(xiàn)報(bào)道的miR-186可通過調(diào)控相關(guān)靶基因影響腫瘤的生物學(xué)功能類似[3-4],本研究也發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-186模擬物或抑制物后，Smad6的表達(dá)水平明顯降低或升高，說明 miR-186負(fù)向調(diào)控膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞Smad6蛋白的表達(dá)水平；轉(zhuǎn)染miR-186模擬物后，細(xì)胞的增殖顯著減弱，共轉(zhuǎn)染miR-186模擬物和Smad6過表達(dá)質(zhì)粒后，細(xì)胞的增殖能力有明顯恢復(fù)，故推斷在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中miR-186通過靶向調(diào)節(jié)Smad6影響了細(xì)胞的增殖能力。

綜上所述，miRNAs通過調(diào)控不同的靶基因參與膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展過程。本文探討了miR-186、Smad6在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中的重要作用，為膠質(zhì)瘤的防治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并有可能成為膠質(zhì)瘤治療的新方向。