肖云蘭，馮 霞

0引言

糖尿病是一種嚴(yán)重危害人類健康的全身性疾病，其危害程度僅次于心血管疾病與惡性腫瘤[1]。糖尿病發(fā)病機(jī)制為胰島素分泌絕對或相對不足，導(dǎo)致血糖代謝異常，進(jìn)而引起全身組織出現(xiàn)慢性損傷與功能障礙[2]。由于糖尿病患者長期處于高血糖狀態(tài)，刺激微血管，導(dǎo)致視網(wǎng)膜受損。研究發(fā)現(xiàn)，中國有超過40%的糖尿病患者出現(xiàn)糖尿病視網(wǎng)膜病變，且糖尿病視網(wǎng)膜病變是成年人最常見的失明原因之一[3-4]。故而探究糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)病機(jī)制，提出有效治療方法，對糖尿病視網(wǎng)膜病變患者具有重要意義。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptors 3，NLRP3)是炎癥小體家族成員，具有胞漿識別作用[5]。NLRP3激活后可誘導(dǎo)炎性因子產(chǎn)生，降低細(xì)胞在高糖環(huán)境中的生存能力。既往研究對NLRP3在胰島素抵抗與糖尿病發(fā)生的關(guān)系進(jìn)行了深入探討，但關(guān)于其在糖尿病視網(wǎng)膜病變中的作用鮮有研究。本研究旨在探究NLRP3/IL-1β通路在糖尿病視網(wǎng)膜病變中的作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)告如下。

1對象和方法

1.1對象前瞻性研究。收集2015-09/2018-03我院眼科收治的增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變患者49例49眼作為研究組，其中男27例，女22例，年齡38～67(平均43.57±9.82)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)內(nèi)分泌科確診為2型糖尿?。?2)眼底血管造影和三面鏡等眼科?？茩z查結(jié)果符合2002年版國際眼科學(xué)術(shù)會議提出的增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]；(3)無眼部炎性疾病。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)繼發(fā)性糖尿病；(2)妊娠期女性；(3)依從性低，不能配合檢查；(4)近3mo內(nèi)有眼部外傷史。收集同期來我院進(jìn)行手術(shù)治療的特發(fā)性黃斑裂孔患者41例41眼作為對照組，其中男24例，女17例，年齡39～65(平均42.91±9.54)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)光學(xué)相干斷層掃描與前置鏡散瞳眼底檢查明確診斷為特發(fā)性黃斑裂孔Ⅱ～Ⅳ期并進(jìn)行手術(shù)治療者；(2)近1mo內(nèi)無慢性淚囊炎、感染性角膜炎及角膜潰瘍等眼部感染性疾??；(3)能積極配合檢查。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并糖尿?。?2)黃斑裂孔形成時(shí)間超過1a；(3)不能耐受手術(shù)。兩組患者性別構(gòu)成比、年齡等一般資料差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究符合我院醫(yī)學(xué)倫理委員會相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，并獲得批準(zhǔn)。所有受試者及家屬對本研究充分知情，并自愿簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1樣本收集所有患者均進(jìn)行血常規(guī)、尿常規(guī)、凝血功能、血糖等術(shù)前常規(guī)檢查，確認(rèn)無手術(shù)禁忌后，根據(jù)患者情況，采用20g/L利多卡因注射液行球后阻滯麻醉或行全身麻醉，行睫狀體平坦部三通道閉合式玻璃體切除術(shù)，小心剝除研究組患者視網(wǎng)膜增殖前膜與對照組患者黃斑前膜，術(shù)中采用無菌注射器抽取每位患者0.5mL玻璃體原液。

1.2.2觀察指標(biāo)分別采用免疫組織化學(xué)法檢測視網(wǎng)膜增殖前膜與黃斑前膜中NLRP3蛋白表達(dá)水平，采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定視網(wǎng)膜增殖前膜與黃斑前膜中活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)水平，分別采用硫代巴比妥酸法與黃嘌呤法檢測視網(wǎng)膜增殖前膜與黃斑前膜中丙二醛(malondialdehyde，MDA)水平與超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性，采用ELISA法檢測玻璃體中白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)與白介素-18(interleukin-18，IL-18)水平。本研究所有試劑盒均購于南京森貝伽生物科技有限公司。

1.2.2.1免疫組織化學(xué)法將收集的組織經(jīng)固定、脫水、透明，并用石蠟包埋成塊，使用組織切片機(jī)(德國Leica，CM1850)將其加工為厚度約4μm的連續(xù)切片，依次進(jìn)行脫蠟、抗原修復(fù)及過氧化氫酶阻斷，加山羊血清(北京博勝經(jīng)緯科技有限公司)進(jìn)行封閉。滴加兔抗人NLRP3多克隆抗體(武漢博歐特生物科技有限公司，1∶100)，置于4℃冰箱中孵育過夜，漂洗后加羊抗兔IgG(北京博爾西科技有限公司)37℃孵育0.5h，再次漂洗，DAB顯色(上海康朗生物科技有限公司)，蘇木精(上海研謹(jǐn)生物科技有限公司)復(fù)染，經(jīng)梯度酒精脫水及中性樹脂封片。由兩位具有執(zhí)業(yè)資格的病理科醫(yī)生獨(dú)立采用雙盲法對染色結(jié)果進(jìn)行觀察，避開出血、壞死及刀口區(qū)，隨機(jī)選取10個(gè)包含100個(gè)細(xì)胞的視野進(jìn)行觀察。

1.2.2.2 ELISA法將術(shù)中收集的玻璃體原液經(jīng)低溫高速離心機(jī)以3000r/min的轉(zhuǎn)速處理15min后，留取上清液，加入反應(yīng)板孔中，根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行操作，采用酶標(biāo)儀(南京德鐵實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，HBS-1096A)測定450nm波長下的吸光度值并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)相應(yīng)吸光度值于標(biāo)準(zhǔn)曲線上確定ROS、IL-1β、IL-18相應(yīng)濃度。

1.2.2.3硫代巴比妥酸法將收集的組織充分剪碎勻漿，加入2倍體積的蒸餾水充分搖勻，留過濾后液體備用。按照試劑盒說明書進(jìn)行相應(yīng)操作后，取2mL樣液于10mL比色管中，采用紫外分光光度儀(上海譜元儀器有限公司，1900Plus)測定在530nm波長下的吸光度值并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)相應(yīng)吸光度值于標(biāo)準(zhǔn)曲線上確定MDA相應(yīng)濃度。

1.2.2.4黃嘌呤法將收集的組織充分剪碎勻漿，按照試劑盒說明書，依次加入試劑后充分混勻，37℃恒溫水浴0.5h。加入0.2mL顯色劑后于室溫下靜置10min，檢測550nm波長下的吸光度值并計(jì)算SOD活性。

2結(jié)果

2.1 NLRP3蛋白表達(dá)情況免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果顯示，NLRP3蛋白陽性表達(dá)呈藍(lán)色(圖1)。研究組患者中視網(wǎng)膜增殖前膜NLRP3陽性表達(dá)者占90%(44/49)，對照組患者中黃斑前膜NLRP3陽性表達(dá)者占5%(2/41)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=64.418，P<0.001)。

2.2 IL-1β和IL-18濃度比較研究組患者玻璃體中IL-1β、IL-18濃度(30.84±7.15、97.61±15.73pg/mL)均明顯高于對照組(4.63±0.92、52.07±11.38pg/mL)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=23.290、15.454，均P<0.05)。

2.3 ROS和MDA水平及SOD活性比較研究組患者視網(wǎng)膜增殖前膜中ROS與MDA水平均較對照組患者黃斑前膜明顯升高，但SOD活性較對照組明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

3討論

糖尿病是一種由于胰島素分泌減少或生物作用降低引起的代謝紊亂性疾病，其最主要的特征為血糖異常升高[1]。目前糖尿病尚無根治辦法，僅能控制血糖水平，延緩疾病發(fā)展[7]。流行病學(xué)調(diào)查顯示，繼心血管疾病與惡性腫瘤之后糖尿病已成為危害人類健康的第三類慢性非傳染性疾病[1]。由于長期處于高血糖水平，糖尿病患者易發(fā)生腎、眼、血管與神經(jīng)病變。糖尿病患者微血管病變最常見的癥狀為糖尿病視網(wǎng)膜病變導(dǎo)致的視力受損[3]。

目前關(guān)于糖尿病視網(wǎng)膜病變機(jī)制尚未完全明確，但多數(shù)學(xué)者就炎癥反應(yīng)是糖尿病視網(wǎng)膜病變的重要過程達(dá)成共識[8]。郭譯儂等[9]研究發(fā)現(xiàn)，炎性因子與視網(wǎng)膜細(xì)胞死亡及視網(wǎng)膜功能密切相關(guān)。Maimaiti等[10]研究指出，炎性因子浸潤會導(dǎo)致糖尿病視網(wǎng)膜病變進(jìn)一步加劇。NLRP3是一種胞漿模式識別受體分子，作為炎性小體家族一員，NLRP3可與凋亡相關(guān)顆粒樣蛋白及半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶-1形成炎性復(fù)合物[11]。活化的半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶-1可剪切IL-1β與IL-18前體，形成具有活性的IL-1β與IL-18[12]。IL-1β是一種致炎性因子，其水平異常升高可導(dǎo)致組織水腫與破壞[13]。此外，IL-1β除了對胰島B細(xì)胞具有直接破壞作用，還能通過誘導(dǎo)一氧化氮等有毒物質(zhì)的產(chǎn)生，間接損傷胰島細(xì)胞[14]。IL-18是具有多種生物學(xué)效應(yīng)的細(xì)胞因子，其能促進(jìn)白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)與腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)產(chǎn)生，介導(dǎo)前期炎性反應(yīng)。同時(shí)，IL-18促進(jìn)Fas系統(tǒng)介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，NLRP3蛋白在研究組患者中的陽性表達(dá)率為90%，明顯高于對照組(5%)，提示NLRP3蛋白在糖尿病視網(wǎng)膜病變患者視網(wǎng)膜增殖前膜中呈高表達(dá)。同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)研究組患者玻璃體中IL-1β與IL-18濃度明顯大于對照組患者，提示糖尿病視網(wǎng)膜病變過程中NLRP3/IL-1β通路活躍，通過提高炎性因子的表達(dá)加快視網(wǎng)膜病變進(jìn)程。

圖1免疫組織化學(xué)法檢測NLRP3蛋白的表達(dá)(×400)A：NLRP3蛋白在視網(wǎng)膜增殖前膜中表達(dá)呈陽性(藍(lán)色為陽性表達(dá))；B：NLRP3蛋白黃斑前膜呈陰性表達(dá)。

組別眼數(shù)ROS(U/mL)MDA(nmol/mg)SOD活性(U/mL)研究組4931.52±5.8115.06±1.9269.27±11.41對照組4112.74±4.597.34±1.38116.96±26.22t16.77221.50611.506P<0.001<0.001<0.001

注：研究組：增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變患者；對照組：特發(fā)性黃斑裂孔患者。

張子怡等[16]研究發(fā)現(xiàn)，NLRP3可增加細(xì)胞ROS的釋放，加重組織氧化損傷。ROS是引起機(jī)體氧化應(yīng)激的主要因素。生理狀態(tài)下，適當(dāng)水平的ROS具有傳導(dǎo)細(xì)胞信號的作用，而ROS水平異常升高可導(dǎo)致細(xì)胞損傷，甚至誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[17]。MDA是細(xì)胞膜上脂質(zhì)過氧化的重要產(chǎn)物之一，是脂類過氧化的標(biāo)志。故而臨床常將MDA水平用于評價(jià)氧化損傷程度[18]。SOD是清除機(jī)體內(nèi)氧自由基的首要物質(zhì)，其可對抗氧自由基對細(xì)胞的損傷作用，同時(shí)對已經(jīng)遭受氧自由基損傷的細(xì)胞具有修復(fù)作用。SOD活性越高，提示SOD對氧自由基的清除作用越強(qiáng)[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，研究組患者視網(wǎng)膜增殖前膜中ROS與MDA水平明顯高于對照組黃斑前膜，且SOD活性明顯低于對照組，提示NLRP3/IL-1β通路可增加氧化因子表達(dá)水平，加劇視網(wǎng)膜氧化損傷，這與張子怡等[16]研究結(jié)果一致。

綜上所述，NLRP3與IL-1β在增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變組織中呈高表達(dá)；NLRP3/IL-1β通路可上調(diào)炎性因子與氧化因子表達(dá)水平，加快疾病進(jìn)程。