胡 歡，謝華桃，韓玲玲，李 進(jìn)，夏向軍，張明昌

0引言

角膜上皮病變?cè)谘劭崎T診工作中較為常見，許多學(xué)者已經(jīng)對(duì)其進(jìn)行了深入的研究。隨著對(duì)角膜上皮病變的分型不斷細(xì)化，我國眼科學(xué)者孫旭光教授提出角膜上皮細(xì)胞功能障礙(corneal epithelial cells dysfunction，CED)的概念，即在角膜緣細(xì)胞功能正常的前提下，角膜上皮細(xì)胞再生、連接、黏附及移行功能異常[1]。主要發(fā)病原因?yàn)檠鄄渴中g(shù)、全身代謝性疾病、角膜營(yíng)養(yǎng)不良、角膜變性等[2]。目前不少眼科醫(yī)生對(duì)此類疾病的認(rèn)識(shí)不夠，易將各種上皮疾病的概念相互混淆，或者籠統(tǒng)地診斷為表層角膜炎、點(diǎn)狀角膜炎、病毒性角膜炎，因此CED誤診、誤治的情況常有發(fā)生，致使部分患者錯(cuò)過最佳治療時(shí)機(jī)或者治療不當(dāng)，導(dǎo)致病情加重、遷延不愈，形成角膜基質(zhì)炎、角膜潰瘍，重者導(dǎo)致角膜穿孔甚至失明。

目前，治療CED的藥物主要包括自體血清和糖皮質(zhì)激素類滴眼液，并輔以配戴繃帶型高含水量高透氧性軟性角膜接觸鏡。輕、中度CED給予藥物治療后，可以取得良好的效果[3]。藥物治療效果不佳的患者需考慮采用手術(shù)治療，而角膜前基質(zhì)穿刺術(shù)(anterior stromal puncture，ASP)是目前治療CED的有效手段，由McLean等[4]于1986年率先報(bào)道，其可以通過微針穿刺直接作用于病變角膜上皮，加強(qiáng)角膜上皮細(xì)胞與前基質(zhì)層的附著，以穩(wěn)定角膜上皮細(xì)胞的功能。本研究通過對(duì)ASP治療CED前后的各項(xiàng)觀察指標(biāo)及眼表功能結(jié)果進(jìn)行收集、整理及分析，探討ASP對(duì)藥物治療效果不佳的CED的臨床療效，以期為臨床治療各種類型CED提供參考。

1對(duì)象和方法

1.1對(duì)象回顧性病例研究。選取2015-09/12于華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院眼科住院行ASP治療的CED患者16例16眼，年齡10～84(平均50.43±22.03)歲，其中男10例，女6例；右側(cè)9眼，左側(cè)7眼；眼前段手術(shù)后CED 5眼，外傷后復(fù)發(fā)性角膜上皮糜爛5眼，角膜神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)不良性CED 3眼，藥物毒性CED 1眼，干眼相關(guān)性CED 2眼。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合CED診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)診斷為中度及以上程度的CED；(3)經(jīng)藥物和配戴繃帶鏡規(guī)范治療至少2wk，病情未見明顯好轉(zhuǎn)。排除角膜病變位于瞳孔區(qū)，伴有其它類型角膜病，或者不愿接受ASP治療者。本研究符合《赫爾辛基宣言》的原則，并且在數(shù)據(jù)分析和研究之前取得了醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。所有患者術(shù)前均簽署手術(shù)知情同意書。

1.1.1 CED診斷標(biāo)準(zhǔn)CED診斷標(biāo)準(zhǔn)：眼表不適癥狀明顯，眼痛、畏光、流淚、睜眼困難等癥狀反復(fù)發(fā)作。裂隙燈檢查示部分角膜上皮缺損，但角膜緣上皮光滑完整，病變區(qū)可合并上皮微囊、基底膜皺褶。病程長(zhǎng)、癥狀重者也可合并上皮基底膜局限性增厚，角膜熒光染色見病變區(qū)角膜上皮呈點(diǎn)狀、線狀、小片狀甚至彌漫性熒光著染，角膜內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量及形態(tài)正常[5-6]。

1.1.2 CED分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)角膜熒光著染形態(tài)及面積大小進(jìn)行CED分級(jí)，直徑<1mm的片狀著染為輕度，直徑為1～2mm的片狀熒光著染為中度，直徑>2mm的片狀熒光著染以及彌漫性熒光著染為重度。

1.2方法

1.2.1治療方法所有患者均先接受非手術(shù)治療，給予100%自體血清、1g/L玻璃酸鈉滴眼液、左氧氟沙星滴眼液，均為4次/d，睡前涂重組牛堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子眼用凝膠，并配戴純視軟性繃帶型角膜接觸鏡。治療持續(xù)2wk，未達(dá)到治療有效標(biāo)準(zhǔn)(即眼部刺激癥狀有效緩解或消失；角膜上皮完整光滑，熒光染色陰性[7])者實(shí)施ASP治療。本組患者非手術(shù)治療后均未達(dá)到治療有效標(biāo)準(zhǔn)，故均進(jìn)行ASP術(shù)治療。ASP手術(shù)方法：患眼局部麻醉后，用刮匙刮除病變區(qū)角膜上皮及其周邊疏松附著的角膜上皮，并于基底膜表面輕輕騷刮；用胰島素針頭于病變區(qū)角膜上皮外緣1mm的前基質(zhì)層進(jìn)行致密的淺點(diǎn)狀前基質(zhì)層針刺，深度約1/3厚度，針刺間距0.5mm。術(shù)畢將繃帶型角膜接觸鏡置于術(shù)眼角膜表面，涂重組牛堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子眼用凝膠并包扎患眼。ASP術(shù)后第1d開始給予100%自體血清滴術(shù)眼，前3d為每小時(shí)1次，之后改為8次/d，第2wk 4次/d，2wk后改用1g/L玻璃酸鈉眼液滴術(shù)眼 4次/d，連用1mo后停藥；給予1g/L氟米龍滴眼，第1wk 4次/d，每周遞減1次，連用1mo后停藥，夜間給予重組牛堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子眼用凝膠涂患眼。

1.2.2觀察指標(biāo)所有患者均于術(shù)前、術(shù)后1、3mo進(jìn)行裸眼視力、眼表疾病指數(shù)評(píng)分(ocular surface disease index，OSDI)[8-9]檢查，并采用眼前節(jié)光學(xué)相干斷層掃描(OCT)測(cè)量病變區(qū)角膜上皮厚度和全角膜厚度，角膜共聚焦顯微鏡測(cè)量病變部位上皮下樹突狀細(xì)胞密度、角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度及上皮下神經(jīng)叢密度。其中裸眼視力轉(zhuǎn)換為最小分辨角對(duì)數(shù)(LogMAR)視力進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；上皮下神經(jīng)叢密度的計(jì)算采用胡亮等[10]報(bào)道的方法，即使用共聚焦顯微鏡采集所有可見上皮下神經(jīng)纖維束后，從每次掃描的圖片中挑選出基底層上皮下神經(jīng)叢最豐富且清晰的圖片進(jìn)行神經(jīng)形態(tài)參數(shù)的統(tǒng)計(jì)后取平均值，使用Image J軟件的Neuron J插件對(duì)所選取的圖像進(jìn)行分析(圖1)。所有檢查均由同一醫(yī)師完成。

2結(jié)果

2.1手術(shù)前后裸眼視力術(shù)前、術(shù)后1、3mo本組患者裸眼視力(LogMAR)分別為0.48±0.37、0.23±0.22、0.21±0.21，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=4.648，P=0.015)，術(shù)后1mo裸眼視力較術(shù)前顯著改善，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但術(shù)后1、3mo裸眼視力差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.846)。

2.2手術(shù)前后OSDI評(píng)分術(shù)前、術(shù)后1、3mo本組患者OSDI評(píng)分分別為36.81±4.99、7.06±5.87、7.00±5.78分，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=558.15，P<0.001)。術(shù)后1mo OSDI評(píng)分與術(shù)前相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，但術(shù)后1、3mo OSDI評(píng)分差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.935)。

圖1某患者治療1mo后共聚焦顯微鏡顯示的上皮下神經(jīng)生長(zhǎng)情況(×800)A：Image J軟件處理前；B：Image J軟件處理后。

圖2手術(shù)前后角膜熒光染色情況患者陳某，男，35歲，因指甲劃傷右眼造成角膜上皮糜爛反復(fù)發(fā)作5次，伴有畏光、流淚，睜眼困難。術(shù)前檢查：視力OD 0.5、OS 0.5，右眼球結(jié)膜充血++，角膜上皮不規(guī)則大片缺損，角膜彌漫性熒光著染。ASP術(shù)后1、3mo角膜透明，未見熒光著染。A：術(shù)前；B：術(shù)后1mo；C：術(shù)后3mo。

圖3手術(shù)前后眼前節(jié)OCT檢查情況患者劉某，男，53歲，右眼打擊后異物感，紅痛、視力下降等不適2mo余。術(shù)前檢查：視力OD 0.6、OS 0.8，右眼球結(jié)膜充血++，右眼瞳孔區(qū)偏下方見上皮小片狀缺失，熒光染色見片狀熒光著染。ASP術(shù)前角膜上皮厚度95μm，全角膜厚度580μm；術(shù)后1mo分別為65、533μm；術(shù)后3mo分別為65、527μm。A：術(shù)前；B：術(shù)后1mo；C：術(shù)后3mo。

2.3手術(shù)前后角膜熒光染色情況治療后3mo，本組患者角膜熒光染色均為陰性。手術(shù)前后角膜熒光染色情況見圖2。

2.4手術(shù)前后角膜厚度術(shù)前、術(shù)后1、3mo本組患者角膜上皮厚度分別為79.19±10.75、59.75±5.72、59.44±5.88μm，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=33.617，P<0.001)；全角膜厚度分別為591.38±34.41、545.81±27.57、545.44±27.62μm，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=12.372，P<0.001)。術(shù)后1mo本組患者角膜上皮厚度和全角膜厚度與術(shù)前相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，但術(shù)后1、3mo角膜上皮厚度和全角膜厚度差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.884、0.912)。手術(shù)前后眼前節(jié)OCT檢查結(jié)果見圖3。

2.5手術(shù)前后角膜上皮下樹突狀細(xì)胞密度術(shù)前、術(shù)后1、3mo本組患者角膜上皮下樹突狀細(xì)胞密度分別為85.00±45.10、22.50±13.38、1.00±2.73個(gè)/mm2，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=41.476，P<0.001)。術(shù)后1mo角膜上皮下樹突狀細(xì)胞密度與術(shù)前相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，且術(shù)后1、3mo角膜上皮下樹突狀細(xì)胞密度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.036)。

2.6手術(shù)前后角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度術(shù)前、術(shù)后1、3mo本組患者角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度分別為2865.81±271.46、2866.31±268.87、2869.38±270.70個(gè)/mm2，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.001，P=0.999)。手術(shù)前后角膜共聚焦顯微鏡檢查角膜內(nèi)皮細(xì)胞情況見圖4。

圖4手術(shù)前后角膜共聚焦顯微鏡檢查角膜內(nèi)皮細(xì)胞情況(×800)患者劉某，男，27歲，雙眼反復(fù)干澀、異物感2mo余。術(shù)前檢查：視力OD 1.0、OS 1.0，雙眼瞳孔周圍角膜上皮粗糙，熒光染色見雙眼瞳孔周圍散在點(diǎn)狀著染。ASP術(shù)前后角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度、形態(tài)均正常，未見明顯差異。A：術(shù)前；B：術(shù)后1mo；C：術(shù)后3mo。

圖5手術(shù)前后角膜共聚焦顯微鏡檢查角膜上皮下神經(jīng)叢情況(圖4同一患者，×800)A：術(shù)前角膜上皮下神經(jīng)極為稀少，局部斷裂不完整；B：術(shù)后1mo角膜上皮下神經(jīng)明顯可見，較術(shù)前數(shù)量明顯增加，但仍有部分神經(jīng)不規(guī)則，局部有離斷；C：術(shù)后3mo角膜上皮下神經(jīng)數(shù)量較術(shù)后1mo有所增加，密度正常，走形規(guī)則，未見明顯中斷和直角彎折。

2.7手術(shù)前后角膜上皮下神經(jīng)叢密度術(shù)前、術(shù)后1、3mo本組患者角膜上皮下神經(jīng)叢密度分別為58.37±27.03、151.63±7.78、181.25±7.25mm/mm2,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=233.991，P<0.001)。術(shù)后1mo角膜上皮下神經(jīng)叢密度與術(shù)前相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，且術(shù)后1、3mo角膜上皮下神經(jīng)叢密度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。手術(shù)前后角膜共聚焦顯微鏡檢查角膜上皮下神經(jīng)叢情況見圖5。

3討論

正常情況下，角膜上皮的完整修復(fù)需要具備3個(gè)條件即上皮細(xì)胞再生、移動(dòng)、黏附，依靠的是上皮細(xì)胞之間的緊密連接以及上皮細(xì)胞與基底膜之間的半橋粒結(jié)構(gòu)[11]。曲景灝等[12]研究證實(shí)，缺損面積較大的角膜上皮修復(fù)需要基底細(xì)胞與角膜緣干細(xì)胞共同完成，若基底膜受到破壞，膠原蛋白酶產(chǎn)生增加，角膜正常代謝產(chǎn)生新的功能完整的上皮細(xì)胞將無法黏附于基底膜上，細(xì)胞之間的緊密連接功能亦不能恢復(fù)，可能導(dǎo)致CED的發(fā)生，從而延遲角膜上皮修復(fù)，甚至引起加速潰瘍形成，導(dǎo)致傷口不愈合。對(duì)于CED的治療，首先考慮配戴角膜繃帶鏡、激素類滴眼液以及自體血清等保守手段[13-15]。而本次研究中所納入的患者均是由于上述治療效果不佳，故選擇手術(shù)治療。

ASP能夠刺激基底膜，增加基底膜與再生上皮的黏附能力。對(duì)人類角膜的免疫組化研究顯示，上皮基底膜和前彈力層黏附不牢的主要因素是上皮基底膜外基質(zhì)蛋白的缺失[16]。通過ASP能夠增加上皮基底膜外蛋白質(zhì)的表達(dá)，加速上皮下纖維化的形成，促進(jìn)上皮再黏附，從而加速病變角膜上皮的修復(fù)。有研究表明，在兔角膜潰瘍模型中，通過針刺治療，角膜組織中的膠原酶生成明顯減少，可抑制異?；啄どL(zhǎng)，刺激新的健康的基底膜再生，同時(shí)加強(qiáng)細(xì)胞之間以及細(xì)胞與基底膜之間的緊密連接，促進(jìn)角膜上皮的修復(fù)[17]。Das等[18]指出，ASP相較于其它術(shù)式，優(yōu)勢(shì)主要在于使用簡(jiǎn)便的設(shè)備便可以實(shí)施，引起角膜瘢痕和屈光度改變的風(fēng)險(xiǎn)較小，而且患者在術(shù)中的不適度低。本研究中，16例患者非手術(shù)治療效果不佳，而在ASP術(shù)后1mo時(shí)，裸眼視力、OSDI、角膜上皮厚度及全角膜厚度均較術(shù)前明顯好轉(zhuǎn)，特別是角膜熒光染色檢查均為陰性，這就可以說明ASP在治療CED中發(fā)揮了重要的作用。

本研究中，我們還使用角膜共聚焦顯微鏡觀察了相關(guān)的預(yù)后指標(biāo)，如樹突狀細(xì)胞數(shù)量。正常情況下，樹突狀細(xì)胞存在于角鞏緣，是目前已知的最強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞，能有效活化T細(xì)胞[19]。而角膜上皮層是抵抗病原微生物入侵角膜的第一道屏障，角膜上皮細(xì)胞受損時(shí)，極易導(dǎo)致感染性炎性細(xì)胞的增殖與活化[11]。CED發(fā)生時(shí)，樹突狀細(xì)胞清除有害的病原微生物、產(chǎn)物及有害抗原物質(zhì)，并直接或間接激活T細(xì)胞，數(shù)量會(huì)明顯增加。本組患者術(shù)后1mo復(fù)查共聚焦顯微鏡，角膜上皮下樹突狀細(xì)胞密度明顯下降，但仍高于正常水平，這就提示ASP及術(shù)后用藥的治療是有效的，但仍有炎癥存在；術(shù)后3mo復(fù)查，樹突狀細(xì)胞密度較術(shù)后1mo繼續(xù)下降，提示此時(shí)炎癥被進(jìn)一步控制。共聚焦顯微鏡對(duì)于活體觀察樹突狀細(xì)胞數(shù)量，評(píng)估術(shù)后炎癥的轉(zhuǎn)歸有重要作用，在主觀癥狀消失和一些基礎(chǔ)檢查結(jié)果正常時(shí)，也應(yīng)囑患者按時(shí)隨訪。

共聚焦顯微鏡的另一重要功能是可以觀察角膜上皮下神經(jīng)叢密度以及分布情況[20]。角膜豐富的神經(jīng)分布對(duì)于維持敏感的角膜知覺和眼表微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)都有非常重要的意義。上皮下神經(jīng)叢的修復(fù)會(huì)經(jīng)歷一個(gè)比較漫長(zhǎng)的過程，有研究顯示，角膜屈光術(shù)后6mo中央?yún)^(qū)仍無神經(jīng)分布[21]。CED同樣會(huì)導(dǎo)致上皮下神經(jīng)叢密度降低，結(jié)構(gòu)發(fā)生異常改變[22]。本組患者術(shù)后1mo行角膜熒光染色檢查已呈陰性，但共聚焦顯微鏡檢查顯示仍有神經(jīng)分布不規(guī)則及離斷，到術(shù)后3mo時(shí)上皮下神經(jīng)叢密度才基本接近正常。提示CED術(shù)后復(fù)查時(shí)，傳統(tǒng)的角膜熒光染色檢查即使呈陰性，也應(yīng)通過共聚焦顯微鏡評(píng)估術(shù)后上皮下神經(jīng)叢的恢復(fù)情況。

此外，我們還檢查了角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度情況。單純的CED不會(huì)引起角膜內(nèi)皮層的改變。ASP術(shù)前后本組患者角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度未呈現(xiàn)明顯差異，說明由于手術(shù)治療及時(shí)，未影響到角膜內(nèi)皮細(xì)胞的功能。Nishida等[23]對(duì)白內(nèi)障術(shù)后并發(fā)CED的患者41例進(jìn)行了隨訪，結(jié)果顯示CED治療前后，角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度無明顯變化，這與我們的研究結(jié)果是一致的。近年來，白內(nèi)障手術(shù)后誘發(fā)大泡性角膜病變的風(fēng)險(xiǎn)已經(jīng)受到眼科醫(yī)生的重視，隨著內(nèi)皮移植手術(shù)的廣泛開展，角膜內(nèi)皮疾病也可以得到有效的治療。但在我們本次研究的病例中，有5眼是在眼前段手術(shù)后誘發(fā)的CED，這就提示在白內(nèi)障術(shù)后除了角膜內(nèi)皮細(xì)胞以外，角膜上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整與功能的穩(wěn)定也是很重要的[24]。

綜上所述，ASP可以有效治療CED及其誘發(fā)的炎癥，并且可修復(fù)其導(dǎo)致的上皮下神經(jīng)叢缺損。但值得注意的是，ASP會(huì)形成角膜瘢痕，治療必須要避開瞳孔區(qū)，以防止瘢痕嚴(yán)重影響視覺質(zhì)量。同時(shí)在術(shù)前檢查及術(shù)后隨訪時(shí)，應(yīng)重視角膜共聚焦顯微鏡的使用，作為新型、無創(chuàng)、精確的眼前節(jié)檢查設(shè)備，其在CED以及其它角膜病的療效評(píng)價(jià)中有著非常重要的作用，下一步研究應(yīng)該致力于完善共聚焦顯微鏡的檢查指標(biāo)在CED發(fā)病及轉(zhuǎn)歸中的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。