高俊濤,馮憲敏,萬(wàn) 朋,駱曉峰,朱文赫,常 影,謝 維,趙國(guó)艷,齊佳悅,呂士杰

(1.吉林醫(yī)藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,吉林 吉林132013;2.吉林醫(yī)藥學(xué)院科技處,吉林 吉林132013;3.吉林醫(yī)藥學(xué)院直屬醫(yī)院,吉林 吉林132013)

近年來(lái),世界范圍內(nèi)極端天氣頻發(fā),其中高溫天氣給人們尤其是高溫作業(yè)人群的生產(chǎn)生活造成巨大影響。研究表明,高溫環(huán)境引起體溫升高和中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷,認(rèn)知能力與高溫程度具有相關(guān)性[1],高溫對(duì)注意力[2]、記憶力[3]、處理信息敏銳程度[4]等造成不利影響,并且隨著暴露時(shí)間的增加而加重[5],但高溫環(huán)境對(duì)學(xué)習(xí)記憶的影響及其機(jī)制仍不明確[6]。高溫環(huán)境對(duì)學(xué)習(xí)記憶功能的影響以及藥物防治方面的報(bào)道很少,其作用機(jī)制尚不明確。因此,本研究從行為學(xué)及分子生物學(xué)出發(fā),觀察分析高溫后大鼠海馬區(qū)炎癥因子的分泌以及炎癥因子信號(hào)通路上蛋白的表達(dá)變化,探討由神經(jīng)炎癥是否參與高溫?fù)p傷學(xué)習(xí)記憶功能的神經(jīng)調(diào)控,旨在為高溫?fù)p傷大腦認(rèn)知功能提供新的解釋,為相關(guān)研究提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 CREB 一抗(英國(guó)Abcam 公司);P-CREB 一抗(英國(guó)Abcam 公司);β-actin(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);HRP conjugated(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);BCA 蛋白定量增強(qiáng)型試劑盒(江蘇碧云天生物技術(shù)研究所);DYY-7C 型電泳儀(北京六一儀器廠);Model680 型酶標(biāo)儀(美國(guó)BIO-RAD 公司);FRESCO17 高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Thermo 公司);Y 迷宮(成都泰盟科技有限公司);DKB-501S 型超級(jí)恒溫水浴(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);HITACHI7600 生化分析儀(日本Tokyo 公司)。

1.2 動(dòng)物分組與處理 雄性清潔級(jí)Wistar 大鼠(吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,動(dòng)物許可證號(hào):SCXK-吉2016-0003)30 只,體重180~220 g,隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組各15 只。正常對(duì)照組大鼠置于24 ℃室溫,模型組大鼠置于43 ℃循環(huán)水浴熱倉(cāng)15 min,連續(xù)14 d。

1.3 采用Y 迷宮試驗(yàn) 進(jìn)行學(xué)習(xí)記憶行為學(xué)試驗(yàn)[7,8]。

1.4 蛋白印跡試驗(yàn)(Western Blot)檢測(cè)大鼠海馬組織CREB 蛋白表達(dá) 冰上操作取組織,剪碎加組織蛋白裂解液研磨,冰浴裂解30 min,11 500 r/min(4 ℃)離心20 min,吸取上清蛋白液,BCA 法測(cè)定蛋白濃度。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS11.5 軟件,Y 迷宮試驗(yàn)組間比較進(jìn)行重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析,炎癥因子水平、CREB 表達(dá)強(qiáng)度組間比較進(jìn)行單因素方差分析。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Y 迷宮自主交替和空間識(shí)別 與正常對(duì)照組比較,模型組大鼠的實(shí)際Alternation 數(shù)、最大Alternation 數(shù)以及自主交替率都顯著低于正常對(duì)照組(P<0.01),穿梭次數(shù)顯著下降(P<0.01),可見高溫使大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力明顯降低(見表1)。

表1 各組大鼠自主交替率和穿梭次數(shù)的比較 (n=15

表1 各組大鼠自主交替率和穿梭次數(shù)的比較 (n=15

注:與正常對(duì)照組比較,?:P<0.05,??:P<0.01,下表同

_________組___別__________________________實(shí)際Alternati_o_n__數(shù)_____________最__大__A_l_te_r_n_a_ti_on___數(shù)_______________自__主__交__替__率___________________穿__梭__次_數(shù)_______正常對(duì)照組 19.78±2.02 29.38±3.28 0.58±0.03 7.12±1.83_________模型組____________________________5.26±1.85?? 10.83±1.55?? 0.31±0.06?? 2.08±1.57??

2.2 Y 迷宮主動(dòng)回避 與正常對(duì)照組比較,模型組大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力的指標(biāo)包括主動(dòng)回避錯(cuò)誤次數(shù)(P<0.05)、辨別錯(cuò)誤次數(shù)(P<0.01)和訓(xùn)練時(shí)間(P<0.01)統(tǒng)計(jì)結(jié)果均顯著升高,而正確次數(shù)也顯著降低(P<0.01),可見高溫環(huán)境下大鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力均明顯降低(見表2)。

表2 各組大鼠主動(dòng)回避指標(biāo)的比較 (n=15,

表2 各組大鼠主動(dòng)回避指標(biāo)的比較 (n=15,

_________組___別______________________________主__動(dòng)__回__避__錯(cuò)__誤__/_次______________辨__別__錯(cuò)__誤__/_次_________________訓(xùn)__練__時(shí)__間__/_分________________記__憶__正__確__次__數(shù)_______正常對(duì)照組 7.72±2.21 41.18±1.63 51.04±1.70 17.25±1.58_________模型組____________________________26.19±2.15?? 60.30±1.72? 112.76±1.53?? 9.31±1.95??

2.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)結(jié)果 與正常對(duì)照組比較,模型組大鼠海馬組織中IL-1β(P<0.01)、TNF-α 水平顯著升高(P<0.05),說(shuō)明高溫導(dǎo)致炎癥因子的升高(見表3)。

表3 各組大鼠海馬組織IL-1β、TNF-α 含量比較(n=15

表3 各組大鼠海馬組織IL-1β、TNF-α 含量比較(n=15

______組___別_______________IL-1β_(_p_g_/m__L_)__________T_N_F__-α_(__p_g_/m__L_)____常溫對(duì)照組 26.39±1.03 21.65±2.57______模型組______________50.18±3.21?? 55.81±4.35?

2.4 高溫環(huán)境降低CREB 蛋白的表達(dá) 圖1 顯示,與正常對(duì)照組比較,模型組大鼠海馬內(nèi)磷酸化CREB 表達(dá)顯著降低(P<0.01),說(shuō)明高溫環(huán)境可以影響大鼠的長(zhǎng)時(shí)程記憶。

3 討論

圖1 各組大鼠海馬內(nèi)的CREB 蛋白表達(dá)比較

高溫環(huán)境導(dǎo)致短暫的或永久性的神經(jīng)功能損傷,降低認(rèn)知能力,主要表現(xiàn)在學(xué)習(xí)記憶能力、推理能力、注意力解決和理解問(wèn)題能力[9],人體認(rèn)知功能受損[10],小鼠的學(xué)習(xí)記憶行為能力明顯降低[11-12],但其機(jī)制研究不十分清楚。本研究采用Y 迷宮行為學(xué)試驗(yàn),觀察高溫環(huán)境對(duì)學(xué)習(xí)記憶能力的影響,證實(shí)了高溫環(huán)境會(huì)導(dǎo)致大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的下降,結(jié)果與其他人的研究結(jié)果相一致。高溫環(huán)境可誘導(dǎo)核因子NF-κB 活化[5],使神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞激活,遷移到受損區(qū)域,活化的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞釋放炎性分子和細(xì)胞毒性因子,如環(huán)氧酶-2(COX-2)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)衍生物,腫瘤壞死因子-α(TNF-α),白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)等[13],進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)元和突觸損傷,TNF-α 和IL-1β 抑制成體神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和認(rèn)知功能[14]。神經(jīng)炎癥因子上調(diào)所致學(xué)習(xí)記憶功能的下降越來(lái)越引起人們的關(guān)注,其中IL-1β、TNF-α 作為分泌的主要致炎因子,其升高是致使學(xué)習(xí)記憶能力下降的一個(gè)重要機(jī)制。高溫環(huán)境可顯著增加海馬炎癥反應(yīng)[5],導(dǎo)致記憶障礙,與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),高溫環(huán)境下大鼠海馬組織內(nèi)的炎癥因子IL-1β、TNF-α的表達(dá)含量也升高,可見高溫環(huán)境介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥反應(yīng)參與學(xué)習(xí)記憶下降的神經(jīng)調(diào)控過(guò)程。與此同時(shí),學(xué)習(xí)記憶相關(guān)分子蛋白CREB 含量卻下降,CREB 是cAMP 反應(yīng)單元的一種蛋白質(zhì),調(diào)控著基因的表達(dá),被稱為是記憶的“開關(guān)”,CREB 與學(xué)習(xí)、記憶和樹突傳輸密切相關(guān)。腦缺血損傷后,大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力下降,CREB 磷酸化水平下降。此外腦缺血導(dǎo)致海馬CREB 活性降低引起學(xué)習(xí)記憶功能障礙。 CREB 敲除小鼠,記憶功能損傷,學(xué)習(xí)時(shí)CREB 活性是神經(jīng)元參與記憶功能的關(guān)鍵因素[15]。上述結(jié)果提示,神經(jīng)炎癥反應(yīng)可能參與高溫環(huán)境降低學(xué)習(xí)記憶能力的神經(jīng)生物學(xué)過(guò)程,高溫環(huán)境可通過(guò)抑制CREB 的磷酸化,導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶下降。海馬組織中的神經(jīng)遞質(zhì)、激素及其他蛋白的改變是否與高溫環(huán)境導(dǎo)致的學(xué)習(xí)記憶功能損傷有關(guān),尚有待進(jìn)一步研究。