王 玲,郭志廷,楊 峰,魏小娟,李宏勝,周緒正,劉龍海

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所 農(nóng)業(yè)部獸用藥物創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,甘肅 蘭州730050)

中藥常山(Dichroa febrifuga Lour.)為目前國內(nèi)常用的抗球蟲中藥材,可單獨(dú)使用或以復(fù)方制劑的主藥用于抗球蟲治療藥物[1]。常山散口服制劑是通過現(xiàn)代中藥分離技術(shù),提取常山生藥根中的有效活性成分常山總生物堿制得,可用于防控雞球蟲病?？诜苿┲形⑸镂廴緺顩r的控制是藥品質(zhì)量控制的重要指標(biāo),而中藥口服制劑因藥材來源及生產(chǎn)工藝的特殊性,尤其易受到微生物的污染。薄膜過濾法是對細(xì)菌微生物量測試的有效方法,同時(shí)也是微生物限度檢驗(yàn)中的方法之一[2],該法在無菌檢查中可以快速集菌,在藥品微生物限度檢查中可以去除藥品中某些成分的抑菌作用。同時(shí),也可作為制藥微生物回收和醫(yī)藥制劑中微生物驗(yàn)證的一種試驗(yàn)驗(yàn)證方法,所以薄膜過濾法在藥品檢驗(yàn)中的應(yīng)用越來越被重視。為保證檢驗(yàn)結(jié)果的真實(shí)性、有效性,在進(jìn)行常山散的微生物限度檢查時(shí)需先考慮去除藥物有可能存在的的抑菌活性,以使回收率達(dá)到要求。故應(yīng)從供試液的制備、取樣量、沖洗液的體積、濾膜的選用等方面進(jìn)行考察,采用適當(dāng)?shù)姆椒ㄏ诜┲杏锌赡艽嬖诘囊志钚?再對常山散進(jìn)行微生物限度的檢查。因目前尚未見有關(guān)中藥常山散微生物限度檢查方法的報(bào)道,本試驗(yàn)參照2010 版《中國獸藥典》微生物限度檢查法,對常山散進(jìn)行細(xì)菌、真菌及酵母計(jì)數(shù)方法及加菌回收率的建立和驗(yàn)證,對中藥提取物常山散的質(zhì)量控制、研發(fā)和申報(bào)抗球蟲新獸藥有著積極的現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料與方法

1.1 供試藥品 常山散(批號:20150725、20150812、20150822,河北正道生物科技有限公司生產(chǎn))。供試液的制備:取常山散10 g,加pH 值7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液稀釋至100 mL,混勻,作為1∶10 的供試液。

1.2 培養(yǎng)基和緩沖液 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、改良馬丁培養(yǎng)基、改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基、硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基,以上培養(yǎng)基由廣東環(huán)凱微生物科技有限公司提供。膽鹽乳糖培養(yǎng)基、膽鹽硫乳瓊脂培養(yǎng)基、曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基、乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基、四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基、溴化十六烷基三甲胺瓊脂培養(yǎng)基、綠膿菌素測定用培養(yǎng)基、亞碲酸鹽肉湯培養(yǎng)基、卵黃氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基、梭菌增菌培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、4-甲基傘形酮葡糖苷酸(MUG)培養(yǎng)基、念珠菌顯色培養(yǎng)基,上述培養(yǎng)基由青島高科園海博生物技術(shù)有限公司提供。pH 值7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液、pH 值7.2 無菌磷酸鹽緩沖液、無菌生理鹽水,參照《中國獸藥典》2010 版無菌檢查法配制。所用試劑均為分析純。

1.3 試驗(yàn)儀器 生物安全柜(上海力申科學(xué)儀器有限公司,型號HPsafe-1200LC),隔水式培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司,型號GHP-9160),全溫振蕩培養(yǎng)箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司,HZP-250);電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司,型號DHG-9240A);立式超低溫保存箱(青島海爾特種電器有限公司,型號DW-86L338);漩渦混合(美國SCILOGEX,MX-S);立式壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠,型號LDZX-30KBS);AP-01P 真空泵(天津奧特賽恩斯儀器有限公司);薄膜過濾器(杭州泰林生物技術(shù)設(shè)備有限公司,孔徑0.45 μm,直徑50 mm)。

1.4 菌液制備、計(jì)數(shù)及菌液稀釋度的確定 細(xì)菌、真菌和酵母計(jì)數(shù)及回收率測定,選用菌株為金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、大腸埃希菌[CMCC(B)44102]、枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63501]、白色念珠菌[CMCC(F)98001]、黑曲霉(Aspergillus niger)[CMCC(F)98003]。另生孢梭菌(Clostridium sporogenes)[CMCC(B)64941]、乙型副傷寒沙門菌(B)[CMCC(B)50094]、銅綠假單胞菌[CMCC(B)10104],用于方法驗(yàn)證試驗(yàn)、控制菌的檢查及供試品的無菌檢查。均購自中國普通微生物菌種保藏管理中心,具有ATCC 官方授權(quán)。菌種要求不得超過5 代。

1.4.1 細(xì)菌組菌液 將金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、乙型副傷寒沙門菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物接種至5 mL 營養(yǎng)肉湯中,在35 ℃~37 ℃下培養(yǎng)18~24 h,制得菌液。取上述菌液用0.9%無菌氯化鈉溶液依次10 倍稀釋至10-4~10-7稀釋度,每個(gè)稀釋度各吸取200 μL 菌液對號接種至不同稀釋度編號的營養(yǎng)瓊脂平板上(10-5~10-7稀釋度各設(shè)2 個(gè)重復(fù)),將菌液在平板上涂布均勻,在35 ℃-37℃下倒置培養(yǎng)18~24 h,計(jì)數(shù),以確定菌懸液濃度約為50~100 CFU/mL 的最佳稀釋度。

1.4.2 真菌組菌液 將白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物接種至改良馬丁液體培養(yǎng)基中,在27 ℃下培養(yǎng)24~28 h,制得菌液。取上述菌液用0.9%無菌氯化鈉溶液依次10 倍稀釋至10-4~10-6稀釋度,分別吸取各稀釋度菌液200 μL 接種至玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基平板或改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基平板上,每個(gè)稀釋度2個(gè)重復(fù),將菌液在平板上涂布均勻,27 ℃下倒置培養(yǎng)48~72 h,計(jì)數(shù),確定菌懸液濃度約為50~100 CFU/mL 的最佳稀釋度。

將黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物接種至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基上,在27 ℃下培養(yǎng)5 d 左右,用無菌棉簽、0.9%無菌氯化鈉溶液(含0.05%聚山梨酯80)將孢子洗脫。吸出孢子懸液至無菌試管內(nèi),用0.9%無菌氯化鈉溶液將孢子懸液依次10 倍稀釋至10-3~10-5稀釋度,分別吸取各稀釋度孢子懸液200 μL 接種至玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基平板上,每個(gè)稀釋度2 個(gè)重復(fù),將孢子懸液在平板上涂布均勻,27 ℃下培養(yǎng)3~5 d,計(jì)數(shù),確定孢子懸液濃度約為50~100 CFU/mL 的稀釋度。

1.4.3 取各菌液培養(yǎng)物按10 倍稀釋法,用0.9%無菌生理鹽水溶液制成含菌<100 CFU/ mL 的供試菌液。菌液制備后保存在2 ℃~8 ℃,應(yīng)在24 h內(nèi)使用。黑曲霉孢子懸液可保存在2 ℃~8 ℃,在驗(yàn)證過的貯存期內(nèi)使用。

1.5 方法驗(yàn)證試驗(yàn) 按照《中國獸藥典》2010 年版有關(guān)微生物限度檢查法驗(yàn)證進(jìn)行,驗(yàn)證試驗(yàn)至少應(yīng)進(jìn)行3 次獨(dú)立的平行實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證采用薄膜過濾法進(jìn)行[3]。

1.6 菌落計(jì)數(shù)及回收率測定(薄膜過濾法)[5-9]試驗(yàn)組 采用濾膜孔徑0.45 μm、直徑50 mm 的親水混合纖維素膜酯濾膜。取1∶10 供試液10 mL(相當(dāng)于含供試品1 g)加至100 mL 稀釋液中,混勻,過濾,并用pH 值7.2 無菌磷酸鹽緩沖液分3 次進(jìn)行過濾、沖洗,每張濾膜沖洗量為100 mL×3 次,泵速160 r/min。在最后一次的沖洗液中加入50~100 CFU 試驗(yàn)菌,濾干后取出濾膜,菌面朝上貼于已凝固的營養(yǎng)瓊脂平板(用于大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌)或玫瑰紅鈉瓊脂平板(用于白色念珠菌、黑曲霉),每株試驗(yàn)菌平行制備2 張濾膜。培養(yǎng)條件和計(jì)數(shù)方法同常規(guī)法。

菌液組:濾膜用pH 值7.2 的無菌磷酸鹽緩沖液分3 次進(jìn)行過濾、沖洗,每張濾膜沖洗量為100 mL×3 次,在最后一次的沖洗液中加入50~100 CFU 試驗(yàn)菌,濾干后將接有細(xì)菌的濾膜取出,菌面朝上貼于已凝固的瓊脂平板上,每株試驗(yàn)菌平行制備2 張濾膜。計(jì)數(shù)平板、培養(yǎng)條件及菌落計(jì)數(shù)同上。

供試品對照組:取1∶10 供試液10 mL 加至100 mL 稀釋液中,混勻,過濾,并用pH 值7.2 無菌磷酸鹽緩沖液分3 次進(jìn)行過濾、沖洗,每張濾膜沖洗量為100 mL×3 次,濾干后取出濾膜,接觸樣品的粗糙面朝上貼于已凝固的瓊脂平板上,每株試驗(yàn)菌平行制備2 張濾膜。計(jì)數(shù)平板、培養(yǎng)條件及菌落計(jì)數(shù)同上。

稀釋劑對照組:取pH 值7.0 氯化鈉-蛋白胨緩沖液1 mL 加至100 mL 稀釋液中混勻,過濾,并用pH 值7.2 無菌磷酸鹽緩沖液分3 次進(jìn)行過濾、沖洗,每張濾膜沖洗量為100 mL×3 次,在最后一次的沖洗液中加入50~100 CFU 試驗(yàn)菌,濾干后取出濾膜,菌面朝上貼于已凝固的瓊脂平板上,每株試驗(yàn)菌平行制備2 張濾膜。計(jì)數(shù)平板、培養(yǎng)條件及菌落計(jì)數(shù)同上。

陰性對照組:取試驗(yàn)用的稀釋液1 mL(pH 值7.0 氯化鈉-蛋白胨緩沖液),加至第一次的100 mL 沖洗液中,混勻,過濾,濾膜用pH 值7.2 的無菌磷酸鹽緩沖液分3 次進(jìn)行過濾、沖洗,每張濾膜沖洗量為100 mL×3 次。濾干后取出濾膜,接觸樣品面朝上貼于已凝固的瓊脂平板上,每種培養(yǎng)基至少制備2 張濾膜。計(jì)數(shù)平板、培養(yǎng)條件及菌落計(jì)數(shù)同上。

計(jì)算方法:

稀釋劑對照組的菌回收率=稀釋劑對照組的平均菌落數(shù)÷菌落組的平均菌落數(shù)×100%

試驗(yàn)組的菌回收率=(試驗(yàn)組的平均菌落數(shù)-稀釋劑對照組的平均菌落數(shù))÷菌落組的平均菌落數(shù)×100%

1.7 控制菌檢查方法 按照《中國獸藥典》等文獻(xiàn)[2,10-12]的相關(guān)要求,中藥提取物固體口服給藥制劑應(yīng)對大腸埃希菌、沙門菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌進(jìn)行控制菌檢查。驗(yàn)證試驗(yàn)與供試品的控制菌檢查同時(shí)進(jìn)行,參照《中國獸藥典》2010 年版等相關(guān)文獻(xiàn)有關(guān)微生物限度控制菌的檢查方法[3,13-15]。

試驗(yàn)組:取1∶10 供試液10 mL(相當(dāng)于供試品1.0 g),加至100 mL 的pH 值7.2 無菌磷酸鹽緩沖液中混勻,過濾,并用pH 值7.2 無菌磷酸鹽緩沖液分3次進(jìn)行過濾、沖洗,每張濾膜沖洗量為100 mL×3 次,10~100 CFU 試驗(yàn)菌加在最后一次沖洗液中,濾干后,將接有細(xì)菌的濾膜取出接種至相應(yīng)的100 mL 增菌培養(yǎng)基中,依相應(yīng)的控制菌檢查法進(jìn)行檢查。

供試液組:取1∶10 供試液10 mL,過濾,沖洗,沖洗液分3 次進(jìn)行過濾、沖洗,每張濾膜沖洗量為100 mL×3 次,濾干后取出濾膜接入相應(yīng)的100 mL增菌培養(yǎng)基中,依相應(yīng)的控制菌檢查法進(jìn)行檢查。

陽性對照:濾膜用pH 值7.2 的無菌磷酸鹽緩沖液分3 次進(jìn)行過濾、沖洗,每張濾膜沖洗量為100 mL×3 次,在最后一次的沖洗液中加入10~100 CFU 試驗(yàn)菌,濾干后將接有細(xì)菌的濾膜取出,接入相應(yīng)的100 mL 增菌培養(yǎng)基中,依相應(yīng)的控制菌檢查法進(jìn)行檢查。

陰性對照:取試驗(yàn)用的稀釋液10 mL(pH 值7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液),加至100 mL 的pH 值7.2無菌磷酸鹽緩沖液中,混勻,過濾,并用pH 值7.2無菌磷酸鹽緩沖液分3 次進(jìn)行過濾、沖洗,每張濾膜沖洗量為100 mL×3 次,濾干后,將接有稀釋液的濾膜取出接入相應(yīng)的100 mL 增菌培養(yǎng)基中,依相應(yīng)的控制菌檢查法進(jìn)行檢查。

1.8 供試品的微生物限度檢查 依據(jù)驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果,對不同批次份常山散(批號:20150725、20150812、20150822,河北正道生物科技有限公司生產(chǎn))進(jìn)行微生物限度的檢查。細(xì)菌、真菌及酵母的總數(shù)計(jì)數(shù),大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、乙型副傷寒沙門菌及銅綠假單胞菌的檢查均采用經(jīng)驗(yàn)證的薄膜過濾法進(jìn)行,具體參照2010 年版《中國獸藥典》有關(guān)微生物限度控制菌的檢查方法[2]。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法驗(yàn)證結(jié)果 所有含供試品的錐形瓶內(nèi)各試驗(yàn)菌均生長良好,證實(shí)供試品在該檢驗(yàn)條件下無抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不計(jì)(采用濾膜孔徑0.45 μm、直徑50 mm 的親水混合纖維素膜酯濾膜。取1∶10 供試液10 mL(相當(dāng)于含供試品1 g)加至100 mL 稀釋液中,混勻,過濾,并用pH 值7.2 無菌磷酸鹽緩沖液分3 次進(jìn)行過濾、沖洗,每張濾膜沖洗量為100 mL×3 次,泵速160 r/min。在最后1 次的沖洗液中加入50~100 CFU 試驗(yàn)菌,可采用薄膜過濾法建立檢查方法。

2.2 回收率的測定結(jié)果 見表1。結(jié)果表明,供試液對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌及黑曲霉的回收率均大于70%,其次供試品和所用稀釋劑對此結(jié)果無干擾。證實(shí)該試驗(yàn)方法和條件下,供試品常山散對細(xì)菌和真菌無抑菌活性或其抑菌作用極其微弱,薄膜過濾法可用于對該供試品進(jìn)行細(xì)菌、真菌及酵母的檢查。

表1 薄膜過濾法回收率測定結(jié)果 (CFU/g,n=3)

2.3 控制菌檢查結(jié)果 見表2。結(jié)果表明,試驗(yàn)組、陽性對照組均檢出相應(yīng)的試驗(yàn)菌,而陰性對照組和陰性對照組均未檢出相應(yīng)的試驗(yàn)菌。證實(shí)薄膜過濾法可用于常山散的控制菌檢查,此方法成立。

表2 控制菌檢查方法驗(yàn)證結(jié)果(薄膜過濾法)

2.4 微生物限度檢查結(jié)果 見表3。結(jié)果表明,采用經(jīng)驗(yàn)證的薄膜過濾法對不同批次的常山散進(jìn)行微生物限度檢查,結(jié)果判定供試品符合口服固體制劑規(guī)定。

表3 不同批次中藥常山散的微生物限度檢查結(jié)果

3 討論

藥品的微生物污染控制是藥品質(zhì)量控制的重要指標(biāo),與化學(xué)藥品相比,中藥口服制劑的所用的原料藥材、生產(chǎn)工藝具有特殊性,對制劑微生物限度檢查結(jié)果的準(zhǔn)確性有可能產(chǎn)生重要影響。因此作為中藥口服制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的重要組成部分,藥品的微生物限度檢查是微生物學(xué)質(zhì)量與評價(jià)的重要依據(jù)。通過對藥物制劑進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證,才可確保微生物檢查方法的可靠性和檢查結(jié)果的準(zhǔn)確性[9-10,13]。微生物限度檢查法可用于判斷非規(guī)定滅菌制劑是否符合獸藥典的規(guī)定,也可用于指導(dǎo)制劑的微生物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定,及指導(dǎo)生產(chǎn)過程中間產(chǎn)品微生物質(zhì)量的監(jiān)控[3]。薄膜過濾法作為藥物檢驗(yàn)技術(shù)的一種方法,因其具有操作簡單、快速、數(shù)據(jù)準(zhǔn)確的特點(diǎn),而被應(yīng)用于多種藥品的微生物檢驗(yàn)。除此之外,薄膜過濾法還可以作為微生物的回收和檢驗(yàn)方法。該法在無菌檢查中可以快速集菌,在藥品微生物限度檢查中可以去除藥品中某些成分的抑菌作用,例如,應(yīng)用開放式的過濾器將貼膜法與過濾法進(jìn)行結(jié)合應(yīng)用,可以消除藥物的抗菌活性,大大提升菌落的回收率,使得回收率達(dá)到理想值,所以薄膜過濾法在藥品檢驗(yàn)中的應(yīng)用越來越被重視[2]。 從常山散的方法學(xué)驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果可以看出,取中藥常山散10 g,用pH值7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液加至100 mL,將其制備成1 ∶10 的供試液,經(jīng)過薄膜過濾法方法驗(yàn)證試驗(yàn),處理后的供試液對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉的加菌回收率均大于70%。表明常山散在此試驗(yàn)方法和條件下無抑菌作用或抑菌作用極微弱,可使加菌回收率達(dá)到滿意效果,且供試品、稀釋劑對此結(jié)果無干擾。另外,控制菌檢查的試驗(yàn)組、陽性對照組均檢出相應(yīng)的試驗(yàn)菌,而陰性對照組和空白對照組均未檢出相應(yīng)的試驗(yàn)菌。 表明中藥常山散的控制菌檢查可采用薄膜過濾法進(jìn)行,且結(jié)果可靠。

綜上,供試品中藥常山散的細(xì)菌、真菌和酵母計(jì)數(shù)方法和控制菌檢查方法均可采用薄膜過濾法進(jìn)行。本次試驗(yàn)供試品的細(xì)菌數(shù)、真菌和酵母數(shù)、控制菌3 項(xiàng)檢查結(jié)果均符合該品種項(xiàng)下的規(guī)定,通過對3 個(gè)批號常山散進(jìn)行微生物限度檢查,均符合要求,表明常山散已達(dá)口服固體給藥制劑的標(biāo)準(zhǔn)。其次,本次微生物限度檢查方法的建立可為水溶性差的中藥提取物制劑在進(jìn)行同類試驗(yàn)時(shí)提供技術(shù)理論上的參考,而且根據(jù)驗(yàn)證結(jié)果選擇準(zhǔn)確可靠、可操作性高的試驗(yàn)方法及條件,方可更好的滿足企業(yè)要求,從而共同提高藥品質(zhì)量。通過有效的微生物學(xué)質(zhì)量控制與檢驗(yàn),可全面了解藥品的微生物污染現(xiàn)狀與整體生產(chǎn)水平,并將其作為制定該藥品微生物限度檢查項(xiàng)和限值的參考,防止微生物的污染。