廖 蘭，文曉艷，陳林萍，張風麗，林維杰，楊彥紅，陳雪芹，張連岳，倪 莉*

（福州大學生物科學與工程學院，福建 福州 350108）

乳酸菌是食品工業(yè)中應用廣泛的一類益生菌。在老酵頭和酸面團等傳統(tǒng)發(fā)酵劑中，包含20余種酵母菌、50余種乳酸菌，主要以植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、短乳桿菌（Lactobacillus brevis）、發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）等為優(yōu)勢菌種[1-4]。乳酸菌主要作用于糖類和蛋白質降解，產(chǎn)生乳酸等有機酸以及小肽和游離氨基酸[5-6]。它在酸面團發(fā)酵過程中對提高面團風味、營養(yǎng)價值、抗菌性及改善面團流變學特性至關重要。此外，乳酸菌發(fā)酵可以減少乳糜瀉人群對小麥面制品的致敏性[7-8]。乳糜瀉是基因易感人群因攝入來自小麥、大麥、黑麥和衍生食品中的麩質而誘發(fā)T細胞介導的慢性腸炎疾病[9]。麥醇溶蛋白是乳糜瀉免疫反應的主要抗原蛋白[10]，富含大量谷氨酸（Glu）和天冬氨酸（Asp），難以被人體完全消化吸收。目前，加入乳酸菌長時（＞24 h）發(fā)酵酸面團降敏策略得到業(yè)界的認同，可對面團整體發(fā)揮降敏作用，被認為是一種安全無害、便捷有效的降敏方法，已應用于無麩質食品研制中并備受關注[11-13]。

不同種類的乳酸菌在面團發(fā)酵期間產(chǎn)生一系列特殊的蛋白水解酶，例如氨肽酶、羧肽酶和內肽酶等可以水解富含脯氨酸等肽段，消除致敏性表位，降低小麥面制品對乳糜瀉人群的致敏性[14]。植物乳桿菌是酸面團中最具競爭力的菌種[15]，Rollán[16]、Gerez[17]等從自然酸面團中分離的植物乳桿菌CRL759和CRL778能夠水解α-醇溶蛋白中的致乳糜瀉肽段p31～43和p62～75；舊金山乳桿菌（Lactobacillus sanfranciscensis）7A、LS3、LS10、LS19、LS23、LS38、LS47、短乳桿菌14G、消化乳桿菌（Lactobacillus alimentarius）15M和希氏乳桿菌（Lactobacillus hilgardii）51B等多種乳桿菌先后被報道用于長時發(fā)酵制備酸面團，降低了小麥蛋白致敏性和炎癥因子表達[18-19]。

本研究以與麥醇溶蛋白降敏程度顯著相關的產(chǎn)酸速率、酸化性能和蛋白質水解度為依據(jù)，篩選出具有相似表現(xiàn)的兩株乳酸菌——植物乳桿菌B02012和消化乳桿菌20998制備長時發(fā)酵面團，其中植物乳桿菌B02012由本實驗室前期紫外誘變獲得，具有高產(chǎn)酸和耐消化的特點，可作為一種乳酸菌制劑廣泛應用于微生態(tài)制劑中。同時，以可食性有機酸脫酰胺降敏小麥蛋白制備的發(fā)酵面團（化學酸化面團）和傳統(tǒng)酵母菌長時發(fā)酵面團為對照，探究兩株乳桿菌長時發(fā)酵對酸面團麥醇溶蛋白二、三級分子結構和免疫特性的影響及其相關性，以期初步篩選出可應用于開發(fā)低敏面食品的優(yōu)勢乳酸菌。本研究可為揭示乳酸菌發(fā)酵面團降敏機理提供一定理論依據(jù)，對于初步構建低敏長時發(fā)酵酸面團工業(yè)化生產(chǎn)體系有著重要的實際意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

植物乳桿菌B02012由實驗室自主誘變篩選后貯藏；消化乳桿菌20998 中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；酵母菌 安琪酵母股份有限公司；周麥28 河南周園種業(yè)有限公司。

一抗Wheat Gliadin 武漢華美生物工程有限公司；二抗免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）-辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）、BCA試劑盒上海貝博生物公司；MRS肉湯培養(yǎng)基 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；其他試劑均為分析純 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

FD5-3真空冷凍干燥機 美國西蒙國際公司；Nikon-E100顯微鏡 日本Nikon公司；PHS-3C pH計上海儀電科學儀器股份有限公司；DYCZ-24DN電泳儀北京六一儀器廠；JS-680B全自動凝膠成像分析儀 上海培清科技有限公司；8210E傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared Spectroscopy，F(xiàn)TIR）儀美國尼高力儀器公司；FluoroMax-4熒光分光光度計法國HORIBA Jobin Yvon公司；MULTIAKAMK3酶標儀芬蘭雷勃集團。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌生長曲線和pH值變化曲線的測定

取植物乳桿菌B02012和消化乳桿菌20998擴大培養(yǎng)的菌液，按照體積比1∶100的接種量接種于3 瓶MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃下振蕩培養(yǎng)，并分別于培養(yǎng)0、3、6、9、12、15、18、21、24 h取菌液5 mL，在600 nm波長處測定各菌液光密度值（OD600nm）。以各時間點菌液OD600nm為縱坐標，培養(yǎng)時間為橫坐標，繪制乳酸菌生長曲線。同樣條件下，采用pH計測定pH值，以各時間點菌液的pH值為縱坐標，培養(yǎng)時間為橫坐標，繪制乳酸菌生長期間pH值變化曲線。

1.3.2 乳酸菌活化及酸面團制備

乳酸菌的活化：參照王金水等[20]的方法并適當修改。無菌條件下分別取植物乳桿菌B02012、消化乳桿菌20998菌液，接入MRS液體培養(yǎng)基，于37 ℃、pH 6.8條件下培養(yǎng)24 h使乳酸菌活化。當用于面團發(fā)酵時，將活化的乳酸菌于37 ℃、pH 6.8條件下培養(yǎng)約14 h，再以體積分數(shù)為2%的接種量轉接到75 mL MRS液體培養(yǎng)基中，于37 ℃培養(yǎng)20 h，直至后期指數(shù)生長到成熟階段（約OD600nm＝2.3），菌體密度達到109CFU/mL。

酸面團的制備：取6 g小麥面粉、6 mL蒸餾水、1.1%的酵母菌（以小麥面粉質量計，后同）和/或8 mL乳酸菌懸浮液（菌體密度109CFU/mL），按以下方案混合得20 g面團，于37 ℃、200 r/min條件下發(fā)酵24 h后，冷凍干燥備用。各菌種發(fā)酵面團具體為：1）CK組：面團中不添加接種菌，添加0.05 mg/g紅霉素；2）SY組：面團中只添加1.1%（質量分數(shù)，下同）的酵母菌；3）SCA組：面團中不添加接種菌，采用乳酸和乙酸（物質的量比為4∶1）的混合物化學酸化至pH 3.9；4）SLB02012組：面團中只添加植物乳桿菌B02012懸浮液；5）SYLB02012組：面團中添加1.1%的酵母菌和植物乳桿菌B02012懸浮液；6）SL20998組：面團中只添加消化乳桿菌20998懸浮液；7）SYL20998組：面團中添加1.1%的酵母菌和消化乳桿菌20998懸浮液。將上述各組發(fā)酵0 h和24 h的面團冷凍干燥，磨粉備用。

1.3.3 發(fā)酵過程中面團pH值的測定

按照上述方法制備酸面團，各組面團分別于發(fā)酵0、3、6、9、12、15、18、21、24 h取樣1 g，均勻分散于3 mL水中，采用pH計測定發(fā)酵面團的pH值。

1.3.4 麥醇溶蛋白的提取

將面團等分試樣（每份12.75 g）用30 mL 50 mmol/L的Tris-HCl（pH 8.8）溶液稀釋，4 ℃條件下每15 min漩渦混合1 次，每次持續(xù)1 h，20 000×g下離心20 min。蒸餾水洗滌去除緩沖液離子，沉淀物懸浮于30 mL體積分數(shù)75%的乙醇溶液中，25 ℃下攪拌2 h，按上述條件進行離心。所得上清液即為麥醇溶蛋白，冷凍干燥保存。發(fā)酵面團中提取的麥醇溶蛋白簡寫為CK、SY、SCA、SLB02012、SYLB02012、SL20998、SYL20998（同1.3.2節(jié)）。

1.3.5 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳

根據(jù)Laemmli[21]的方法進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），并略作改動。配制質量分數(shù)10%的分離膠和質量分數(shù)5%的濃縮膠。取發(fā)酵0 h和24 h的冷凍干燥面團粉末于2 mL離心管中，加入pH 6.8、0.0625 mol/L Tris-HCl溶液，用體積分數(shù)5% β-巰基乙醇、質量分數(shù)2% SDS、體積分數(shù)10%丙三醇和體積分數(shù)0.002%溴酚藍組成的緩沖液配制2 mg/mL蛋白溶液，煮沸5 min。取10 μL上清液進樣，電泳結束后凝膠染色及脫色，于凝膠成像系統(tǒng)拍照觀察。

1.3.6 傅里葉變換紅外光譜測定

參照Wang Yu等[22]的方法進行FTIR測定。將各麥醇溶蛋白樣品和溴化鉀以質量比1∶100進行研磨，壓成1～2 cm薄片。全波長掃描（4 000～400 cm－1），每個光譜的掃描次數(shù)為64 次，分辨率為4 cm－1。用Omnic和PeakFit v4.12軟件計算酰胺I帶（1 700～1 600 cm－1）峰面積比例，分析蛋白質二級結構含量。

1.3.7 內源性熒光光譜測定

參照Wang Kaiqiang等[23]的方法進行內源性熒光光譜（intrinsic fluorescence scanning，IFS）測定。采用0.01 mol/L、pH 4.4的磷酸鹽緩沖液配制得到30 mL 0.2 mg/mL麥醇溶蛋白樣品溶液。于280 nm波長處激發(fā)，發(fā)射波長在300～400 nm范圍內記錄光譜，發(fā)射和激發(fā)狹縫寬度均為5 nm。

1.3.8 酶聯(lián)免疫吸附測定分析

參照宋宏新[24]、Dupont-Deshorgue等[25]的方法進行酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA），并略作修改。1）抗原包被：將麥醇溶蛋白樣品用碳酸鹽緩沖液（0.015 mol/L碳酸鈉和0.027 mol/L碳酸氫鈉）稀釋至10 μg/mL。各取100 μL/孔加入96 孔酶標板中，4 ℃過夜；2）洗滌：次日傾去酶標板96 孔板內的包被液，用磷酸鹽-吐溫緩沖液（phosphate buffered saline-Tween-20，PBST）洗板3 次；3）封閉：加入3%～55%的脫脂牛乳封閉液封阻，200 μL/孔，37 ℃封閉1 h，洗板；4）一抗孵育：根據(jù)前期探索的最佳稀釋度，采用1%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）＋PBST按體積比1∶1 000稀釋一抗，將稀釋后的一抗以100 μL/孔加入96 孔酶標板中，37 ℃孵育1 h；5）采用1% BSA＋PBST按體積比1∶2 500稀釋二抗，將稀釋后的二抗以100 μL/孔加入96孔酶標板中，37 ℃孵育1 h；6）四甲基聯(lián)苯胺（tetramethylbenzidine，TMB）顯色：棄酶標二抗，將TMB底物A、B等體積混合均勻，100 μL/孔，37 ℃恒溫箱中避光反應15 min；7）終止顯色：加入1 mol/L HCl終止液，100 μL/孔，終止顯色反應，用酶聯(lián)免疫檢測儀在450 nm波長處測定各孔的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有實驗數(shù)據(jù)均為3 次平行實驗計算所得平均值。結果應用SPSS軟件中最小顯著性差異多維分析法進行方差和顯著性分析（P＜0.05）。使用數(shù)據(jù)軟件XL-Stat（2016）進行聚類分析，以對麥醇溶蛋白二、三級分子結構和免疫特性數(shù)據(jù)歸類，進行統(tǒng)計學相關性分析。

2 結果與分析

2.1 植物乳桿菌B02012和消化乳桿菌20998的生長曲線和pH值變化曲線

圖1 植物乳桿菌B02012和消化乳桿菌20998的生長曲線（A）和pH值變化曲線（B）Fig. 1 Growth curves (A) and pH curves (B) of Lactobacillus plantarum B02012 and Lactobacillus alimentarius 20998

由圖1可知，植物乳桿菌B02012和消化乳桿菌20998兩株菌的生長曲線和pH值變化趨勢相似。0～2 h為乳酸菌生長延滯期，此時乳酸菌正在復蘇；4～15 h為對數(shù)生長期，乳酸菌呈指數(shù)型生長，大量繁殖；15～24 h為穩(wěn)定期，由于營養(yǎng)物質不足，乳酸菌的生長和死亡處于動態(tài)平衡。因此，兩株乳桿菌用于酸面團發(fā)酵的最佳收獲時間為20 h左右。從pH值變化情況來看，植物乳桿菌B02012和消化乳桿菌20998在生長24 h內pH值降低，且pH值下降趨勢與乳酸菌生長曲線相符合，乳酸菌處于對數(shù)生長期時pH值下降迅速，24 h后兩株菌的pH值均為3.6左右。

2.2 發(fā)酵過程中面團pH值變化

圖2 面團發(fā)酵過程中pH值變化Fig. 2 Changes in pH during dough fermentation

由圖2可知，添加植物乳桿菌B02012和消化乳桿菌20998面團的pH值變化趨勢接近，SLB02012、SYLB02012、SL20998和SYL20998組面團的pH值隨著發(fā)酵的進行開始迅速降低，發(fā)酵9 h后趨于平緩。此外，SLB02012、SL20998組面團的pH值最終至3.0，發(fā)酵6 h后始終低于SYLB02012和SYL20998組。CK和SCA組面團pH值在發(fā)酵過程中變化較小。面團SY的pH值在發(fā)酵前期緩慢降低，穩(wěn)定在pH 5左右，當發(fā)酵16 h后pH值由5快速降低至約3.5。以上結果說明，乳酸菌在面團發(fā)酵期間對pH值的變化起到主導作用，相對于酵母菌產(chǎn)酸速率更快。這是由于乳酸菌一方面可以產(chǎn)生以乳酸為主的有機酸，使面團快速酸化，pH值下降；另一方面較低的pH值可以促進溶解酸溶化合物。王金水等[8]在研究乳酸菌對發(fā)酵酸面團pH值的影響時發(fā)現(xiàn)，植物乳酸菌M616發(fā)酵期間可將面團的pH值從6.0降低至3.73，相比之下，植物乳桿菌B02012和消化乳桿菌20998酸化能力更強，酸化對于面團的風味至關重要。

2.3 全蛋白的SDS-PAGE變化

由圖3A可知，面團在發(fā)酵0 h時CK、SY、SCA、SLB02012、SYLB02012、SL20998、SYL20998組的全蛋白亞基條帶保持完好，說明此時蛋白質還未開始水解。與發(fā)酵0 h相比，面團發(fā)酵24 h（圖3B）變化較為明顯，部分高分子質量麥谷蛋白（high molecular weight glutenin subunits，HMW-GS）和麥醇溶蛋白條帶明顯變淺。CK組在整個發(fā)酵過程中各蛋白質條帶無明顯變化，SY和SCA組面團中HMW-GS和部分麥醇溶蛋白條帶變淡。SCA組面團中可食性有機酸會電離產(chǎn)生H＋，作為催化劑對小麥蛋白進行脫酰胺改性，導致蛋白肽鏈的斷裂和酰胺鍵水解反應，進而引起蛋白質發(fā)生部分降解[26]。2 種乳桿菌發(fā)酵面團的蛋白質條帶較其他組變化顯著。SL20998和SYL20998組面團，分子質量在66.2 kDa以上的條帶幾乎完全解離，而50 kDa左右的低分子質量亞基條帶和35 kDa處的條帶保持較好。植物乳桿菌B02012降解蛋白質能力大于消化乳桿菌20998，因此SLB02012、SYLB02012組面團在50 kDa左右及低分子質量麥醇溶蛋白的條帶變淡，且SLB02012中的蛋白質條帶相比SYLB02012更淡，這可能是因為乳酸菌產(chǎn)生的酸性環(huán)境在一定程度上抑制了酵母菌的生長，酵母菌同其競爭營養(yǎng)物質也影響了乳酸菌的生長[27]。小麥面粉中的蛋白酶主要是天冬氨酸蛋白酶及羧肽酶，它們在酸性條件下活力較強，由圖1、2可知，乳酸菌生長發(fā)酵過程中pH值下降，這為蛋白酶的最大活力提供了適宜條件，促進了蛋白酶對蛋白質的水解[28]；同時，乳酸菌中復雜的酶系對蛋白質也有降解作用，由于乳酸菌酶系的差異，各樣品蛋白質降解程度表現(xiàn)不同。

圖3 酸面團發(fā)酵0 h（A）和24 h（B）后小麥總蛋白條帶變化Fig. 3 SDS-PAGE of whole wheat proteins in sourdough after fermentation for 0 h (A) and 24 h (B)

2.4 麥醇溶蛋白的FTIR分析結果

為進一步研究乳酸菌發(fā)酵面團對麥醇溶蛋白二級結構的影響，利用FTIR對從發(fā)酵24 h面團中提取的麥醇溶蛋白進行測定。前人研究表明，3 200～3 600 cm－1代表—OH的伸縮振動，而2 800～3 000 cm－1代表—CH的伸縮振動。酰胺I帶（1 600～1 700 cm－1）主要為C＝O的伸縮振動，用來表征麥醇溶蛋白的二級結構，5 個峰位置對應于蛋白質中的二級結構，1 604.5、1 625.7、1 693.2 cm－13 個峰代表β-折疊，1 658.6 cm－1和1 679.7 cm－1分別代表α-螺旋和β-轉角[29]，結果如表1所示。

圖4 發(fā)酵24 h酸面團中麥醇溶蛋白的FTIR圖Fig. 4 FTIR spectra of gliadins in sourdough after fermentation for 24 h

表1 發(fā)酵24 h酸面團中麥醇溶蛋白二級結構含量Table 1 Secondary structures of gliadins in sourdough after fermentation for 24 h

由圖4可知，經(jīng)長時發(fā)酵處理后，蛋白質分子的很多特征吸收峰都發(fā)生了偏移。CK的—OH伸縮振動特征吸收峰為3 421.15 cm－1，而SY、SCA、SLB02012、SYLB02012、SL20998、SYL20998特征峰發(fā)生偏移，SLB02012和SYLB02012移動范圍分別為109 cm－1和112 cm－1，說明植物乳酸桿菌B02012對蛋白質中—OH影響顯著，這可能是其發(fā)酵過程中對氫鍵的作用所導致。SLB02012的—CH伸縮振動特征吸收峰從2 924.47 cm－1偏移到2 929.15 cm－1。與SL20998相比，SCA、SLB02012在酰胺I帶振動強度較大，表明可食性有機酸酸化和植物乳酸桿菌B02012發(fā)酵面團中麥醇溶蛋白分子的構象發(fā)生了變化，相比消化乳酸桿菌20998更能促進麥醇溶蛋白結構中的酰胺I帶伸縮振動。此外，SLB02012、SL20998相比SYLB02012和SYL20998在酰胺I帶振動強度更大，說明加入酵母菌后能夠減少2 種乳桿菌對麥醇溶蛋白中酰胺I帶的影響，這可能是因為加入的酵母菌與乳酸菌之間相互影響，兩者表現(xiàn)出一定的拮抗作用。

2.5 麥醇溶蛋白的IFS分析結果

在蛋白質分子中，發(fā)射熒光的氨基酸有色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）以及苯丙氨酸（Phe）。Trp、Tyr以及Phe由于其側鏈生色基團的不同，表現(xiàn)出的熒光激發(fā)和發(fā)射光譜也不同[27]。蛋白質中Tyr和Phe殘基對環(huán)境變化不敏感，而Trp殘基的天然熒光及其變化值可直接反映蛋白質三級結構本身和周圍環(huán)境的變化，可作為探針廣泛用于檢測蛋白質構象的變化[30]。

圖5 發(fā)酵24 h酸面團中麥醇溶蛋白的IFS圖Fig. 5 Intrinsic fluorescence spectra of gliadins in sourdough after fermentation for 24 h

由圖5可知，不同的發(fā)酵處理條件對麥醇溶蛋白IFS光譜的最大發(fā)射波長和熒光強度有一定影響。SL20998熒光強度最大，SCA和SLB02012相對較小。表2列出了樣品IFS掃描峰的波長及峰值（熒光強度）。

表2 發(fā)酵24 h酸面團中麥醇溶蛋白的IFS出峰波長和峰值Table 2 IFS maximum wavelengths and peak heights of gliadins in sourdough after fermentation for 24 h

由表2可知，SL20998的λmax發(fā)生紅移（從342 nm到343 nm），可能是因為在天然蛋白質中，色氨酸一般處于分子內部，被非極性氨基酸包圍，經(jīng)消化乳桿菌20998長時發(fā)酵后，蛋白質三級結構展開，聚集程度降低，處于分子內部的色氨酸逐漸暴露出來；因此，熒光強度增加，λmax發(fā)生紅移。相對于CK，SY、SLB02012和SYLB02012的λmax發(fā)生了藍移（從342 nm分別到341、341、340 nm），表明植物乳桿菌B02012發(fā)酵的面團中麥醇溶蛋白發(fā)生三級結構聚集，色氨酸暴露程度減少。

2.6 麥醇溶蛋白的ELISA分析結果

由圖6可知，SCA、SY、SLB02012、SYLB02012組面團經(jīng)過24 h發(fā)酵后麥醇溶蛋白免疫反應性相對于CK組呈下降趨勢，SLB02012中麥醇溶蛋白的免疫反應性降低了35%，下降最顯著，該降敏程度高于可食性有機酸酸化發(fā)酵面團和傳統(tǒng)酵母菌發(fā)酵面團。而SL20998和SYL20998組面團中麥醇溶蛋白免疫反應性非但沒有降低反而增強，分別增加了30%和14%。由IFS分析可知，SCA、SLB02012和SYLB02012的λmax發(fā)生藍移，蛋白質聚集，抗原表位被覆蓋，暴露程度小，被抗體識別的可能性小，從而使得免疫反應性降低。由SDS-PAGE分析可知，SLB02012組面團中的HMW-GS、中分子質量蛋白及麥醇溶蛋白條帶較其他各組面團的蛋白質水解程度更大，這可能使得原本可以被抗體識別的免疫表位由于蛋白發(fā)生了更大程度的水解，隨機去除抗原活性位點或增加了活性位點空間位阻，抗原暴露量減少，免疫反應性降低。FTIR結果表明，SCA組分子內β-折疊含量顯著減小，蛋白質可能發(fā)生了有機酸脫酰胺反應，有研究發(fā)現(xiàn)，脫酰胺反應可使麥醇溶蛋白免疫反應性降低具有降敏的效果[31]。消化乳桿菌20998引起免疫反應性增加，可能是由于麥醇溶蛋白降解成肽段反而暴露出更多的免疫性原位，從而受到抗體的識別，導致免疫反應性增加。SL20998、SYL20998組中β-轉角的含量明顯增加，有研究發(fā)現(xiàn)，β-轉角主要是天冬氨酸和谷氨酸構成的處于分子表面的二級結構[32]，面團經(jīng)過消化乳桿菌20998長時發(fā)酵后天冬氨酸和谷氨酸暴露程度增加，進而導致抗原表位增加，故免疫反應性較CK組呈現(xiàn)增強的現(xiàn)象。SL20998的λmax發(fā)生紅移，蛋白質聚集程度減小，結構伸展，更易暴露出免疫表位，這也導致了消化乳桿菌20998發(fā)酵面團免疫反應性增強[33]。

圖6 發(fā)酵24 h各面團中麥醇溶蛋白的酶聯(lián)免疫吸附能力Fig. 6 ELISA measurement of wheat gliadins in sourdough after fermentation for 24 h

2.7 層次聚類分析結果

為進一步驗證以上結果，采用層次聚類分析對各發(fā)酵面團樣品中麥醇溶蛋白二、三級分子結構與其酶聯(lián)免疫吸附能力進行統(tǒng)計學相關性分析。

由圖7可知，7 個樣品分為3 類：第1類樣品是加入了消化乳桿菌20998發(fā)酵的面團（SL20998、SYL20988），免疫反應性增強大于23%；第2類樣品為SY和SYLB02012，免疫反應性下降約14%；第3類樣品為SCA和SLB02012，免疫反應性降低約30%。該結果說明，相同聚類的樣品免疫反應性變化表現(xiàn)出相似性，且本研究中植物乳桿菌B02012發(fā)酵面團表現(xiàn)出和可食性有機酸酸化面團相近的降敏效果。有機酸脫酰胺雖然有大量文獻報道其降敏效果，但現(xiàn)有的酸隨機脫酰胺改性小麥蛋白方法仍存在爭議和不足。Denery-Papini等[34]研究指出，脫酰胺小麥蛋白仍對乳糜瀉敏感患者帶來強烈的致敏反應。Rahaman等[35]研究發(fā)現(xiàn)，低溫脫酰胺條件無降敏效果，當溫度高于100 ℃的中酸性條件時小麥蛋白的抗原性才會降低。相比之下，植物乳酸菌B02012在面團品質改善和降敏穩(wěn)定性表現(xiàn)出一定的優(yōu)勢。

圖7 層次聚類分析譜系圖Fig. 7 Dendrogram of agglomerative hierarchical clustering

3 結 論

通過對7 種長時發(fā)酵面團（CK、SY、SCA、SLB02012、SYLB02012、SL20998、SYL20998）中蛋白質分子結構變化測定發(fā)現(xiàn)，乳桿菌是面團中蛋白質降解的主導者。兩株乳桿菌雖然具有相似的產(chǎn)酸速率和酸化性能，但其發(fā)酵面團中蛋白質分子二、三級結構變化表現(xiàn)差異。與CK組相比，SLB02012組面團中β-折疊含量減少，α-螺旋含量下降最明顯，且α-螺旋含量/β-折疊含量的比值最小；SL20998和SYL20998中β-轉角含量明顯增加；SY、SLB02012和SYLB02012的λmax發(fā)生藍移，蛋白質聚集程度增加，SL20998熒光發(fā)生紅移，蛋白質三級結構展開，聚集程度降低。

對7 種長時發(fā)酵面團中麥醇溶蛋白免疫性的研究表明，消化乳桿菌20998引起免疫反應性增強，植物乳酸菌B02012具有顯著降低免疫反應的效果。

植物乳桿菌B02012是本實驗室經(jīng)紫外誘變后用于微生態(tài)制劑的乳酸菌，在酸面團長時發(fā)酵過程中對蛋白質進行降解，產(chǎn)生的小分子肽段、氨基酸和乳酸等物質可以豐富面團風味，而且表現(xiàn)出較好的降低免疫反應性的效果。植物乳桿菌B02012可作為優(yōu)勢菌用于開發(fā)低敏食品，對于構建低敏長時發(fā)酵酸面團工業(yè)化生產(chǎn)體系有著重要的實際意義。