羅玉龍，劉 暢，李文博，王柏輝，竇 露，杜 瑞，要 鐸，趙麗華，蘇 琳，靳 燁*

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018）

在肌肉組織中，氧化穩(wěn)定性是由脂質(zhì)氧化與抗氧化能力共同決定的。脂質(zhì)氧化主要是脂肪酸發(fā)生鏈?zhǔn)椒磻?yīng)并產(chǎn)生一系列代謝產(chǎn)物，包括醛、酮、醇、烴等，在大多數(shù)情況下，脂質(zhì)過(guò)度氧化會(huì)產(chǎn)生令人不愉悅的氣味[1-2]。同時(shí)，肉中存在的抗氧化系統(tǒng)能抑制氧化，使肉質(zhì)氧化達(dá)到平衡；不合理的飼養(yǎng)方式會(huì)使機(jī)體過(guò)度氧化，加快蘇尼特羊的衰老，使羊肉的質(zhì)量下降。肉中的抗氧化系統(tǒng)主要包括抗氧化酶系統(tǒng)與非酶系統(tǒng)：抗氧化酶系統(tǒng)以超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidases，GPx）為主；非酶系統(tǒng)指的是肌肉組織中的生育酚、類胡蘿卜素、酚類化合物等抗氧化物質(zhì)[3]。但當(dāng)氧化平衡被破壞后，肉品會(huì)加速氧化并引起品質(zhì)劣變，其貨架期會(huì)大幅縮短[4]。目前有關(guān)抗氧化系統(tǒng)的研究已有報(bào)道，但對(duì)肉中脂質(zhì)氧化產(chǎn)物的研究還比較少。Descalzo等發(fā)現(xiàn)肉中抗氧化系統(tǒng)由維生素、酚類物質(zhì)、抗氧化酶等組成，這些物質(zhì)能清除脂質(zhì)氧化形成的自由基，達(dá)到抑制脂質(zhì)氧化的作用[5]。Luciano等發(fā)現(xiàn)在肉羊飼料中添加單寧后，羊肉的抗氧化能力得到了明顯提升[6]。Ponnampalam等發(fā)現(xiàn)牧草中的VE能抑制放牧飼養(yǎng)羊肉中的脂質(zhì)過(guò)度氧化[7]。但以上學(xué)者對(duì)羊肉的氧化穩(wěn)定性鮮有系統(tǒng)、全面的研究，本團(tuán)隊(duì)也僅對(duì)絨山羊肉的抗氧化系統(tǒng)進(jìn)行了一定的研究[8]。因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)放牧飼養(yǎng)和舍飼飼養(yǎng)蘇尼特羊肉的脂質(zhì)氧化產(chǎn)物含量、抗氧化能力、抗氧化酶活力以及相關(guān)調(diào)控基因表達(dá)量進(jìn)行測(cè)定，對(duì)比兩種飼養(yǎng)方式對(duì)蘇尼特羊肉氧化穩(wěn)定性的影響；同時(shí)，分析脂質(zhì)氧化產(chǎn)物含量與抗氧化能力之間的聯(lián)系，為蘇尼特羊的科學(xué)化飼養(yǎng)提供一定的理論依據(jù)和指導(dǎo)方向。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

從烏拉特中旗畜牧業(yè)育種園區(qū)內(nèi)隨機(jī)選取發(fā)育正常、健康無(wú)病的放牧飼養(yǎng)和舍飼飼養(yǎng)蘇尼特羊各12 只（公母各6 只）。放牧飼養(yǎng)羊主要攝食牧草（包括中間錦雞兒、芨芨草、蒙古蔥、堿韭等）；舍飼飼養(yǎng)羊則以攝食飼草料（包括玉米秸稈、葵盤粉等）為主，并補(bǔ)充玉米精料及育肥飼料。

甲醇、氯仿、三氯乙酸（均為分析純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；CAT試劑盒、SOD試劑盒、GPx試劑盒、總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒、總蛋白定量試劑盒 南京建成生物工程研究所；2,2’-聯(lián)氮基-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt，ABTS） 美國(guó)Amresco公司；焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC） 美國(guó)賽默飛世爾科技公司；RNAiso Plus、6×loading buffer、Marker DL2000、Premix Taq?Version 2.0、PremeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser、SYBR?Premix Ex TaqTM大連寶生物工程有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Trace 1300型氣相色譜（gas chromatography，GC）儀、ISQ型質(zhì)譜（mass spectrometer，MS）儀、固相微萃?。╯olid-phase microextraction，SPME）手柄 美國(guó)賽默飛世爾科技公司；SPME萃取頭 美國(guó)Supelco公司；5810-R型低溫臺(tái)式冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；BG-power 5000型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀 北京百晶生物科技有限公司；水平電泳槽、凝膠成像分析儀、CFX96TM型實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qPCR）儀 美國(guó)Bio-Rad公司；普通PCR儀 美國(guó)Applied Biosystems公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

實(shí)驗(yàn)羊宰前禁食并停止飲水，屠宰后從每只羊的股二頭肌取約15 g肌肉，置于無(wú)菌無(wú)酶凍存管中于液氮中存放，于－80 ℃冰箱中保存待用。

1.3.2 脂質(zhì)氧化產(chǎn)物含量的測(cè)定

肉樣前處理：將肉樣解凍后去筋膜，切塊并用液氮速凍，用粉碎機(jī)粉碎，稱取5 g粉碎肉樣放入20 mL樣品瓶中，再將老化過(guò)的萃取頭插入樣品瓶，距離樣品1 cm，60 ℃水浴吸附40 min后取出萃取頭，插入GC進(jìn)樣口，在250 ℃下解吸4 min。

GC-MS條件[9]：TR-5色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），載氣為He；載氣流速1.0 mL/min；進(jìn)樣口、離子源和傳輸線溫度均為250 ℃；進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣；升溫程序：40 ℃保持3 min；以4 ℃/min升至150 ℃，保持1 min；再以5 ℃/min升溫至200 ℃，以20 ℃/min升至230 ℃，保持5 min；質(zhì)量掃描范圍m/z30～400；溶劑延遲時(shí)間1 min。MS數(shù)據(jù)經(jīng)MEANLIB、NISTDEMO和Wiley Library軟件檢索，取正反匹配度大于800數(shù)據(jù)。用峰面積表示蘇尼特羊肉中脂質(zhì)氧化產(chǎn)物含量（106AU/g）。

1.3.3 硫代巴比妥酸值、抗氧化酶活力和T-AOC的測(cè)定

肉樣4 ℃解凍后用預(yù)冷的生理鹽水漂洗，稱取0.5 g，加9 倍體積生理鹽水，在冰水浴中8 000 r/min勻漿30 s，制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%組織勻漿液，4 ℃、4 000 r/min離心10 min，取上清液，并按照試劑盒說(shuō)明書分別測(cè)定上清液中蛋白含量、SOD活力、GPx活力、CAT活力、硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）值以及T-AOC。

1.3.4 自由基清除率的測(cè)定

自由基清除率（radical scavenging ability，RSA）的測(cè)定參照文獻(xiàn)[10]的方法。將25 mL 14 mmol/L ABTS溶液與等體積的2.45 mmol/L K2S2O8溶液混合，黑暗條件下反應(yīng)16 h，使ABTS完全氧化而形成ABTS陽(yáng)離子自由基反應(yīng)液。稀釋ABTS陽(yáng)離子自由基反應(yīng)液，使其在734 nm波長(zhǎng)處的吸光度為0.750±0.020。取1.3.3節(jié)組織提取液50 μL與6 mL ABTS陽(yáng)離子自由基反應(yīng)液混合，30 ℃水浴反應(yīng)6 min后在734 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度。用等體積的去離子水代替組織提取液作為空白，RSA按下式計(jì)算。

式中：A0為空白組吸光度；A1為樣品組吸光度。

1.3.5 銅離子還原能力的測(cè)定

參照Apak等[11]的方法測(cè)定銅離子還原能力（cupric reducing antioxidant capacity，CUPRAC），將50 μL 1.3.3節(jié)組織提取液的上清液加入到反應(yīng)體系（1 mL 10 mmol/L氯化銅溶液、1 mL 1 mol/L乙酸銨溶液、1 mL 7.5 mmol/L新銅溶液（溶劑為體積分?jǐn)?shù)96%乙醇溶液））中，室溫反應(yīng)1 h，在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度。同時(shí)，用等體積的蒸餾水代替肌肉提取物作為空白對(duì)照，CUPRAC以抗壞血酸質(zhì)量計(jì)。

1.3.6 基因表達(dá)量的測(cè)定

1.3.6.1 引物與探針

引物序列如表1所示，由上海生工生物工程有限公司設(shè)計(jì)并合成，以18S rRNA作為內(nèi)參基因。

表1 qPCR引物Table 1 Primers used for real-time polymerase chain reaction

1.3.6.2 總RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄

稱取約100 mg肉樣，參照文獻(xiàn)[12]中方法進(jìn)行RNA的提取。測(cè)定RNA的吸光度（A260nm/A280nm）及質(zhì)量濃度后，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量。將RNA樣品稀釋至500 ng/μL，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書的兩步法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，將得到的cDNA放入－20 ℃冰箱內(nèi)保存。

1.3.6.3 qPCR分析

以c D N A為模板，S Y B R為熒光染料，按照CFX96TMReal-Time PCR Detection System的二步法操作。PCR體系：12.5 μL SYBR?Premix ExTaqTMII、1.0 μL引物F、1.0 μL引物R、2.0 μL cDNA模板、8.5 μL RNase Free dH2O。PCR程序?yàn)椋侯A(yù)變性95 ℃、30 s；變性95 ℃、5 s，退火60 ℃、30 s，延伸72 ℃、30 s，共35 個(gè)循環(huán)；延伸72 ℃、10 min。采用2－ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)用SPSS 20.0軟件進(jìn)行方差分析，組間顯著性檢驗(yàn)用Duncan’s法多重比較，數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用Excel軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 氧化指標(biāo)分析結(jié)果

2.1.1 不同飼養(yǎng)方式蘇尼特羊肉中脂質(zhì)氧化程度

羊肉在宰后成熟過(guò)程中極易被氧化而產(chǎn)生一些代謝產(chǎn)物，這不僅能引起羊肉的劣變，還能加速肉中肌紅蛋白的氧化，造成肉色變差，通常用TBA值反映肉的脂質(zhì)氧化程度[13-14]。舍飼飼養(yǎng)蘇尼特羊肉的TBA值高度顯著高于放牧飼養(yǎng)（P＜0.001），達(dá)到6.10 U/mg，這表明舍飼飼養(yǎng)蘇尼特羊肉的脂質(zhì)氧化程度更嚴(yán)重。放牧飼養(yǎng)羊肉的TBA值（1.37 U/mg）較低，這是由于放牧飼養(yǎng)羊長(zhǎng)期攝食大量的綠色牧草，而牧草中含有豐富的抗氧化物質(zhì)，能夠清除組織內(nèi)的自由基，有效阻止脂質(zhì)氧化，從而使得放牧飼養(yǎng)羊肉的脂質(zhì)氧化程度較低[15]。

2.1.2 不同飼養(yǎng)方式蘇尼特羊肉脂質(zhì)氧化產(chǎn)物比較

圖1 舍飼飼養(yǎng)蘇尼特羊肉脂質(zhì)氧化產(chǎn)物的GC-MS圖Fig. 1 Gas chromatography-mass spectrometric (GC-MS) profile of lipid oxidation products in meat from forage plus concentrate-fed sheep

圖2 放牧飼養(yǎng)蘇尼特羊肉脂質(zhì)氧化產(chǎn)物的GC-MS圖Fig. 2 GC-MS analysis of lipid oxidation products in meat from grazed sheep

由圖1、2可知，共檢測(cè)到26 種脂質(zhì)氧化產(chǎn)物，分別屬于醛類、酮類、醇類和烴類化合物。肉中的脂質(zhì)氧化可產(chǎn)生醛、醇、酮以及烴類等物質(zhì)，其含量在適宜的范圍內(nèi)可對(duì)羊肉的風(fēng)味產(chǎn)生積極的影響；含量過(guò)高則說(shuō)明肉中脂質(zhì)過(guò)度氧化，會(huì)導(dǎo)致肉的劣變[16]。

由表2可知，檢測(cè)到的醛類物質(zhì)主要包括己醛、庚醛、辛醛、壬醛以及苯甲醛等。己醛主要來(lái)源于亞油酸和花生四烯酸的氧化，是評(píng)定肉類脂氧化狀態(tài)的重要指標(biāo)[17]。己醛和壬醛是主要的脂質(zhì)氧化產(chǎn)物，而少部分的支鏈醛和芳香醛則由蛋白質(zhì)降解或與糖類相互作用產(chǎn)生[18]。在飽和醛中，放牧飼養(yǎng)蘇尼特羊肉中的己醛、辛醛和壬醛的含量顯著低于舍飼飼養(yǎng)（P＜0.05）；不飽和醛中，舍飼飼養(yǎng)蘇尼特羊肉中(E)-2-辛烯醛和(E,E)-2,4-十二碳二烯的含量顯著高于放牧飼養(yǎng)（P＜0.001，P＜0.05）；在芳香醛中，放牧飼養(yǎng)蘇尼特羊肉中苯甲醛的含量顯著高于舍飼飼養(yǎng)（P＜0.05）。整體上，對(duì)脂質(zhì)氧化程度影響比較大的醛類物質(zhì)主要有己醛、庚醛、辛醛、壬醛，均在舍飼飼養(yǎng)羊肉中含量較高。

醇類物質(zhì)也是脂質(zhì)氧化的產(chǎn)物，其中1-戊醇和1-己醇由棕櫚酸和油酸產(chǎn)生，而1-辛烯-3-醇的前體物質(zhì)為亞油酸和花生四烯酸，由LOX催化產(chǎn)生[19]。由表2可知，舍飼飼養(yǎng)蘇尼特羊肉中1-辛烯-3-醇的含量顯著高于放牧飼養(yǎng)（P＜0.05），但己醇和苯甲醇含量顯著低于放牧飼養(yǎng)（P＜0.01，P＜0.05）。兩種羊肉中含量比較高的醇類物質(zhì)為1-辛烯-3-醇，是脂質(zhì)氧化產(chǎn)物中醇類物質(zhì)的主要組成部分。

表2 兩種飼養(yǎng)方式蘇尼特羊肉的脂質(zhì)氧化產(chǎn)物Table 2 Lipid oxidation products identified in meat from Sunit sheep subjected to two feeding patterns

酮類化合物是脂肪氧化的另一種產(chǎn)物，本研究中共檢測(cè)出2 種酮類化合物。其中，舍飼飼養(yǎng)羊肉中2,3-辛二酮含量高度顯著高于放牧飼養(yǎng)（P＜0.001）。在脂類物質(zhì)氧化過(guò)程中，烷氧基被另一個(gè)烷游離基氧化從而生成2,3-辛二酮，其是酮類中最主要的脂質(zhì)氧化產(chǎn)物[20]。

烷烴類化合物主要由脂肪酸烷氧自由基均裂產(chǎn)生，在肉中占的比例較少[21]。蘇尼特羊肉中共檢測(cè)出2 種烴，分別為十三烷和十六烷。其中，放牧飼養(yǎng)羊肉中十三烷的含量顯著高于舍飼飼養(yǎng)（P＜0.05），而十六烷僅在放牧飼養(yǎng)羊肉中被檢測(cè)到。整體上，烷烴類物質(zhì)含量較低，不是脂質(zhì)氧化的主要產(chǎn)物。

綜上，脂質(zhì)氧化的主要產(chǎn)物為己醛、庚醛、辛醛、1-辛烯-3-醇以及2,3-辛二酮。這些物質(zhì)均在舍飼飼養(yǎng)羊肉中含量較高，進(jìn)一步反映了舍飼飼養(yǎng)羊肉的脂質(zhì)氧化程度比較嚴(yán)重。

2.2 兩種飼養(yǎng)方式蘇尼特羊肉抗氧化能力

表3 兩種飼養(yǎng)方式蘇尼特羊肉的抗氧化能力Table 3 Antioxidant properties in meat from Sunit sheep subjected to two feeding patterns

動(dòng)物機(jī)體內(nèi)存在著一套抗氧化機(jī)制，包括非酶與酶類物質(zhì)，其可清除組織內(nèi)的自由基，使機(jī)體呈現(xiàn)一種動(dòng)態(tài)平衡[22]。由表3可知，放牧飼養(yǎng)羊肉中的T-AOC高度顯著高于舍飼飼養(yǎng)（P＜0.001），這說(shuō)明放牧飼養(yǎng)羊肉的抗氧化能力較強(qiáng)。自由基可引發(fā)脂質(zhì)氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，而RSA則反映肌肉組織中所有抗氧化物質(zhì)組成的抗氧系統(tǒng)對(duì)自由基的清除能力[23]。RSA在飼養(yǎng)方式上沒有顯著性差異（P＞0.05）。CUPRAC能反映肉中抗氧化物質(zhì)的含量，放牧飼養(yǎng)羊肉中的CUPRAC顯著高于舍飼飼養(yǎng)（P＜0.05）。整體上，放牧飼養(yǎng)羊在抗氧化方面具有優(yōu)勢(shì)，這可能與肉中含有豐富的抗氧化成分有關(guān)，這些抗氧化成分能減輕肉質(zhì)的氧化損傷[24]。

2.3 兩種飼養(yǎng)方式蘇尼特羊肉中抗氧化酶活力

表4 兩種飼養(yǎng)方式蘇尼特羊肉的抗氧化酶活力Table 4 Antioxidant enzymes activities in meat from Sunit sheep subjected to two feeding patterns

肉中抗氧化酶系統(tǒng)通常以SOD、CAT和GPx為代表。SOD是第一個(gè)激活酶，它能清除超氧陰離子自由基產(chǎn)生H2O2和O2，隨后CAT和GPx清除H2O2，其活力能反映肉中抗氧化酶清除自由基的能力[25]。由表4可知，放牧飼養(yǎng)羊肉的SOD活力高度顯著高于舍飼飼養(yǎng)（P＜0.001）；CAT、GPx活力顯著高于舍飼飼養(yǎng)（P＜0.05）。CAT可繼續(xù)將由SOD催化產(chǎn)生的H2O2分解為H2O和O2；GPx可清除細(xì)胞液和線粒體中的脂質(zhì)氧化產(chǎn)物、H2O2及自由基，避免組織產(chǎn)生氧化損傷[26]。整體上，放牧飼養(yǎng)羊抗氧化酶活力高于舍飼飼養(yǎng)，一方面，這可能是因?yàn)榉拍溜曫B(yǎng)羊攝入了大量的抗氧化活性物質(zhì)，對(duì)抗氧化酶活力有協(xié)同促進(jìn)的作用；另一方面，放牧飼養(yǎng)羊活動(dòng)范圍較廣，運(yùn)動(dòng)量較舍飼飼養(yǎng)羊大，這也提高了其肌肉中抗氧化酶的活力[27]。有研究表明，適量的運(yùn)動(dòng)可增強(qiáng)抗氧化酶活力，清除組織中的自由基[28]；而舍飼飼養(yǎng)羊活動(dòng)范圍受限，運(yùn)動(dòng)量小，抵抗機(jī)體氧化的能力弱，從而導(dǎo)致其抗氧化酶活力較低。

2.4 兩種飼養(yǎng)方式蘇尼特羊肉的抗氧化酶相關(guān)基因表達(dá)量

表5 兩種飼養(yǎng)方式蘇尼特羊肉的抗氧化酶相關(guān)基因表達(dá)量Table 5 Antioxidant gene expression in meat from Sunit sheep subjected to two feeding patterns

組織內(nèi)調(diào)控抗氧化酶的相關(guān)基因有SOD、CAT和GPx，這些基因的表達(dá)量可進(jìn)一步反映抗氧化酶的活性[29]；而LOX基因能調(diào)控LOX活性，并反映肉中MDA含量。如表5所示，在兩種飼養(yǎng)條件下，4 種基因在蘇尼特羊肉中均有表達(dá)，放牧飼養(yǎng)羊肉中3 種抗氧化酶基因的表達(dá)量均高于舍飼飼養(yǎng)，其中SOD基因的表達(dá)量高度顯著高于舍飼飼養(yǎng)（P＜0.001）；CAT和GPx基因的表達(dá)量顯著高于舍飼飼養(yǎng)（P＜0.05）?？寡趸富虻谋磉_(dá)量能反映抗氧化酶的活性，進(jìn)一步從分子水平上驗(yàn)證了放牧飼養(yǎng)羊的抗氧化能力較舍飼飼養(yǎng)好。Vahedi等的研究也證實(shí)了羊肉中的抗氧化酶基因（SOD、GPx）表達(dá)量的增加能提高抗氧化酶活性[29]。脂質(zhì)的酶促氧化是在LOX的作用下進(jìn)行的，并會(huì)產(chǎn)生一些揮發(fā)性物質(zhì)，放牧飼養(yǎng)羊LOX基因表達(dá)量高度顯著低于舍飼飼養(yǎng)羊（P＜0.001），這說(shuō)明舍飼飼養(yǎng)羊肉中調(diào)控LOX的基因非?；钴S，從而加速了舍飼飼養(yǎng)羊肉的脂質(zhì)氧化。

3 結(jié) 論

舍飼飼養(yǎng)蘇尼特羊肉TBA值高于舍飼飼養(yǎng)，并且羊肉中的脂質(zhì)氧化產(chǎn)物含量較高，這表明舍飼飼養(yǎng)羊肉的脂質(zhì)氧化程度比較嚴(yán)重。放牧飼養(yǎng)羊的T-AOC、CUPRAC和SOD、CAT、GPx活力均高于舍飼飼養(yǎng)羊，這說(shuō)明放牧飼養(yǎng)羊肉的抗氧化能力較高，能有效抑制肉中的脂質(zhì)氧化。進(jìn)一步分析兩種飼養(yǎng)方式下羊肉中的抗氧化酶相關(guān)基因表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)舍飼飼養(yǎng)羊肉中LOX基因表達(dá)量高于放牧飼養(yǎng)，而SOD、CAT和GPx基因表達(dá)量均低于放牧飼養(yǎng)，從分子水平驗(yàn)證了舍飼飼養(yǎng)羊肉脂質(zhì)氧化程度更嚴(yán)重，而放牧飼養(yǎng)羊肉的抗氧化能力較好。