陳俊杰 楊長(zhǎng)青 張曉俊 柯少雄 盛淑婷 魏子白#

長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院附屬和平醫(yī)院消化內(nèi)科1(046000) 長(zhǎng)治衛(wèi)生學(xué)校附屬醫(yī)院病理科2

背景：研究表明腸道菌群、催產(chǎn)素受體(OTR)變化在腸易激綜合征(IBS)的發(fā)病中起有重要作用，但其潛在機(jī)制尚未完全闡明。目的：探討IBS患者腸道黏膜菌群特征和結(jié)腸黏膜OTR表達(dá)，以及兩者之間的相關(guān)性。方法：收集2017年7月—2017年12月長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院附屬和平醫(yī)院收治的符合羅馬Ⅳ標(biāo)準(zhǔn)的IBS-D、IBS-U患者結(jié)腸黏膜標(biāo)本，以13名健康體檢者作為對(duì)照。利用高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)腸道黏膜菌群組成、物種多樣性和豐度進(jìn)行評(píng)估。免疫組化法測(cè)定結(jié)腸黏膜OTR表達(dá)。結(jié)果：IBS-D組、IBS-U組和對(duì)照組腸道黏膜菌群以變形菌門(mén)、厚壁菌門(mén)、擬桿菌門(mén)為主。三組chao1指數(shù)、shannon指數(shù)相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與對(duì)照組相比，IBS組Granulicatella豐度顯著減少(H=6.212，P<0.05)，Tissierella豐度顯著增加(H=6.688，P<0.05)。IBS-D組Syntrophaceae、Porphyromonas、Marmoricola、Cardiobacteriales、Cardiobacterium、Cardiobacteriaceae豐度均顯著高于IBS-U組和對(duì)照組(P均<0.05)。IBS-D組、IBS-U組OTR表達(dá)均顯著高于對(duì)照組(P<0.01)。Tissierella豐度與結(jié)腸黏膜OTR表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.542，P<0.01)。Tissierella、Granulicatella豐度、結(jié)腸黏膜OTR表達(dá)與IBS嚴(yán)重程度無(wú)明顯相關(guān)性(P>0.05)。結(jié)論：IBS患者腸道黏膜菌群多樣性無(wú)明顯變化，部分菌群豐度發(fā)生改變，且不同亞型腸道黏膜菌群豐度變化不同。IBS患者結(jié)腸黏膜OTR表達(dá)上調(diào)，且與Tissierella豐度存在一定相關(guān)性。

腸易激綜合征(IBS)臨床上主要癥狀為腹痛、腹脹和排便習(xí)慣改變，其發(fā)病率高，約占總?cè)丝诘?1.2%[1]，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量、社會(huì)功能、工作效率，并導(dǎo)致巨大的衛(wèi)生保健服務(wù)成本。目前IBS的發(fā)病機(jī)制仍不完全清楚，其中腸道菌群紊亂在這一過(guò)程中起有重要作用，但尚未對(duì)IBS相關(guān)腸道菌群的特定組成改變達(dá)成共識(shí)。有研究[2-3]發(fā)現(xiàn)IBS患者腸道催產(chǎn)素受體(oxytocin receptors, OTR)表達(dá)上調(diào)且可誘導(dǎo)內(nèi)臟高敏感。故IBS患者腸道菌群紊亂與結(jié)腸OTR表達(dá)上調(diào)可能存在一定聯(lián)系。本研究通過(guò)探討IBS患者各亞型黏膜相關(guān)菌群特征和OTR表達(dá)，旨在探討腸道菌群紊亂與OTR表達(dá)之間的相關(guān)性。

材料與方法

一、資料來(lái)源

選取2017年7月—2017年12月長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院附屬和平醫(yī)院收治的IBS患者，診斷符合羅馬Ⅳ標(biāo)準(zhǔn)[4]。根據(jù)羅馬Ⅳ標(biāo)準(zhǔn)將IBS分為四種亞型：①便秘型IBS(IBS-C)：塊狀或干硬糞便≥25%，糊狀或水樣糞便<25%；②腹瀉型IBS(IBS-D)：糊狀或水樣糞便≥25%，塊狀或干硬糞便<25%；③混合型IBS(IBS-M)：塊狀或干硬糞便、糊狀或水樣糞便均≥25%；④不定型IBS(IBS-U)：糞便性狀不符合上述診斷標(biāo)準(zhǔn)者。硬便或塊狀便為Bristol分級(jí)1～2級(jí)，水樣便或糊狀便為Bristol分級(jí)6～7級(jí)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡18～60歲；②血尿便常規(guī)檢查無(wú)明顯異常；③腹部超聲、結(jié)腸鏡檢查無(wú)異常。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他疾病；②既往有腹部手術(shù)史；③近1個(gè)月內(nèi)曾連續(xù)使用抗菌藥物超過(guò)3 d；④近2周內(nèi)連續(xù)服用益生菌、通便藥、止瀉藥、促動(dòng)力藥超過(guò)3 d；⑤年齡<18歲或>60歲；⑥處于月經(jīng)期或哺乳期女性。選取同期健康體檢無(wú)明顯異常者作為對(duì)照組。本研究方案通過(guò)和平醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象均簽署知情同意書(shū)。

二、方法

1. 患者病情嚴(yán)重程度評(píng)估：由IBS患者根據(jù)自身情況填寫(xiě)IBS病情嚴(yán)重程度調(diào)查表，并計(jì)算評(píng)分。

2. 腸黏膜標(biāo)本收集：入選者禁食，在內(nèi)鏡檢查前5 h，將聚乙二醇電解質(zhì)散(江西恒康藥業(yè)有限公司)139.12 g溶解于2 L溫開(kāi)水中，每10 min服用250 mL，2 h內(nèi)服完。從距肛門(mén)近端25～35 cm處取黏膜組織2塊，分別用于檢測(cè)腸道黏膜菌群多樣性和豐度以及腸道黏膜OTR表達(dá)。

3. 腸道黏膜微生物DNA提取和組成評(píng)估：利用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(德國(guó)QIAGEN公司)，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)提取腸道黏膜菌群DNA，利用Thermo NanoDrop 2000紫外微量分光光度計(jì)和1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行總DNA質(zhì)檢。PCR擴(kuò)增基因組DNA，擴(kuò)增選擇區(qū)域?yàn)閂3～V4區(qū)，引物為F341和R806[5]，采用Illumina MiSeq平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序(由上海銳翌生物科技有限公司完成)。

4. 免疫組化法測(cè)定結(jié)腸黏膜OTR蛋白表達(dá)：按照兩步法進(jìn)行免疫組化染色(試劑購(gòu)自Abcam公司，工作濃度為1∶250)，封片后在顯微鏡下觀察并攝片。結(jié)果判定：細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒沉淀為陽(yáng)性細(xì)胞。每張切片選取視野清晰的5個(gè)不重復(fù)的高倍視野(×400)，運(yùn)用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件，計(jì)算光密度值并取均值。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、基本情況

研究期間，共納入25例IBS患者，其中男11例，女14例，平均年齡為(47.16±11.01)歲；IBS-U患者10例，其中男2例，女8例，平均年齡為(48.40±12.01)歲，嚴(yán)重程度評(píng)分為213.33±30.95；IBS-D患者15例，其中男9例，女6例，平均年齡為(46.33±10.64)歲，嚴(yán)重程度評(píng)分為210.67±45.27。對(duì)照組13名，其中男6名，女7名，平均年齡為(48.62±11.94)歲。IBS組和對(duì)照組性別構(gòu)成比、年齡相比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.016，P>0.05；t=0.376，P>0.05)。IBS-D組與IBS-U組性別構(gòu)成比、年齡、嚴(yán)重程度評(píng)分相比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.442，P>0.05；t=-4.52，P>0.05；t=-0.175，P>0.05)。

二、腸道菌群組成分析

IBS-D組、IBS-U組和對(duì)照組腸道黏膜相關(guān)菌群在門(mén)水平上以變形菌門(mén)(37.8%、43.2%、46.6%)、厚壁菌門(mén)(29.5%、26.4%、29.1%)、擬桿菌門(mén)為主(25.4%、23.7%、16.7%)(圖1)。

三、腸道菌群多樣性分析

Alpha多樣性分析顯示，IBS-D組、IBS-U組和對(duì)照組之間chao1指數(shù)、shannon指數(shù)相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖2)。

四、腸黏膜菌群豐度差異分析

與對(duì)照組相比，IBS組Granulicatella豐度明顯減少(H=6.212，P<0.05)；Tissierella豐度明顯增加(H=6.688，P<0.05)。IBS-D組Syntrophaceae、Porphyromonas、Marmoricola、Cardiobacteriales、Cardiobacterium、Cardiobacteriaceae豐度明顯高于IBS-U組和對(duì)照組(P均<0.05)(圖3)。

五、結(jié)腸黏膜OTR表達(dá)

免疫組化結(jié)果顯示，對(duì)照組、IBS-D組、IBS-U組結(jié)腸黏膜OTR表達(dá)分別為0.115±0.031、0.162 ±0.039、0.156 ±0.032，三組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=7.045，P<0.01)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，IBS-D組、IBS-U組OTR表達(dá)顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，而前兩組之間無(wú)明顯差異(P>0.05)(圖4)。

六、OTR表達(dá)與Granulicatella、Tissierella之間的相關(guān)性

Pearson相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸黏膜OTR表達(dá)與Granulicatella豐度無(wú)關(guān)(r=0.156，P=0.350)，而與Tissierella豐度呈正相關(guān)(r=0.542，P<0.01)。

七、Granulicatella、Tissierella豐度、OTR表達(dá)與IBS嚴(yán)重程度評(píng)分相關(guān)性

Pearson相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，Granulicatella、Tissierella豐度、OTR表達(dá)與IBS嚴(yán)重程度評(píng)分均無(wú)關(guān)(r=-0.187，P=0.372；r=-0.186，P=0.374；r=0.132，P=0.529)。

圖1 各組門(mén)水平上菌群組成

A：chao1指數(shù)；B：shannon指數(shù)

*P<0.05

A：對(duì)照組；B：IBS-D；C：IBS-U；D：OTR表達(dá)(#P<0.01)

討 論

IBS是臨床常見(jiàn)的腸道功能紊亂之一。Rangel等[6]發(fā)現(xiàn)IBS患者存在腸道菌群組成的改變。Crouzet等[7]將IBS患者糞便移植至無(wú)菌大鼠后，內(nèi)臟敏感性明顯升高。使用抗菌藥物、益生菌或益生元可改變IBS患者腸道菌群的組成，從而改善癥狀[8-9]。由此可見(jiàn)，腸道菌群在IBS中起有重要作用。本研究中，IBS患者腸道黏膜菌群以變形菌門(mén)、厚壁菌門(mén)、擬桿菌門(mén)為主，且菌群多樣性與對(duì)照組無(wú)明顯差異。與Tap等[10]的研究結(jié)果一致。與對(duì)照組相比，IBS組Granulicatella豐度明顯減少，Tissierella豐度明顯升高；IBS-D組Cardiobacteriales、Cardiobacteriaceae、Cardiobacterium、Syntrophaceae、Porphyromonas、Marmoricola豐度明顯高于IBS-U組和對(duì)照組。而Liu等[11]發(fā)現(xiàn)，與健康對(duì)照組相比，IBS患者乳酸桿菌、雙歧桿菌和普氏糞腸球菌豐度存在顯著差異，尤其是IBS-D患者乳酸桿菌和雙歧桿菌豐度明顯降低。各研究間結(jié)果不一致可能與研究對(duì)象的種族、飲食、文化、經(jīng)濟(jì)條件和地理位置差異，以及腸道菌群和糞便菌群存在差異等因素相關(guān)。

目前對(duì)腸道菌群的研究多基于糞便標(biāo)本，僅少部分?jǐn)?shù)據(jù)來(lái)自黏膜組織，這可能與糞便標(biāo)本取樣簡(jiǎn)單、來(lái)源豐富且易被研究對(duì)象所接受等優(yōu)勢(shì)有關(guān)。但糞便樣品在排便過(guò)程中容易受到污染和外部干擾，且有研究發(fā)現(xiàn)糞便標(biāo)本微生態(tài)組成隨收集時(shí)間變化而改變[12]。因此，黏膜標(biāo)本更能準(zhǔn)確反映腸道微生態(tài)改變。此外，有研究表明糞便標(biāo)本的微生態(tài)組成與腸道黏膜組織標(biāo)本存在顯著差異[6]，且糞便菌群和黏膜菌群在腸道可能發(fā)揮不同作用，糞便菌群主要通過(guò)其代謝產(chǎn)物影響腸道功能[13]，黏膜菌群可直接參與宿主免疫系統(tǒng)的相互作用[14]。

本組IBS-D組常見(jiàn)口腔致病菌Porphyromonas、Cardiobacterium豐度明顯高于對(duì)照組和IBS-U組，提示可能存在與IBS-D相關(guān)的口-腸移位途徑。IBS-D組Syntrophaceae豐度明顯高于對(duì)照組和IBS-U組。有研究發(fā)現(xiàn)Syntrophaceae可促進(jìn)甲烷的產(chǎn)生[15]，這可能與IBS-D患者腹脹、腹部不適相關(guān)。

OTR屬于G蛋白耦聯(lián)受體家族。Gong等[16]發(fā)現(xiàn)大鼠和人腸道黏膜肥大細(xì)胞上均有OTR表達(dá)，在內(nèi)臟高敏感中起重要作用。有研究[3]表明OTR拮抗劑阿托西班可促進(jìn)母嬰分離大鼠模型內(nèi)臟高敏感的恢復(fù)，提示OTR可能在內(nèi)臟高敏感中起有重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，IBS組結(jié)腸黏膜OTR表達(dá)上調(diào)，進(jìn)一步驗(yàn)證了上述研究結(jié)果。

Buffington等[17]的研究發(fā)現(xiàn)母體高脂飲食可導(dǎo)致后代腸道微生物組的改變，并誘導(dǎo)行為改變，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)母體高脂飲食后代下丘腦中催產(chǎn)素(OT)免疫反應(yīng)神經(jīng)元較少，這些改變可通過(guò)選擇性重新引入共生菌菌株而得以恢復(fù)。Sgritta等[18]發(fā)現(xiàn)羅伊乳酸桿菌可作用于迷走神經(jīng)，恢復(fù)自閉癥小鼠模型中腦腹側(cè)背側(cè)核被蓋區(qū)內(nèi)的社交誘導(dǎo)的突觸可塑性，從而逆轉(zhuǎn)小鼠社會(huì)行為缺陷；但對(duì)OTR缺乏的小鼠則無(wú)此作用。Varian等[19]發(fā)現(xiàn)細(xì)菌產(chǎn)物肽類(lèi)或代謝產(chǎn)物可能調(diào)節(jié)宿主OT分泌。上述研究表明腸道細(xì)菌及其代謝產(chǎn)物可影響宿主OT-OTR通路。本研究中，結(jié)腸OTR表達(dá)與Tissierella豐度存在明顯正相關(guān)，與上述研究結(jié)果一致。Tissierella主要分解肌酐產(chǎn)生乙酸鹽，有研究[20]表明腸道菌群代謝產(chǎn)物短鏈脂肪酸可導(dǎo)致大麻素受體和阿片受體在腸道表達(dá)下降，加重IBS疼痛。推測(cè)Tissierella代謝產(chǎn)物可能引起OTR表達(dá)上調(diào)，從而導(dǎo)致IBS內(nèi)臟高敏感，但由于研究條件受限，未能進(jìn)一步驗(yàn)證Tissierella與OTR之間的作用機(jī)制。

此外，本研究結(jié)果顯示結(jié)腸黏膜OTR表達(dá)、Granulicatella、Tissierella豐度與IBS患者嚴(yán)重程度無(wú)關(guān)，可能與IBS發(fā)病機(jī)制復(fù)雜相關(guān)。

總之，IBS亞型和對(duì)照組之間黏膜相關(guān)菌群差異可能是由于特定菌群的相對(duì)豐度改變?cè)斐傻模钦w改變所致。Tissierella豐度與結(jié)腸黏膜OTR表達(dá)存在一定相關(guān)性。這為進(jìn)一步研究腸道黏膜菌群、OTR在IBS發(fā)病中的作用提供了理論基礎(chǔ)，但具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。