李 春, 俞俊嶺

致瀉大腸埃希氏菌是我國腹瀉病門診重要病原菌之一。張子科等[1]統(tǒng)計(jì)2012-2015年在我國27省(直轄市、自治區(qū))170家醫(yī)院門、急診4萬多例腹瀉患者中致瀉大腸埃希氏菌的總檢出率為7.7%，且各地區(qū)也存在著差異，其中安徽、浙江、江蘇和河南等地的檢出率>10.5%。流行菌型以EAEC、EPEC和ETEC為主，不同地區(qū)，不同年齡人群、不同季節(jié)的流行特征存在差異。

我國關(guān)于致瀉大腸埃希氏菌的藥敏監(jiān)測(cè)及耐藥情況的分析較少，關(guān)于耐藥機(jī)制的研究就更為稀少。其耐藥狀況也不容忽視，石挺麗等人[2]2016年報(bào)道過廣州地區(qū)腹瀉兒童和健康兒童分離出的DEC耐藥及多重耐藥率較高，其中多重耐藥率高達(dá)50.5%。本次研究主要針對(duì)安徽省近5年來臨床分離EPEC的藥敏檢測(cè)結(jié)果及耐藥機(jī)制進(jìn)行研究分析。EPEC的檢出率占DEC的第2位，由于EPEC的致病性較強(qiáng)，流行較廣，作為本次重點(diǎn)研究對(duì)象。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1菌株來源 2013年1月至2017年12月，從安徽省7個(gè)地市10家哨點(diǎn)醫(yī)院6 000例臨床腹瀉患者糞便標(biāo)本中分離出的致瀉大腸埃希氏菌331株。

1.1.2主要儀器與試劑 VITECK-2(生物梅里埃公司)，ABI7500(AB公司)，DNA擴(kuò)增儀 (PTC-200)為MJ公司產(chǎn)品(U.S.A.)，凝膠成像儀Gel-DocXR為Bio-RAD公司產(chǎn)品(U.S.A.)，5種致瀉大腸埃希氏菌多重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)試劑盒購自碩士生物科技股份有限公司和卓成惠生生物技術(shù)有限公司(A2418)，GoTaq?Green Master Mix (Promega公司)。Thermo Scientific SensititreTM革蘭氏陰性菌MIC藥敏板。

1.2 方 法

1.2.1菌株鑒定分型。

1.2.1.1DNA模板的制備 挑取 5 個(gè)以上大腸埃希氏菌可疑菌落分別接種 TSI和營(yíng)養(yǎng)瓊脂，置于36 ℃培養(yǎng) 18 h。刮取營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上的過夜新鮮培養(yǎng)物 1～2 環(huán)，至裝有1 mL 0.85%滅菌生理鹽水的 Eppendorf 管內(nèi)，混勻。4 ℃，12 000 r/min 離心 15 min，棄去上清。沉淀加入 500 μL 滅菌去離子水中，混勻。100 ℃煮沸 10 min，12 000 r/min 離心 5 min，上清即為 PCR 擴(kuò)增模板。

1.2.1.2多重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè) 配制25 μL 反應(yīng)體系，使用ABI 7500 PCR儀進(jìn)行檢測(cè)，熒光PCR循環(huán)條件：95 ℃,15 min；(95 ℃，10 s；55 ℃,40 s/采集熒光)，共40個(gè)循環(huán)。

1.2.1.3結(jié)果分析與判定 EPEC結(jié)果判定：FAM、VIC、ROX和CY5熒光通道出現(xiàn)S型曲線且Ct≤30為陽性結(jié)果，毒力基因escV、bfp和內(nèi)參基因uidA陽性，判定為典型EPEC，毒力基因escV和內(nèi)參基因uidA陽性，判定為非典型EPEC[3]。

1.2.2艾伯特埃希氏菌鑒定 艾伯特埃希氏菌escV或eae陽性、 不發(fā)酵乳糖、 不發(fā)酵木糖、 動(dòng)力陰性。同時(shí)攜帶特異管家基因clpX、lysP和mdh。

1.2.2.1生化檢測(cè) 將疑似菌株接種麥康凱培養(yǎng)基于36 ℃，培養(yǎng)18 h，進(jìn)行乳糖發(fā)酵試驗(yàn)篩查，同時(shí)接種MIU 做動(dòng)力試驗(yàn)。選GN卡 用VITECK-2進(jìn)行生化試驗(yàn)，做蔗糖和木糖發(fā)酵試驗(yàn)。

1.2.2.2多重PCR檢測(cè) 采用clpX、lysP和mdh建立的多重PCR檢測(cè)方法， 對(duì)實(shí)驗(yàn)菌株和對(duì)照菌株進(jìn)行檢測(cè)[4]。反應(yīng)條件:預(yù)變性 94 ℃ 5 min，變性94 ℃ 30 s， 退火58 ℃ 30 s， 延伸72 ℃ 30 s， 35次循環(huán)， 最后72 ℃總延伸5 min。PCR反應(yīng)體系:在25 μL 體系中， 2×Taq MasterMix 12.5 μL， 10 μmol/L上、 下游引物各 1 μL， DNA 模板 1 μL， 去離子水9.5 μL。

1.2.3藥敏檢測(cè) 采用微量肉湯稀釋法，方法參照CLSI-2017。質(zhì)控菌株：ATCC 25922和ATCC 35218。

1.2.3.1挑取新鮮純菌落3～5個(gè)，用 4 mL 無菌生理鹽水充分混勻,調(diào)整菌懸液濃度至 0.5 麥?zhǔn)蠁挝?，?xì)菌濃度約為 1.5×108CFU/mL。取 50 μL 稀釋于 10 mL CAMHB肉湯中，充分混勻，15 min 內(nèi)使用。

1.2.3.2將制備好的菌懸液加至1 個(gè)無菌平皿中。每塊 96 孔藥敏板對(duì)應(yīng)一株待測(cè)菌。用多道移液器向96 孔藥敏板中加入菌懸液，每孔 100 μL。將接種后的 96 孔藥敏板加蓋，置于濕盒中，36 ℃培養(yǎng) 18 h，讀取MIC值。

1.2.4超廣譜β內(nèi)酰胺酶(ESBLs)檢測(cè) 方法參照CLSI-2017，用無菌蒸餾水配成0.5 OD值菌懸液，均勻涂抹在MH平皿上，待干燥后，將頭孢他定(30 μg)、頭孢他啶-克拉維酸(30/10 μg)、頭孢噻肟(30 μg)、頭孢噻肟-克拉維酸(30/10μg)按要求貼在平皿上，36 ℃培養(yǎng) 18 h。結(jié)果判定參照Table 3A。

1.2.5超廣譜β內(nèi)酰胺酶基因型檢測(cè)TEM、SHV和CTX-Mgroup1、CTX-Mgroup2、CTX-Mgroup9、CTX-Mgroup8/25分別采用多重PCR進(jìn)行檢測(cè)，引物序列參照下表1，具體方法參照文獻(xiàn)進(jìn)行[5]。

1.2.6喹諾酮類耐藥基因檢測(cè)qnrA、qnrB和qnrS采用多重PCR進(jìn)行檢測(cè)，aac-(6′)-Ib-cr、qepA、oqxAB采用普通PCR單個(gè)擴(kuò)增，上述5種基因PCR產(chǎn)物測(cè)序后在GENEBAN 進(jìn)行比對(duì)確認(rèn)。gyrA和parC基因PCR產(chǎn)物測(cè)序后用DNAMAN 8軟件進(jìn)行比對(duì)分析，查找基因突變位點(diǎn)及對(duì)應(yīng)的氨基酸改變。所用的引物序列參照下表2。

表1 檢測(cè)ESBLs基因型的多重PCR引物
Tab.1 Multiplex PCR-specific primers for ESBLs gene detection

基因名稱ESBLs 基因型引物序列 (5′-3′)產(chǎn)物大小/bpMultiplexI TEM,SHVTEM-1、TEM-2Multi- F CATTTCCGTGTCGCCCTTATTCMulti- R CGTTCATCCATAGTTGCCTGAC800SHV-1Multi-F AGCCGCTTGAGCAAATTAAACMulti-R ATCCCGCAGATAAATCACCAC713MultiplexII CTX-M group 1CTX-1 、CTX-M-3 、CTX- M-15MultiCTX-MGp1-F TTAGGAARTGTGCCGCTGYAMultiCTX-MGP1-R CGATATCGTTGGTGGTRCCAT688MultiplexII CTX-M group 2CTX-M-2MultiCTX-MGp2-F CGTTAACGGCACGATGACMultiCTXMGp2-R CGATATCGTTGGTGGTRCCA404MultiplexII CTX-M group 9CTX-M-9 、CTX-M-14MultiCTX-MGp9-F TCAAGCCTGCCGATCTGGTMultiCTX-MGp9-R TGATTCTCGCCGCTGAAG561MultiplexIII CTX-Mgroup8 /25CTX-M-8,CTX-M-25, CTX-M-26 and CTX-M- 39 to CTX-M-41MultiCTX-MGg8/25-F AACRCRCAGACGCTCTACMultiCTX-MGg8/25-R TCGAGCCGGAASGTGTYAT326

表2 檢測(cè)喹諾酮類耐藥基因的PCR引物
Tab.2 PCR Primers for Quinolones resistance genes

基因名稱引物序列產(chǎn)物大小/bp參考文獻(xiàn)gyrA-F5′ AAATCTGCCCGTGTCGTTGGT 3′343[6]gyrA-R5′ GCCATACCTACGGCGATACC 3′parC-F5′ AAACCTGTTCAGCGCCGCATT 3′395[6]parC-R5′ GTGGTGCCGTTAAGCAAA 3′aac(6′)Ib-cr-F5′ TTGCGATGCTCTATGAGTGGCTA 3′482[7]aac(6′)Ib-cr-R5′ CTCGAATGCCTGGCGTGTTT 3′qnrA-F5′ AGAGGATTTCTCACGCCAGG 3′580[8]qnrA-R5′ TGCCAGGCACAGATCTTGAC 3′ qnrB-F5′ GGMATHGAAATTCGCCACTG 3′264[8]qnrB-R5′ TTTGCYGYYCGCCAGTCGAA 3′qnrS-F5′ GCAAGTTCATTGAACAGGGT 3′428[8]qnrS-R5′ TCTAAACCGTCGAGTTCGGCG 3′ qepA-F5′ CGTGTTGCTGGAGTTCTTC 3′403[9]qepA-R5′ CTGCAGGTACTGCGTCATG 3′oqxA-F5′ CTCGGCGCGATGATGCT 3′392[10]oqxA-R5′ CCACTCTTCACGGGAGACGA 3′oqxBs5′ TTCTCCCCCGGCGGGAAGTAC 3′512[10]oqxBa25′ CTCGGCCATTTTGGCGCGTA 3′

2 結(jié) 果

2.1檢測(cè)結(jié)果 從331株致瀉大腸埃希氏菌中檢出非典型EPEC 85株，典型EPEC 1株，艾伯特埃希氏菌1株。10家哨點(diǎn)醫(yī)院統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示EPEC在腹瀉患者中的檢出率為1.4%(86/6 000)，EPEC占致瀉大腸埃希氏菌的26.0%(86/331)。艾伯特埃希氏菌分離自馬鞍山市第二人民醫(yī)院。

2.2藥敏結(jié)果 87株致病菌對(duì)氨芐西林、四環(huán)素和紅霉素耐藥率均超過50%，對(duì)亞胺培南、頭孢他定、頭孢西丁和環(huán)丙沙星耐藥率均在10%以下，頭孢噻肟的耐藥率為20.7%。其中對(duì)環(huán)丙沙星耐藥7株，中介耐藥1株，耐藥率達(dá)6.9%，全部為非典型EPEC。見圖1。

2.387株致病菌中檢測(cè)出產(chǎn)ESBLs 18株，檢出率為20.7%，其中頭孢噻肟/克拉維酸抑菌圈直徑比頭孢噻肟≥5 mm 14株，頭孢他啶/克拉維酸抑菌圈直徑比頭孢他啶≥5 mm 1株，兩者同時(shí)陽性是3株。

2.4超廣譜β內(nèi)酰胺酶基因檢測(cè)結(jié)果 臨床分離的18株產(chǎn)ESBLs腸致病大腸埃希氏菌檢測(cè)出的基因型以TEM和CTX-Mgroup9型為主，其次是CTX-Mgroup1型，SHV未檢出，見表3。

圖1 87株分離菌藥敏測(cè)試結(jié)果Fig.1 Drug sensitivity results of 87 isolates

表3 ESBLs耐藥基因型檢測(cè)結(jié)果
Tab.3 Results of ESBLs resistance genes

序列號(hào)TEMSHVCTX-M group 1CTX-M group 2CTX-M group 8/25CTX-M group 9菌株數(shù)1+-----32--+---33-----+14+-+---35+--+--16+---+-17+----+58+---++1合計(jì)140612718

2.5喹諾酮類耐藥基因檢測(cè)結(jié)果 根據(jù)藥敏結(jié)果從87株菌中篩出7株對(duì)環(huán)丙沙星耐藥，1株中介。這8株菌對(duì)萘啶酸100%耐藥。8株菌中有7株出現(xiàn)gyrA基因突變，第248位堿基C突變?yōu)門,對(duì)應(yīng)第83位氨基酸Ser替換為L(zhǎng)eu，7株中有3株同時(shí)出現(xiàn)第259位堿基G突變?yōu)锳,對(duì)應(yīng)第87位氨基酸Asp替換為Asn。有3株出現(xiàn)parC基因突變，第241位堿基G突變?yōu)門,對(duì)應(yīng)第80位氨基酸Ser替換為Ile。質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥基因qnrB陽性2株，qnrS陽性3株，aac(6′)-Ib陽性1株，其中qnrS和aac(6′)-Ib同時(shí)陽性1株。藥物外排泵基因qepA和oqxAB陽性各1株。7株菌同時(shí)出現(xiàn)以上2種甚至是3種耐藥機(jī)制并存， 1株以上3種耐藥機(jī)制均陰性。各株菌的耐藥機(jī)制詳見表4。

表4 喹諾酮類耐藥基因檢測(cè)結(jié)果
Tab.4 Results of Quinolone resistance genes

CIPqnrAqnrBqnrSaac(6′)-IbqepAoqxA/BgyrAparC氨基酸突變基因突變氨基酸突變基因突變4-+----S-83→LTCG-248→TTG8-+----S-83→LD-87→NTCG-248→TTGGAC-259→AACS-80→IAGC-241→ATC4--+--+S-83→LTCG-248→TTG8------>8----+-S-83→LD-87→NTCG-248→TTGGAC-259→AACS-80→IAGC-241→ATC2------S-83→LTCG-248→TTG8--+---S-83→LTCG-248→TTGS-80→IAGC-241→ATC8--++--S-83→LD-87→NTCG-248→TTGGAC-259→AAC

注:環(huán)丙沙星(CIP)R≥4,I=2,S≤1；S(Ser):絲氨酸，L(Leu):亮氨酸，D(Asp)天冬氨酸:,N(Asn):天冬酰胺，I(Ile)：異亮氨酸。帶下劃線的堿基為突變堿基。

3 討 論

10家哨點(diǎn)醫(yī)院近5年的監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)顯示EPEC是本地區(qū)引起腹瀉病的重要腸道致病菌之一。此次分離出艾伯特埃希氏菌1株，國外相關(guān)研究顯示艾伯特埃希氏菌與胃腸道疾病存在相關(guān)性，是一種重要的潛在食源性病原菌，在家畜、家禽和野生鳥類等動(dòng)物宿主中廣泛存在[11-12]。由于該菌易誤診為EHEC、EPEC或其他腸道致病菌，造成對(duì)該類菌株流行情況、致病性及臨床意義等認(rèn)識(shí)的低估和忽視。此次發(fā)現(xiàn)證實(shí)了安徽地區(qū)存在伯特埃希菌對(duì)人的感染和發(fā)病。

本研究主要是對(duì)臨床分離的EPEC進(jìn)行藥敏試驗(yàn)及耐藥機(jī)制檢測(cè)，主要涉及ESBLs及基因型的檢測(cè)分析和喹諾酮類耐藥基因的檢測(cè)分析。目前關(guān)于本地區(qū)EPEC耐藥情況的文獻(xiàn)較少，從本次藥敏試驗(yàn)的結(jié)果來看雖然對(duì)頭孢類和喹諾酮類保持較高的敏感性，但有部分菌株出現(xiàn)多重耐藥現(xiàn)象，對(duì)氨芐西林/舒巴坦、頭孢唑林和阿奇霉素呈現(xiàn)耐藥性增強(qiáng)的趨勢(shì)。國內(nèi)外對(duì)大腸埃希氏菌的耐藥性監(jiān)測(cè)和研究的比較多，但對(duì)致瀉大腸埃希氏菌耐藥性監(jiān)測(cè)報(bào)道的較少，因?yàn)樵撝虏【姆蛛x鑒定比較困難，在臨床上很容易被漏診或誤診。本研究開展EPEC藥敏監(jiān)測(cè)和耐藥性檢測(cè)分析具有一定的臨床參考價(jià)值，尤其是對(duì)于感染防控具有重要指導(dǎo)意義。

從AMS和AMP藥敏結(jié)果的比較來看，加酶抑制劑的抗生素能夠明顯降低檢測(cè)菌株的耐藥率，說明產(chǎn)生青霉素或頭孢菌素類的水解酶是產(chǎn)生耐藥的主要機(jī)制之一。ESBLs檢測(cè)結(jié)果證實(shí)了以上判斷，18株對(duì)頭孢噻肟或頭孢他啶耐藥的菌株100%產(chǎn)ESBLs。本地區(qū)分離的DEC產(chǎn)生的ESBLs的基因型以TEM(TEM-1、TEM-2)和CTX-Mgroup9 (CTX-M-9 、CTX-M-14)為主，其次是CTX-Mgroup1(CTX-M-1、CTX-M-3、CTX-M-15)，具體分型需要后續(xù)基因測(cè)序比對(duì)分析。Yong Huang等報(bào)道[13]中國華南地區(qū)兒童腹瀉患者分離的EPEC檢出的 ESBLs基因型是TEM、CTX-M-1和CTX-M-9。區(qū)別是他們檢出了SHV而本地區(qū)未檢出。據(jù)悉CTX-M型ESBLs廣泛分布在世界各地,并呈快速傳播趨勢(shì)[14-16],希望能夠通過本課題的研究了解安徽地區(qū)臨床分離的EPEC產(chǎn)ESBLs的狀況，能有效的預(yù)防和控制耐藥克隆株的傳播。

研究已發(fā)現(xiàn)gyrA、parC基因突變位點(diǎn)集中發(fā)生在 N 端核苷酸序列為199～318的區(qū)間內(nèi),即所謂氟喹諾酮耐藥決定區(qū)(QRDR)[17],本次試驗(yàn)有7株EPEC對(duì)喹諾酮類耐藥性的產(chǎn)生與QRDR突變有關(guān)。其中g(shù)yrA的突變發(fā)生在第248位堿基C→T,對(duì)應(yīng)的氨基酸改變?yōu)镾er-83→Leu，第259位堿基G→A,對(duì)應(yīng)的氨基酸改變?yōu)锳sp-87→Asn。parC的突變發(fā)生在第241位堿基G→T, 對(duì)應(yīng)的氨基酸改變?yōu)镾er-80→Ile。檢測(cè)結(jié)果與國外文獻(xiàn)報(bào)道相吻合[6,18]。證實(shí)本地區(qū)臨床分離的EPEC對(duì)喹諾酮類耐藥與藥物靶位及編碼基因的突變相關(guān)，主要體現(xiàn)在DNA促旋酶GyrA亞基和DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ ParC亞單位的基因突變。

本次試驗(yàn)質(zhì)粒介導(dǎo)氟喹諾酮類耐藥以Qnr蛋白家族中的QnrB和QnrS為主，少數(shù)菌株aac-(6′)-Ib-cr基因和藥物外排泵基因(qepA、oqxAB)陽性。提示本地區(qū)臨床分離的EPEC對(duì)喹諾酮類耐藥不單是藥物靶位及編碼基因突變的作用，其中質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥機(jī)制和藥物外排泵機(jī)制也在分離菌株中被證實(shí)，本次分離的耐藥株幾乎是藥物靶位及編碼基因的突變、質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥和藥物外排泵這3種機(jī)制中的2種甚至3種共同作用的結(jié)果。其中有1株菌以上3種耐藥機(jī)制全部為陰性，其耐藥機(jī)制需要進(jìn)一步研究。喹諾酮類藥物是臨床治療細(xì)菌性腹瀉的首選藥物，其耐藥率的變化需要監(jiān)測(cè)，耐藥機(jī)制需要進(jìn)一步的研究分析。

利益沖突：無