張慧娟，張恩民，賀金榮，李 偉，魏建春

蠟樣芽胞桿菌(簡稱蠟樣桿菌)在自然界廣泛分布，常存在于土壤、灰塵和昆蟲中，植物和許多生熟食品中也常見，臨床上該菌被認為是一種機會致病菌常引起食源性疾病，也被認為是一種污染菌引發(fā)外傷性眼內(nèi)炎、骨科創(chuàng)面感染以及在腫瘤等免疫低下人群中引起院內(nèi)感染等腸道外感染疾病[1]。

研究表明，無論是腸道內(nèi)還是腸道外感染，發(fā)病均與該菌分泌的毒素導致組織破壞或胞外酶活性產(chǎn)物有關(guān)，編碼這些毒素的毒力基因主要包括溶血性BL基因(hblC、hblD、hblA、hblB)、非溶血性基因(nheA、nheB、nheC)、腸毒素FM基因和T基因(entFM、bceT)、細胞毒素K基因(cytK)和嘔吐毒素相關(guān)基因(ces)[2]。但并不是所有蠟樣桿菌都含有全部毒力基因，而是存在菌株間的差異，不同的毒力基因分布與疾病的嚴重程度呈相關(guān)性[3]。我國部分地區(qū)已在食品的常規(guī)監(jiān)測中開展了蠟樣桿菌的污染與毒力基因的檢測工作，本研究中采集了我國12個省的不同分離來源的標本進行了毒力基因的檢測，以期深入了解臨床相關(guān)蠟樣桿菌的遺傳分布特征，為相關(guān)疾病的診斷處置提供科學的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1菌株 菌株包括分離自中國河北、海南、云南、內(nèi)蒙、四川、陜西、福建等12個省的蠟樣桿菌330株和購買的模式菌株3株(ATCC10876、ATCC13061和CMCC63301)，分離來源分為環(huán)境監(jiān)測標本(常規(guī)食品微生物監(jiān)測及土壤)和疾病相關(guān)標本(食物中毒食品及腸道外感染)2大類，具體包括米粉(96株)、奶粉(125株)、土壤(92株)、米飯(8株)、涼皮(5株)、眼內(nèi)炎(2株)或腫瘤患者(2株)等6種標本，所有菌株均由本室保存。

1.2 毒力基因檢測

1.2.1合成引物 針對上述的11個蠟樣桿菌可能含有的毒力基因，參考文獻檢索引物序列[4-5]，每對引物經(jīng)NCBI Blast比對驗證，確為相應毒力基因片段，引物合成由北京天一輝遠生物科技有限公司完成，引物序列及擴增片段長度見表1。

1.2.2PCR擴增 常規(guī)煮沸法制備菌株DNA模板，普通酶鏈聚合反應(PCR)方法擴增所有毒力基因片段，同時設(shè)立陽性和陰性對照。PCR反應體系為25 μL，包括2×EasyTaqTMPCR SuperMix(購自北京全式金生物技術(shù)有限公司)12.5 μL，上下游引物各1 μL(濃度10 μM)，DNA模板1 μL(濃度為100 ng/μL左右), 加無菌超純水補足至25 μL。PCR反應條件為95 ℃預變性5 min；95 ℃變性1 min, 55 ℃退火1 min, 72℃延伸1 min,共30循環(huán)； 72 ℃最后延伸5 min，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表1 本研究檢測毒力基因所用引物
Tab.1 Primers for virulence genes ofB.cereus

基因引物引物序列(5′-3′)長度/bphblAHA-FTTACCTGGTAGAATCGTA-CAAGATC164HA-RCCTGTATTAATCGCTTCTACCAT-TGhblBHB-FAAGCAATGGAATACAATGGG2 685HB-RAATATGTCCCAGTACACCCGhblCHC-FCCTATCAATACTCTCGCAA695HC-RTTTCCTTTGTTATACGCTGChblDHD-FACCGGTAACACTATTCATGC830HD-RGAGTCCATATGCTTAGATGCnheANA-FGTTAGGATCACAATCACCGC756NA-RACGAATGTAATTTGAGTCGCnheBNB-FGTGCAGCAGCTGTAGGCGGT328NB-RATGTTTTTCCAGCTATCTTTCG-CAATnheCNC-FTGGATTCCAAGATGTAATG684NC-RATTACGACTTCTGCTTGTGCcesNrps-FGACAAGAGAAATTTCTACGAG-CAAGTACAAT635Nrps-RGCAGCCTTCCAATTACTCCTTCT-GCCACAGTbceTBceT-FGACTACATTCACGATTACG-CAGAA304BceT-RCTATGCTGACGAGCTACATCCATAentFMentFM-FGTTCGTTCAGGTGCTGGTAC486entFM-RAGCTGGGCCTGTACGTACTTcytKcytK-FCGACGTCACAAGTTGTAACA565cytK-RCGTGTGTAAATACCCAGTT

1.3結(jié)果分析 采用SPSS21.0軟件，檢驗水準為α=0.05統(tǒng)計菌株檢測陽性毒力基因的數(shù)量，單因素方差分析不同標本毒力基因數(shù)的差異；計算菌株不同毒力基因的攜帶率，行×列資料卡方檢驗分析不同標本毒力基因攜帶率的統(tǒng)計學差異。

2 結(jié) 果

2.1菌株毒力基因攜帶情況 333株蠟樣桿菌11種毒力基因的檢測結(jié)果顯示，菌株所含毒力基因數(shù)量最少0個(30株，占9.01%)，最多10個(41株，占12.31%)，含4個毒力基因的菌株數(shù)量最多，占19.22%，其次是5個(16.82%)和9個(16.22%)，菌株平均攜帶毒力基因數(shù)5.97個。90.99%(303/333)的菌株檢出至少含有1個毒力基因，毒力基因在3個以上的菌株占到88.29%(225/333)，含有5個毒力基因以上的菌株占67.57%(294/333)，除嘔吐毒素基因外，全部10個毒力基因均檢出的菌株占12.31%(41/333)(圖1)。

圖1 菌株攜帶毒力基因個數(shù)Fig.1 Distribution of gene numbers of studied strains

2.2不同類型標本毒力基因數(shù)量比較 常規(guī)食品監(jiān)測的米粉和奶粉中毒力基因個數(shù)分別為5.78和5.71個，而在病例相關(guān)采集標本的米飯、涼皮和患者中基因個數(shù)分別達到了7.13，8.2和8.75個，均高于平均值，方差分析顯示，6種樣品的毒力基因攜帶數(shù)量之間無統(tǒng)計學顯著差異(F=1.917，P>0.05)，但兩兩比較顯示，患者與奶粉的基因個數(shù)統(tǒng)計學差異有顯著性(F=5.482，P<0.05)，涼皮與奶粉間有統(tǒng)計學差異顯著性(F=4.479，P<0.05)，其他類型樣品兩兩間無統(tǒng)計學差異(表2)。

2.3不同類型標本毒力基因攜帶率比較 毒力基因中非溶血性基因攜帶率最高，同時含有3種非溶血性基因(nheA、nheB、nheC)的菌株占61.86%，至少含有一種此基因的菌株則達89.19%；其余基因攜帶率從高到低依次為entFM基因(79.88%)、bceT基因(49.85%)、溶血性BL基因(48.35%)、ctyK基因(47.75%)和ces基因(1.50%)。其中，溶血性基因中hblB攜帶率較低(38.14%)，其他3種(hblA、hblC和hblD)攜帶率較高。

表2 不同樣本類型蠟樣桿菌毒力基因攜帶情況
Tab.2 Distribution of virulence gene numbers ofB.cereusin different specimens

樣品類型樣品數(shù)毒力基因平均數(shù)米粉965.78奶粉1255.71土壤926.22米飯87.13涼皮58.2患者48.75合計3305.97

不同類型標本毒力基因的攜帶率之間有差異，將樣本數(shù)較低(涼皮、眼內(nèi)炎和腫瘤患者)的標本除外，其余標本的各基因攜帶率比較顯示，米飯、米粉、奶粉和土壤的溶血性基因攜帶率有統(tǒng)計學差異顯著性(χ2=15.071，P<0.01)，米粉和奶粉的攜帶率較低，土壤攜帶較高；而非溶血性基因則在土壤中攜帶較低，其它標本中較高(χ2=9.603，P<0.05)；entFM基因也在土壤中較低，其它標本中較高(χ2=21.634，P<0.01)；cytK、bceT和ces基因在不同標本中的攜帶率均無統(tǒng)計學差異顯著性(表3)。

將樣本數(shù)較少的標本合并，比較疾病相關(guān)與環(huán)境監(jiān)測兩類標本的毒力基因攜帶情況，表4顯示溶血性基因在疾病標本中攜帶較高，有統(tǒng)計學差異(χ2=8.23，P<0.01)，其余基因在兩類標本中的攜帶率無統(tǒng)計學差異。

3 討 論

蠟樣桿菌作為一種重要的食源性疾病病原菌，在食品中的污染狀況和毒力基因分布近年來被廣泛關(guān)注。研究數(shù)據(jù)顯示，食品中的蠟樣檢出率多在10%以上，嬰幼兒食品和奶粉中在10%～30%，熟制米面制品中在20%～30%左右，在快餐盒飯、鐵路食品及市場攤點中污染更重，有的可達50%[6-10]，腐乳類食品和大米中的蠟樣檢出率可高達80%[11-12]。同時，醫(yī)院內(nèi)感染中，在開放性創(chuàng)傷的患者伴免疫力低下人群中蠟樣桿菌的分離率較高，眼內(nèi)炎也較多見，外傷所致的細菌性眼內(nèi)炎中蠟樣芽胞桿菌感染率僅次于金黃色葡萄球菌，位居第2，并且進展迅速，急驟惡化，可造成視網(wǎng)膜毀滅性損害[13]，是醫(yī)院感染中不可忽視的一種重要病原菌。

表3 各毒力基因在不同類型標本中的分布
Tab.3 Distribution of virulence genes ofB.cereusin different specimens

基因總攜帶率(n=333)不同類型標本的基因攜帶率(%)涼皮(n=5)米飯(n=8)米粉(n=96)奶粉(n=125)土壤(n=92)眼內(nèi)炎(n=2)腫瘤患者(n=2)其他(n=3)hblC48.35(161)80(4)62.5(5)38.54(37)38.4(48)67.39(62)100(2)100(2)33.33(1)hblD46.85(156)80(4)75(6)38.54(37)38.4(48)60.87(56)100(2)100(2)33.33(1)hblA45.65(152)80(4)62.5(5)38.54(37)36(45)60.87(56)100(2)100(2)33.33(1)hblB38.14(127)80(4)37.5(3)32.29(31)31.2(39)50(46)100(2)50(1)33.33(1)同時含4個hbl37.24(124)80(4)37.5(3)32.29(31)29.6(37)48.91(45)100(2)50(1)33.33(1)含任一hbl48.35(161)80(4)75(6)38.54(37)36.8(46)68.48(63)100(2)100(2)33.33(1)nheA84.38(281)100(5)100(8)83.33(80)87.2(109)80.43(74)50(1)100(2)66.67(2)nheB72.37(241)80(4)87.5(7)78.13(75)81.6(102)52.17(48)100(2)100(2)33.33(1)nheC82.28(274)100(5)100(8)86.46(83)86.4(108)69.57(64)100(2)100(2)66.67(2)同時含3個nhe61.86(206)80(4)87.5(7)67.71(65)68(85)44.57(41)50(1)100(2)33.33(1)含任一nhe89.19(297)100(5)100(8)90.62(87)93.6(117)80.43(74)100(2)100(2)66.67(2)ctyK47.75(159)60(3)50(4)48.96(47)36.8(46)60.87(56)50(1)50(1)33.33(1)ces1.50(5)00(0)1.04(1)3.2(4)0(0)0(0)0(0)0.00 entFM79.88(266)100(5)87.5(7)87.5(84)87.2(109)59.78(55)100(2)100(2)66.67(2)bceT49.85(166)60(3)50(4)44.79(43)44.8(56)59.78(55)50(1)100(2)66.67(2)

注：n表示樣本總數(shù)，括號內(nèi)數(shù)字表示相應基因擴增陽性數(shù)。

表4 疾病相關(guān)標本與環(huán)境監(jiān)測標本中毒力基因攜帶差異
Tab.4 Different carrying rate between clinical and enviromental monitoring specimens

基因類型疾病相關(guān)標本環(huán)境監(jiān)測標本陽性數(shù)陽性率(%)陽性數(shù)陽性率(%)χ2值P值hbl1482.3514646.658.230.00nhe1710027888.821.110.14ctyK952.9414947.60.180.18ces0051.60.240.77entFM1694.1224879.231.400.09bceT1058.8215449.20.600.15

蠟樣桿菌攜帶的毒力基因與致病性密切相關(guān)，食品中蠟樣桿菌毒力基因的調(diào)查顯示非溶血性基因和腸毒素FM基因的攜帶率均達90%左右，少數(shù)報道顯示腸毒素FM基因和T基因的攜帶率較低，約為20%～30%；溶血性基因和細胞毒素K基因的攜帶率不到50%，尤其是hblC和hblD的攜帶率有20%[6-7]；嘔吐毒素基因的檢出率最低，多在5%以下，但大米中含量較高，可達13.8%[12]。

本研究中菌株來源除了常規(guī)食品監(jiān)測樣本外，還包含了土壤分離菌株，食物中毒、眼內(nèi)炎、腫瘤患者等疾病相關(guān)標本分離菌株，重點分析了已知的蠟樣桿菌11個毒力基因的分布特征，尤其是在疾病相關(guān)標本中的特點，可為探索毒力基因的致病性提供參考。研究顯示，約90%的蠟樣菌株攜帶至少3個毒力基因，且約10%的菌株攜帶除嘔吐毒素基因外的所有毒力基因，菌株攜帶的平均毒力基因數(shù)目為5.97個，疾病相關(guān)標本所攜帶的毒力基因數(shù)目高于環(huán)境監(jiān)測標本。各個基因的分布特點顯示，與大多數(shù)報道一致[1,6-7]，非溶血性基因和腸毒素FM基因在菌株中的攜帶率均較高，分別為89.19%和79.88%，溶血性基因和細胞毒素cytK和腸毒素T基因的攜帶率均在50%左右，嘔吐毒素攜帶率最低1.50%。各毒力基因在米飯、米粉、奶粉和土壤這4類標本中的攜帶率比較顯示，溶血性基因、非溶血性基因和腸毒素FM基因在這些標本中的分布有統(tǒng)計學顯著差異，溶血性基因在土壤中的攜帶率較高，而后兩者則較低。其他毒力基因在這些標本中的攜帶無差異。同時，溶血性基因在疾病相關(guān)標本中的攜帶率相比環(huán)境監(jiān)測標本較高，而其余基因攜帶率則在兩類標本中無統(tǒng)計學差異。由此可見，毒力基因的數(shù)目和溶血性基因?qū)ο灅訔U菌的致病性具有一定的臨床意義。研究表明，溶血素HBL通過溶血亞基L2，溶血亞基L1和結(jié)合亞基B蛋白共同作用形成HBL成孔毒素或腸毒素。這3個HBL蛋白分別由hblC，hblD和hblA編碼，從一個操縱子共同轉(zhuǎn)錄，之后發(fā)現(xiàn)了B′蛋白，由hblB編碼，該蛋白與B蛋白有73%的同源性，位于起始的158個氨基酸上，且并不是所有含有hbl操縱子的菌株都含有hblB[1]，本研究顯示較低的攜帶率(38.14%)也驗證了這一結(jié)果。

利益沖突：無