黃 岳，劉云秋, 顏欣欣, 杭建雄, 冉榮坤, 孫永祥, 李國(guó)清

鉤蟲(chóng)是一類(lèi)被忽視的人獸共患的寄生蟲(chóng)，不僅影響著犬、貓等伴侶動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育，更是嚴(yán)重危害人類(lèi)的健康。1990年世界衛(wèi)生組織首次采用傷殘調(diào)整生命年(disability-adjusted life years，DALY)來(lái)評(píng)估鉤蟲(chóng)病對(duì)人類(lèi)健康的影響程度，2010年本病導(dǎo)致的缺鐵性貧血至少損失了320萬(wàn)DALY[1]。在熱帶和亞熱帶貧困地區(qū)，大約有7.4億人正在受到此病的困擾[2]。目前，鉤蟲(chóng)的抗凝血機(jī)制已經(jīng)引起了人們的關(guān)注，并從一些鉤蟲(chóng)分離出具有抗凝血活性的多肽即抗凝肽(anticoagulant peptides)，如犬鉤蟲(chóng)的AcaNAP10、錫蘭鉤蟲(chóng)的AceAP1和十二指腸鉤蟲(chóng)的AduNAP4[3-5]。然而，關(guān)于鉤蟲(chóng)抑制宿主血小板功能的機(jī)制尚不清楚。Valle等[6]雖然在犬鉤蟲(chóng)中分離出HPI(hookworm platelet inhibitor)蛋白，但對(duì)其生物學(xué)功能知之甚少。

本研究從錫蘭鉤蟲(chóng)的cDNA中克隆出AceHPI基因，將其在E.coliBL21(DE3)菌株中進(jìn)行原核表達(dá)，經(jīng)His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒(Ni-NTA 柱親和層析法)純化該融合蛋白,并且通過(guò)生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)了該蛋白的生物學(xué)特性。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1實(shí)驗(yàn)蟲(chóng)株 錫蘭鉤蟲(chóng)成蟲(chóng)由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院臨床外科教研室提供。

1.1.2主要試劑 pET-28a原核表達(dá)載體由本實(shí)驗(yàn)室保存。pMD-19T克隆載體、T4 DNA 連接酶、BamHI和NotI購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、E.coliBL21(DE3)工程菌、鼠抗His標(biāo)簽抗體和兔抗鼠IgG-HPR抗體購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司。MicroElute Total RNA Kit和M-MLV First Strand cDNA Synthesis Kit和Gel Extraction Kit D2500購(gòu)自廣州飛揚(yáng)生物工程有限公司。His標(biāo)簽純化試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)(上海)公司。

1.2 方 法

1.2.1總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄 取錫蘭鉤蟲(chóng)新鮮蟲(chóng)體，依據(jù)MicroElute Total RNA Kit試劑盒說(shuō)明書(shū)提取RNA，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)總 RNA濃度，并檢測(cè)其純度。參照M-MLV First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒的操作說(shuō)明書(shū)合成第一鏈cDNA，取總RNA 1 μg、oligo(dT)1 μL，10 mmol/L dNTP mix 1 μL，加DEPC水至18 μL，70 ℃孵育5 min后冰上急速冷卻；再依次加入5×反應(yīng)緩沖液5 μL、RNA酶抑制劑1 μL和逆轉(zhuǎn)錄酶1 μL，輕輕混勻并短暫離心后42 ℃孵育60 min，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2AceHPI基因的擴(kuò)增 參考已知的犬鉤蟲(chóng)HPI(AcaHPI)基因序列(No. AF399709.1)，從其ORF 兩端設(shè)計(jì)特異性引物HPI-F和HPI-R，擴(kuò)增目的基因；再設(shè)計(jì)上下游引物XL-F2和XL-R2去除目的基因信號(hào)肽序列(表1)。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸80 s，共35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸8 min。

表1 RT-PCR引物序列
Tab.1 Sequences of the primers for RT-PCR

NameSequenceProduct length /bpHPI-F5′-ATGAGCTCTTATCTTCTGGT-3′603HPI-R5′-TCAGTGACCAATGCAGAGCAAAT-3′XL-F25′-CGGGATCCGAAGGTGACTATTCGC-TATGCCAGC-3′568XL-R25′-TGGCGGCCGCGTGACCAATG-CAGAGCAAATTCT-3′

The underlined parts are the restriction enzyme sites ofBamHI andNotI

1.2.3原核表達(dá)載體的構(gòu)建 采用BamHI、NotI雙酶切質(zhì)粒pET-28a和目的基因PCR產(chǎn)物，對(duì)其酶切產(chǎn)物純化回收并用T4連接酶連接, 轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coliBL21(DE3), 挑取單菌落, 在卡那霉素抗性LB 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng), 取1 μL菌液進(jìn)行PCR 驗(yàn)證, 將其陽(yáng)性克隆送去生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。

1.2.4融合蛋白的表達(dá)與純化 將含有重組質(zhì)粒pET28a-AceHPI的大腸桿菌E.coliBL21(DE3)接種于10 mL卡那霉素(50 μg/mL)的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜, 再按1∶100比例轉(zhuǎn)接于200 mL卡那霉素液體培養(yǎng)基中，37 ℃, 185 r/min擴(kuò)大培養(yǎng)。待菌液OD 值達(dá)到0.4～0.6時(shí)，加入終濃度為 0.1 mmol/L的IPTG, 在28 ℃、165 r/min誘導(dǎo)6～10 h。離心收集菌體后, 再用10 mL PBS 懸浮菌體。菌液冰浴、超聲波破碎，所得細(xì)胞裂解液在12 000×g下離心10 min。收集上清液采用His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒進(jìn)行純化。純化后的重組蛋白使用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定其濃度。

1.2.5融合蛋白的Western-blot鑒定 將重組菌裂解上清液進(jìn)行SDS-PAGE電泳，在轉(zhuǎn)膜儀上15V處將其轉(zhuǎn)移到硝化纖維膜上，在含0.5%脫脂奶粉的TBST(含0.05%吐溫-20的TBS)中封閉2 h，再用鼠抗His標(biāo)記單克隆抗體(1∶6 000)和辣根過(guò)氧化物酶(HRP)結(jié)合兔抗鼠IgG(1∶20 000)孵育。采用Dab法檢測(cè)AceHPI融合蛋白的反應(yīng)原性。

1.2.6AceHPI的生物信息學(xué)分析 根據(jù)錫蘭鉤蟲(chóng)AceHPI基因核苷酸序列推測(cè)其蛋白的氨基酸序列，用DNAMAN軟件將其與犬鉤蟲(chóng)AcaHPI的氨基酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)。用DNAStar 軟件分析AceHPI蛋白的分子質(zhì)量、等電點(diǎn)等理化性質(zhì)。用ProtScale 軟件(http://web.expasy.org/cgi-bin/protscale/protscale.pl)分析AceHPI蛋白的疏/親水性；用在線(xiàn)工具SignaIP4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)分析AceHPI信號(hào)肽序列；用在線(xiàn)軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)對(duì)AceHPI 氨基酸序列進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)域分析；用SWISS-MODEL三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)軟件(http://swissmodel.expasy.org/)建立該蛋白的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)模型。

2 結(jié) 果

2.1目的基因PCR擴(kuò)增與重組質(zhì)粒的鑒定 以錫蘭鉤蟲(chóng)cDNA為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增、克隆和測(cè)序，獲得了全長(zhǎng)為603 bp的基因序列(No. MK087839)。重組質(zhì)粒pET28a-AceHPI用BamHI和NotI酶切后，獲得了大小約為603 bp的AceHPI片段，與預(yù)期目的片段大小一致(圖1)。

M: DNA marker; 1: Products from pET28a-AceHPI digested with BamHI and Not I.圖1 重組質(zhì)粒pET28a-AceHPI雙酶切鑒定Fig.1 Double enzyme digestion identification of pET28a-AceHPI

2.2融合蛋白的表達(dá)與鑒定 陽(yáng)性質(zhì)粒pET28a-AceHPI轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)菌株后，在IPTG誘導(dǎo)下其融合蛋白得到了有效表達(dá)。經(jīng)SDS-PAGE分析，該融合蛋白的分子量約為26 kDa。采用50 mmol/L的洗脫緩沖液洗脫，該融合蛋白產(chǎn)率約為1.1 mg/mL(圖2A)。經(jīng)Western blot分析，與抗HIS標(biāo)簽抗體結(jié)合的蛋白約為26 kDa(圖2B)，其大小與AceHPI融合蛋白的理論值一致。

2.3AceHPI蛋白同源性與生物信息學(xué)分析 測(cè)序結(jié)果顯示，AceHPI基因長(zhǎng)度為603 bp，共編碼200個(gè)氨基酸(圖3)。通過(guò)DNAMAN軟件比對(duì)，AceHPI與AcaHPI蛋白氨基酸序列同源性高達(dá)91%。

利用在線(xiàn)軟件對(duì)其氨基酸序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)果顯示，該蛋白分子質(zhì)量和等電點(diǎn)分別為22.5 kDa和7.0；疏水性平均系數(shù)(GRAVY)大于0，推測(cè)為疏水性蛋白(4A)；無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域(4B)，且該蛋白前17個(gè)氨基酸為信號(hào)肽序列(4C)；其三維結(jié)構(gòu)模型(4D)的全球性模型質(zhì)量估測(cè)值(GMQE值)為0.88，表明其建模質(zhì)量良好。

M: protein molecular weight marker; 1: product from induced pET28a-AceHPI; 2: precipitate of bacteria lysate;3: supernatant of bacteria lysate; 4: purified recombinant protein; 5: blank control; 6: recombinant proteins from pET-28a-AceHPI identified with the anti-His monoclonal antibody.圖2 重組蛋白AceHPI的SDS-PAGE(A)和Western-blot(B)分析Fig.2 SDS-PAGE (A) and Western-blot (B)analysis of the expression product of pET28a-AceHPI

圖3 AceHPI氨基酸序列的同源性比對(duì)Fig.3 Homology alignment of the amino acid sequence of AceHPI

A: hydrophilicity analysis of AceHPI; B: prediction of transmembrane helices in AceHPI; C: signal peptide analysis of AceHPI; D: prediction of tertiary structure of AceHPI.圖4 AceHPI蛋白的生物信息學(xué)分析Fig.4 Bioinformatics analysis of AceHPI protein

3 討 論

鉤蟲(chóng)病是一種以貧血為主的慢性消耗性疾病，對(duì)人類(lèi)和伴侶動(dòng)物(如犬、貓)的健康具有潛在威脅。錫蘭鉤蟲(chóng)是唯一一種可以在人體內(nèi)發(fā)育為成蟲(chóng)且可導(dǎo)致人重度感染的動(dòng)物源性鉤蟲(chóng)。由于它可以感染金黃倉(cāng)鼠，常作為鉤蟲(chóng)病研究的動(dòng)物模型。鉤蟲(chóng)血小板抑制劑的研究始于犬鉤蟲(chóng)和美洲鉤蟲(chóng)，最早發(fā)現(xiàn)其成蟲(chóng)的可溶性蛋白提取物和分泌排泄產(chǎn)物具有抑制二磷酸腺苷與纖維蛋白原誘導(dǎo)血小板聚集的功能[7-9]，后續(xù)研究表明該抑制劑可以阻斷GPIIb/IIIA和GPIA/IIA受體與各自配體的結(jié)合從而抑制血小板聚集[10-11]。據(jù)此Valle等[6]采用RP-HPLC技術(shù)從犬鉤蟲(chóng)成蟲(chóng)體內(nèi)分離出具有上述阻斷功能的兩種鉤蟲(chóng)血小板抑制劑，并用RACE-PCR技術(shù)首次擴(kuò)增出AcaHPI。分析AcaHPI蛋白結(jié)構(gòu)后，發(fā)現(xiàn)其具有不完全保守的CAP1至CAP 4序列，被認(rèn)為是CAP超家族成員[12]，具有作為鉤蟲(chóng)疫苗候選分子的潛力。

本研究首次報(bào)道了錫蘭鉤蟲(chóng)AceHPI基因的原核表達(dá)。由于該蛋白序列N端存在真核生物的信號(hào)肽序列，因而在E.coliBL21(DE3)菌株中表達(dá)量很低。為了提高該蛋白的表達(dá)量，隨后設(shè)計(jì)了一對(duì)去除信號(hào)肽序列的引物，避免了真核生物蛋白在原核表達(dá)時(shí)產(chǎn)生的不兼容性。由于HPI蛋白為疏水性蛋白，前人對(duì)犬鉤蟲(chóng)血小板抑制劑的研究一直未能采用原核表達(dá)系統(tǒng)對(duì)該蛋白進(jìn)行可溶性表達(dá)。雖然Ma等[12]對(duì)其原核表達(dá)的融合蛋白包涵體進(jìn)行了復(fù)性，但復(fù)性后的蛋白并不能保證其正確折疊且具有生物學(xué)活性。為了獲得可溶性AceHPI融合蛋白，本研究嘗試在低溫、低IPTG濃度和低轉(zhuǎn)速下誘導(dǎo)表達(dá)，結(jié)果在28 ℃、0.1 mmol/L濃度的IPTG和165 r/min的轉(zhuǎn)速下，可溶性融合蛋白的表達(dá)量明顯增加。本研究發(fā)現(xiàn)錫蘭鉤蟲(chóng)AceHPI與犬鉤蟲(chóng)AcaHPI的同源性為91%。利用相關(guān)軟件對(duì)其蛋白的親/疏水性、跨膜結(jié)構(gòu)域、信號(hào)肽序列和二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析并繪制其三維結(jié)構(gòu)模型，表明其為疏水蛋白，無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域，具有信號(hào)肽序列且位于前17個(gè)氨基酸，這些信息將有助于進(jìn)一步研究該蛋白的結(jié)構(gòu)特性。

本研究成功克隆了錫蘭鉤蟲(chóng)AceHPI基因，構(gòu)建了其重組表達(dá)質(zhì)粒并進(jìn)行了原核表達(dá)，對(duì)其編碼的氨基酸序列進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。上述研究為深入探究錫蘭鉤蟲(chóng)HPI在感染宿主體內(nèi)的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

利益沖突：無(wú)