徐 楊， 彭 慧， 蘇雪蓮

(濟(jì)南市第五人民醫(yī)院婦產(chǎn)科， 山東 濟(jì)南 250022)

卵巢癌是嚴(yán)重威脅女性健康和生命的三大生殖系統(tǒng)型惡性腫瘤之一。資料顯示近年來(lái)卵巢癌的發(fā)病率呈逐年上升和年輕化趨勢(shì)，患者的致死率高達(dá)85%[1]。缺乏特異性早期診斷指標(biāo)和治療抗性是卵巢癌高致死率的主要原因[2]。目前，卵巢癌的治療方案主要以早期手術(shù)切除為主輔以放化療，但轉(zhuǎn)移性卵巢癌對(duì)手術(shù)和藥物治療的預(yù)后較差[3]。因此，尋找和開(kāi)發(fā)卵巢癌靶向治療藥物迫在眉睫。

組蛋白賴氨酸N-甲基轉(zhuǎn)移酶EZH2(enhancer of zeste homolog 2)是PRC2復(fù)合物的核心組分，具有甲基轉(zhuǎn)移酶活性，催化組蛋白H3第27位賴氨酸三甲基化(H3K27me3)，在多種靶基因啟動(dòng)子上的修飾介導(dǎo)基因表達(dá)沉默[4]。研究發(fā)現(xiàn)EZH2在前列腺癌、乳腺癌和淋巴瘤中高表達(dá)[5-8]，提示EZH2是一個(gè)促腫瘤因子，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。細(xì)胞衰老(cellular senescence)是一種細(xì)胞周期的不可逆阻滯，是拮抗腫瘤細(xì)胞增殖的程序之一，因此通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞衰老來(lái)抑制或治療腫瘤的研究受到重視[9-10]。通過(guò)促衰老機(jī)制來(lái)治療腫瘤比其它細(xì)胞毒性藥物對(duì)人體的損傷更少，副作用更低[11]。因此，研發(fā)誘導(dǎo)細(xì)胞衰老的抗腫瘤藥在干預(yù)腫瘤方面有著廣闊的前景。近新研究發(fā)現(xiàn)，EZH2介導(dǎo)的H3K27me3與細(xì)胞衰老相關(guān)[12]；而卵巢癌細(xì)胞的放療耐受與DNA損傷修復(fù)和細(xì)胞衰老程序的異常密切相關(guān)[13]；研究表明EZH2異常表達(dá)能抑制卵巢癌細(xì)胞衰老，提示EZH2是開(kāi)發(fā)促卵巢癌細(xì)胞衰老療藥物的潛在靶點(diǎn)[14]。目前，EZH2促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞衰老的遺傳學(xué)或表觀遺傳學(xué)機(jī)制仍不完全清楚。本研究觀察EZH2異常表達(dá)對(duì)卵巢癌細(xì)胞衰老的影響，并探討其作用機(jī)制，為以EZH2為靶點(diǎn)開(kāi)發(fā)治療卵巢癌的新型表觀遺傳藥物提供科學(xué)依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 材料與試劑

1.1標(biāo)本收集 收集濟(jì)南市第五人民醫(yī)院婦產(chǎn)科2012年1月～2018年6月確診為卵巢腫瘤患者的癌組織35例和良性卵巢囊腫組織41例。所有患者均沒(méi)有接受放化療，標(biāo)本置于液氮中保存。所有患者術(shù)前簽署知情同意書(shū)，并獲得本院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2細(xì)胞株與試劑 人卵巢癌細(xì)胞系Hey、SKOV3、OVCAR3和COV434以及人正常卵巢上皮細(xì)胞IOSE80購(gòu)自ATCC；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)和雙抗購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；改良型RPMI-1640培養(yǎng)基、MTT、DMSO和Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Sigma；GSK126購(gòu)自ECM；抗EZH2、p53、p21和p16抗體購(gòu)自Cell Signal Technology；抗Ki67、caspase-3、cleaved caspase-3、PARP、cleaved PARP和H3K27me3抗體購(gòu)自Abcam；抗β-actin抗體購(gòu)自Santa Cruz；總RNA 提取試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time PCR)試劑盒(SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ)購(gòu)自 TaKaRa；BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Thermo。

2 方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng) Hey、SKOV3、OVCAR3和COV434細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基中；IOSE80細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基均含10% FBS、1%青霉素和1%鏈霉素，置于37 ℃、5% CO2及完全濕度的培養(yǎng)箱中。當(dāng)細(xì)胞密度為60%～70% 時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代。

2.2Real-time PCR 按照TRIzol試劑說(shuō)明書(shū)提取卵巢癌細(xì)胞系、癌組織和正常組織的總RNA。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)合成cDNA，反應(yīng)條件為42 ℃ 2 min、37 ℃ 20 min、85 ℃ 1 min，合成cDNA。取2 ng cDNA進(jìn)行real-time PCR反應(yīng)，引物序列見(jiàn)表1。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性5 min; 95 ℃ 20 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。采用SYBR Green Ⅱ熒光染料法和IQ5TMReal-Time PCR Detection System(Bio-Rad)進(jìn)行real-time PCR數(shù)據(jù)分析，結(jié)果經(jīng)β-actin校正，基因相對(duì)表達(dá)量用 2-ΔΔCt表示。

表1 Real-time PCR引物序列

2.3siRNA合成及細(xì)胞轉(zhuǎn)染 針對(duì)EZH2基因開(kāi)放閱讀框序列，運(yùn)用Ambion的網(wǎng)上在線軟件(http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html)設(shè)計(jì)EZH2小干擾RNA(EZH2small interfering RNA, siEZH2)，同時(shí)設(shè)計(jì)陰性對(duì)照siRNA(negative control siRNA, siRNA-NC)，由Sigma合成。Hey、SKOV3、OVCAR3和COV434細(xì)胞以每孔4×104個(gè)接種到6孔板中，細(xì)胞密度達(dá)到65%左右時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染(脂質(zhì)體2000法)。先用無(wú)血清OptiMEM培養(yǎng)液將脂質(zhì)體2000稀釋和配制10 mmol/L siRNA，然后將等體積脂質(zhì)體2000和siRNA輕輕混勻，室溫靜置10 min后加入細(xì)胞中，培養(yǎng)4 h后換成完全培養(yǎng)基；以轉(zhuǎn)染siRNA-NC為陰性對(duì)照。

2.4MTT法測(cè)定細(xì)胞活力 細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h時(shí)，以細(xì)胞密度為每孔2.5×104個(gè)接種96孔板，培養(yǎng)72 h時(shí)進(jìn)行MTT檢測(cè)；COV434細(xì)胞以每孔2.5×104個(gè)接種96孔板中培養(yǎng)24 h，棄掉培養(yǎng)基，加入終濃度為20 μmol/L的GSK126，以DMSO處理為對(duì)照組，作用72 h時(shí)進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)；加入20 μL 5 g/L的MTT，培養(yǎng)4 h后棄上清，加入150 μL DMSO，輕微振蕩使結(jié)晶完全溶解，酶標(biāo)儀測(cè)定570 nm處的吸光值(A)值。

2.5集落形成實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h時(shí)，細(xì)胞經(jīng)消化計(jì)數(shù)后以每孔1 000個(gè)接種于6孔板中培養(yǎng)，直到通過(guò)肉眼能清晰觀察到可見(jiàn)的細(xì)胞集落(>50個(gè)細(xì)胞)；COV434細(xì)胞以每孔1 000個(gè)接種于6孔板中培養(yǎng)24 h，棄掉培養(yǎng)基，加入終濃度為20 μmol/L GSK126，以DMSO處理為對(duì)照組，每隔3 d補(bǔ)充1次GSK126(終濃度均為20 μmol/L)；棄掉培養(yǎng)基，PBS洗滌，甲醇固定，PBS洗滌，吉姆薩染色，自來(lái)水清洗，晾干后計(jì)數(shù)，按下列公式計(jì)算：集落形成率(%)=細(xì)胞集落數(shù)平均值/鋪板細(xì)胞數(shù)×100%。

2.6流式細(xì)胞術(shù) COV43細(xì)胞經(jīng)終濃度為20 μmol/L GSK126或DMSO作用72 h時(shí)收集細(xì)胞；細(xì)胞轉(zhuǎn)染72 h時(shí)用PBS洗滌，胰酶消化、離心收集細(xì)胞，按照Annexin-V/PI試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，先加入500 μL的binding buffer重懸細(xì)胞，再加入5 μL FITC標(biāo)記的Annexin-V和5 μL PI混勻，室溫下避光孵育15 min，運(yùn)用流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡。

2.7電離輻射照射和SA-β-Gal染色 IOSE80細(xì)胞以每孔3 000個(gè)接種于6孔板，培養(yǎng)24 h時(shí)進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染，培養(yǎng)48 h時(shí)經(jīng)5 Gy電離輻射照射；將6孔板用封口膜封好，轉(zhuǎn)移至X射線輻照儀中照射，劑量率為0.36 Gy/min；電離輻射照射后72 h時(shí)按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作進(jìn)行β-Gal染色；顯微鏡下觀察并拍照，隨機(jī)選擇20個(gè)視野計(jì)數(shù)，取平均值，計(jì)算SA-β-Gal染色陽(yáng)性細(xì)胞率。

2.8Western blot實(shí)驗(yàn) siRNA轉(zhuǎn)染的Hey、SKOV3、OVCAR3和COV434細(xì)胞48 h時(shí)收集細(xì)胞。siRNA轉(zhuǎn)染的IOSE80細(xì)胞培養(yǎng)48 h時(shí)細(xì)胞經(jīng)5 Gy電離輻射照射培養(yǎng)72 h時(shí)收集細(xì)胞。COV434細(xì)胞經(jīng)終濃度為20 μmol/L GSK126或DMSO作用72 h時(shí)進(jìn)行5 Gy電離輻射，電離輻射后再補(bǔ)充1次GSK126，培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞。加入RIPA細(xì)胞裂解液(50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，150 mmol/L NaCl，1% NP-40，0.5% 脫氧膽酸鈉，0.1% SDS)，超聲破碎、12 000×g，4 ℃離心15 min，BCA法測(cè)定蛋白濃度；以20 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上，10%脫脂奶粉封閉，孵育 I 抗(EZH2、p53、p21、p16、caspase-3、cleaved caspase-3、caspase 9、 cleaved caspase 9、H3K27me3、H3K27me2、H3K27me1和β-actin)，4 ℃過(guò)夜。洗膜、孵育HRP-IgG II 抗，室溫1 h。ECL顯影后掃描，再用Quanity-One軟件分析。

2.9免疫組織化學(xué)染色和觀察 收集的卵巢癌組織及癌旁組織經(jīng)4%多聚甲醛固定24 h，石蠟包埋和切片。將組織切片固定，脫蠟，乙醇脫水，3% H2O2處理除去內(nèi)源性過(guò)氧化氫酶，0.01 mol/L檸檬酸緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)，孵育 I 抗(EZH2和Ki67)，洗片，孵育 II 抗，洗片，DAB顯色，封片待觀察。顯微鏡下觀察拍照，采用Image-Pro Express 6.0數(shù)碼成像系統(tǒng)軟件拍照分析。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)。采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)分析，結(jié)果用均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，兩組之間的比較采用t檢驗(yàn)，多組間的比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 EZH2在卵巢癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)水平

Real-time PCR結(jié)果顯示EZH2在卵巢癌組織中的mRNA表達(dá)水平顯著高于正常組織(P<0.01)，見(jiàn)圖1A；免疫組織化學(xué)染色結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)EZH2蛋白在卵巢癌組織中呈強(qiáng)陽(yáng)性染色，而在癌旁組織呈EZH2陰性或弱陽(yáng)性染色，見(jiàn)圖1B；同樣，4種卵巢癌細(xì)胞中的EZH2的mRNA和蛋白水平顯著高于IOSE80細(xì)胞(P<0.05)，見(jiàn)圖1C、D；EZH2的催化產(chǎn)物H3K27me3的水平也明顯增高(P<0.05)，見(jiàn)圖1D。這些結(jié)果提示EZH2的表達(dá)水平與卵巢癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。

Figure 1.The expression levels of EZH2 in the ovarian cancer tissues and cells. A: real-time PCR was used to detect EZH2 mRNA expression in the ovarian cancer tissues and normal tissues; B: immunohistochemical staining was used to detect EZH2 protein expression in ovarian cancer (n=35) and normal (n=41) tissues; C: the mRNA expression of EZH2 in the ovarian cancer cells and IOSE80 cells was detected by RT-qPCR; D: the results of Western blot for detecting EZH2 protein expression and H3K27me3 level in the ovarian cancer cells and IOSE80 cells. Mean±SD.n=3.##P<0.01vsnormal tissues;**P<0.01vsIOSE80 cells.

圖1 EZH2在卵巢癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)水平的比較

2 EZH2低表達(dá)對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖的影響

與siRNA-NC組細(xì)胞比較，siEZH2介導(dǎo)Hey、SKOV3、OVCAR3和COV434細(xì)胞中的EZH2低表達(dá)，同時(shí)H3K27me3的水平也明顯降低，但H3K27me2和H3K27me1水平無(wú)明顯變化，見(jiàn)圖2A；EZH2在4種卵巢癌細(xì)胞中的表達(dá)水平均顯著降低(P<0.01)，見(jiàn)圖2B；MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，干擾EZH2表達(dá)顯著抑制4種卵巢癌細(xì)胞的活力(P<0.01)，見(jiàn)圖2C；免疫組織化學(xué)染色結(jié)果表明Ki67(細(xì)胞增殖的標(biāo)志物)在卵巢癌組織中的表達(dá)水平顯著高于正常組織，見(jiàn)圖2D。集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，干擾EZH2的表達(dá)減少4種卵巢癌細(xì)胞的集落形成(P<0.01)，見(jiàn)圖3A、B；EZH2的甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑GSK126也能抑制卵巢癌細(xì)胞的集落形成(P<0.01)，見(jiàn)圖3A、C，其作用與干擾EZH2的表達(dá)類似。以上結(jié)果表明EZH2是一個(gè)腫瘤促進(jìn)因子，其高表達(dá)能促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞增殖，且EZH2促進(jìn)細(xì)胞增殖是通過(guò)H3K27me3發(fā)揮作用的。

3 EZH2低表達(dá)對(duì)卵巢癌細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，EZH2低表達(dá)或GSK126作用對(duì)4種卵巢癌細(xì)胞凋亡無(wú)影響，與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P>0.05)，見(jiàn)圖3D、E。

4 EZH2低表達(dá)對(duì)正常卵巢上皮細(xì)胞衰老的影響

干擾EZH2的表達(dá)明顯升高電離輻射誘導(dǎo)的IOSE80細(xì)胞 SA-β-Gal陽(yáng)性率，具有時(shí)間依賴關(guān)系，見(jiàn)圖4A。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，EZH2低表達(dá)的細(xì)胞SA-β-Gal陽(yáng)性率顯著高于siRNA-NC組細(xì)胞(P<0.01)，見(jiàn)圖4B。Real-time PCR結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，干擾EZH2的表達(dá)顯著促進(jìn)p16和p21的mRNA表達(dá)，具有時(shí)間依賴關(guān)系(P<0.01)，見(jiàn)圖4C、D。上述結(jié)果表明抑制EZH2介導(dǎo)的H3K27me3水平可促進(jìn)細(xì)胞衰老，進(jìn)而抑制卵巢癌細(xì)胞增殖。

5 EZH2低表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖信號(hào)通路的影響

Western blot結(jié)果顯示，在IOSE80細(xì)胞中干擾EZH2表達(dá)明顯激活p53及其下游靶基因p21的表達(dá)，同時(shí)細(xì)胞衰老通路重要標(biāo)志物p16的表達(dá)水平也被明顯激活；電離輻射照射激活p53、p21及p16的蛋白表達(dá)，而干擾EZH2能明顯抑制電離輻射誘導(dǎo)的p53、p21及p16表達(dá)(P<0.01)，見(jiàn)圖5A、C。相同條件下，下調(diào)EZH2對(duì)caspase-3和PARP的蛋白水平無(wú)影響，提示抑制EZH2表達(dá)不能激活細(xì)胞凋亡通路，見(jiàn)圖5A、E，與流式細(xì)胞術(shù)分析的結(jié)果相一致。我們用H3K27me3抑制劑GSK126作用COV434細(xì)胞后，同樣發(fā)現(xiàn)GSK126呈劑量依賴性抑制EZH2和H3K27me3的水平，但對(duì)H3K27me2和H3K27me1的水平無(wú)影響，見(jiàn)圖5B、D、F。同時(shí)，GSK126能激活p53和p16蛋白表達(dá)，具有劑量依賴關(guān)系，但對(duì)caspase 通路無(wú)影響，見(jiàn)圖5B、D、F。上述結(jié)果表明抑制EZH2表達(dá)通過(guò)降低H3K27me3水平，激活p53和p16通路而誘導(dǎo)細(xì)胞衰老。

Figure 2.The effect ofEZH2 expression knock-down on the viability and the expression of proliferation marker Ki67 in the ovarian cancer cells. A: siEZH2 transfection mediated the low expression of EZH2 in ovarian cancer cells; B: the quantitative analysis of EZH2 protein expression in ovarian cancer cells; C: MTT assay was used to detect the viability of ovarian cancer cells; D: the quantitative analysis of Ki67 protein expression in ovarian cancer (n=35) and normal tissues (n=41). Mean±SD.n=3.**P<0.01vssiRNA-NC group.

圖2 敲減EZH2表達(dá)對(duì)卵巢癌細(xì)胞活力和增殖分子表達(dá)的影響

Figure 3.The effect ofEZH2expression knock-down on colony formation and apoptosis of ovarian cancer cells. A: colony formation test to detect the colony formation ability of ovarian cancer cells; B and C: quantitative analysis of ovarian cancer cell colony formation rate; D and E: quantitative analysis of ovarian cancer cell apoptosis rate. Mean±SD.n=3.**P<0.01vssiRNA-NC group.

圖3 下調(diào)EZH2表達(dá)對(duì)卵巢癌細(xì)胞集落形成能力和細(xì)胞凋亡的影響

Figure 4.The effect ofEZH2expression knock-down on the senescence of IOSE80 cells after 10 Gy of ionizing radiation (IR). A: SA-β-Gal staining was used to detect cellular senescence (×10); B: quantitative analysis of SA-β-Gal positive rate of IOSE80 cells; C and D: real-time PCR was used to detected p21 and p16 mRNA expression in IOSE80 cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vssiRNA-NC group.

圖4 EZH2低表達(dá)對(duì)電離輻射后正常卵巢上皮細(xì)胞衰老的影響

討 論

多梳蛋白(Polycomb-group proteins, PcG)復(fù)合物由多梳蛋白抑制復(fù)合物1(Polycomb repressive complex 1, PRC1)和PRC2組成[15]，EZH2是PRC2的核心組成成分，是PcG家族成員中唯一具有甲基轉(zhuǎn)移酶功能的表觀遺傳沉默子，EZH2與靶基因啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合介導(dǎo)H3K27me3的修飾，沉默靶基因的表達(dá)[16-17]。研究表明EZH2介導(dǎo)的H3K27me3水平在多種腫瘤發(fā)生發(fā)展中具有重要作用[5-8]。EZH2和H3K27me3在原發(fā)性肝細(xì)胞癌中高表達(dá)，與其不良預(yù)后呈正相關(guān)，可作為肝細(xì)胞癌早期診斷的生物標(biāo)志物[18-19]。然而EZH2在卵巢癌中的生物學(xué)功能尚不完全清楚。本研究運(yùn)用real-time PCR、免疫組化及Western blot從mRNA和蛋白水平對(duì)卵巢癌組織樣本進(jìn)行EZH2表達(dá)水平的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)EZH2在卵巢癌組織中高表達(dá)，提示EZH2表達(dá)水平與卵巢癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。同時(shí)本研究在細(xì)胞水平進(jìn)一步證實(shí)EZH2和H3K27me3在4種卵巢癌細(xì)胞中高表達(dá)，與文獻(xiàn)報(bào)道EZH2及H3K27me3在其它腫瘤組織中高表達(dá)相符[5-8]。

本研究進(jìn)一步探討了EZH2和H3K27me3高表達(dá)對(duì)卵巢癌細(xì)胞惡性表型的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)干擾EZH2表達(dá)明顯降低H3K27me3的水平，而對(duì)H3K27me2和H3K27me1水平無(wú)影響，說(shuō)明H3K27me3是EZH2的特異性催化底物。同時(shí)干擾EZH2顯著抑制4種卵巢癌細(xì)胞增殖和集落形成，EZH2甲基轉(zhuǎn)移酶活性抑制劑GSK126對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用與干擾EZH2的表達(dá)類似，說(shuō)明下調(diào)EZH2表達(dá)抑制卵巢癌細(xì)胞增殖是通過(guò)降低H3K27me3水平而實(shí)現(xiàn)，相同條件下干擾EZH2對(duì)細(xì)胞凋亡無(wú)明顯影響。研究表明EZH2非特異性抑制劑DZNep通過(guò)激活DNA損傷應(yīng)答通路誘導(dǎo)肝細(xì)胞癌細(xì)胞凋亡[20]，與本研究結(jié)果不符。這可能與腫瘤類型以及藥物靶向性不高有關(guān)，因?yàn)镈ZNep具有非依賴于EZH2的生物學(xué)功能[21]。同時(shí)我們?cè)诼殉舶┙M織水平也發(fā)現(xiàn)Ki67(細(xì)胞增殖的標(biāo)志物)在卵巢癌組織中高表達(dá)，證實(shí)EZH2介導(dǎo)的H3K27me3水平能促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的惡性表型。

Figure 5.The effect ofEZH2expression knock-down on the protein levels of cell proliferation- and apoptotic signaling pathway-related molecules in the ovarian cancer cells. A: Western blot images of the proteins in IOSE80 cells 3 and 6 d after 5 Gy of ionizing radiation (IR); B: Western blot images of the proteins in COV434 cells treated with GSK126 3 d after 5 Gy of IR; C and E: the quantitative analysis of A; D and F: the quantitative analysis of B. Mean±SD.n=3.*P<0.01vssiRNA-NC group;#P<0.05vs0 μmol/L group.

圖5 下調(diào)EZH2表達(dá)對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖和凋亡信號(hào)通路相關(guān)分子蛋白水平的影響

研究發(fā)現(xiàn)EZH2通過(guò)表觀遺傳機(jī)制沉默多種腫瘤抑制因子的表達(dá)促進(jìn)腫瘤的發(fā)生，如miR-139-5p、miR-125b、miR-101、let-7c和miR-200b[22]；干擾EZH2表達(dá)通過(guò)抑制細(xì)胞自噬逆轉(zhuǎn)卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑的耐受[23]。SA-β-Gal染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)干擾EZH2表達(dá)明顯促進(jìn)電離輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老，同時(shí)細(xì)胞周期阻滯因子p21和細(xì)胞衰老標(biāo)志物p16的轉(zhuǎn)錄水平顯著增加，說(shuō)明EZH2通過(guò)調(diào)控細(xì)胞衰老通路而不是細(xì)胞凋亡通路促進(jìn)細(xì)胞惡性表型。我們用Western blot實(shí)驗(yàn)證這一假設(shè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)下調(diào)EZH2表達(dá)能激活p53及下游信號(hào)通路以及細(xì)胞衰老p16通路，對(duì)細(xì)胞凋亡通路如caspase 3和PARP通路無(wú)影響。本研究發(fā)現(xiàn)EZH2在卵巢癌組織中高表達(dá)，EZH2通過(guò)調(diào)控細(xì)胞衰老通路促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞惡性表型。因此EZH2可作為一種新的卵巢癌診斷標(biāo)志物及研發(fā)表觀遺傳藥物的靶點(diǎn)。