吳朝明， 鄭巨佳， 李芩耀， 潘薛波， 吳 帆， 林灼鋒△

(溫州醫(yī)科大學(xué) 1附屬第二醫(yī)院， 2藥學(xué)院，浙江 溫州 325035)

非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一種常見的代謝性疾病，其發(fā)病機(jī)制與機(jī)體與肝臟脂質(zhì)代謝異常密切相關(guān)。成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子21(fibroblast growth factor 21，F(xiàn)GF21)是一種新型的糖脂代謝調(diào)控內(nèi)分泌因子。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF21可通過調(diào)控機(jī)體肝臟脂質(zhì)代謝，從而調(diào)節(jié)小鼠體內(nèi)脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)[1-2]。然而，F(xiàn)GF21通過何種信號(hào)途徑發(fā)揮其降脂作用尚不明確。細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2，Erk1/2)通路參與機(jī)體廣泛的生理過程中。FGF21能夠通過增加Erk1/2磷酸化，增加THP-1巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞膽固醇外流[3]；降低HepG2細(xì)胞載脂蛋白的表達(dá)[4]；刺激下丘腦神經(jīng)元表達(dá)促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素，進(jìn)而促進(jìn)長(zhǎng)期禁食期間的肝糖異生，維護(hù)血糖穩(wěn)態(tài)[5]；抑制棕櫚酸或高血糖誘導(dǎo)的心肌凋亡[6]。由此可知，Erk1/2 通路在FGF21的生理作用的發(fā)揮中起著重要的作用。我們的前期研究表明，F(xiàn)GF21通過過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ)信號(hào)通路，上調(diào)脂肪組織中脂聯(lián)素的表達(dá)和分泌，從而發(fā)揮其增加胰島素敏感性的作用。然而，F(xiàn)GF21是否通過調(diào)節(jié)Erk1/2而參與肝臟脂質(zhì)代謝的調(diào)控，還有待進(jìn)一步探索。我們的研究通過腺相關(guān)病毒(adeno-associated virus,AAV)介導(dǎo)FGF21過表達(dá)及藥物抑制Erk1/2等相關(guān)實(shí)驗(yàn)來證明Erk1/2 在FGF21調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)代謝過程中所扮演的角色。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

8周齡SPF級(jí)雄性C57BL/6J野生型(wild-type,WT)小鼠購(gòu)自上海南方模式動(dòng)物中心，體重(19±1.3) g，許可證號(hào)為SCXK(滬)2017-0005。飼養(yǎng)環(huán)境為室溫20～24 ℃, 相對(duì)濕度40%～60%，基礎(chǔ)飼料由溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，自由攝食飲水，12 h/12 h交替照明。

2 主要試劑

人重組FGF21蛋白、U0126(MEK抑制劑，使Erk1/2失活)和油紅染色相關(guān)試劑購(gòu)自Sigma-Aldrich；DMEM液體培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自Gibco；固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白2(sterol regulatory element binding protein 2，Srebp-2)兔抗鼠多克隆抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology；Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和OneStep RT-PCR試劑盒購(gòu)自Thermo Fisher Scientific；FGF21 ELISA試劑盒購(gòu)自香港大學(xué)AIS公司；甘油三酯(triglyceride，TG)和總膽固醇(total cholesterol，TC)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司。所用引物由Thermo Fisher Scientific設(shè)計(jì)合成，見表1。

表1 RT-qPCR實(shí)驗(yàn)引物序列

3 主要方法

3.1小鼠的分組及處理 慢性實(shí)驗(yàn)取8周齡的WT雄性小鼠24只隨機(jī)分成4組，給予正常高脂飼料(high-fat diet，HFD)喂養(yǎng)4周，其中正常對(duì)照(control)組給予腹腔注射對(duì)照病毒AAV-GFP(1×1012pfu/mice)和DMSO；AAV-FGF21組給予腹腔注射AAV-FGF21(1×1012pfu/mice)處理和DMSO；U0126組給予腹腔注射同等劑量對(duì)照病毒和U0126(10 mg·kg-1·d-1)；AAV-FGF21+U0126組給予AAV-FGF21(1×1012pfu/mice)處理和U0126(10 mg·kg-1·d-1)，處理4周以后，處死小鼠，采集血液離心保存血清標(biāo)本，收集肝臟組織，稱重后，一部分固定于OCT組織包埋液中，制作冰凍切片；另一部分置于-80 ℃冰箱中保存。

3.2AAV-FGF21重組構(gòu)建包裝 由于重組人FGF21蛋白在體外的半衰期非常短，因此，我們采用構(gòu)建AAV-FGF21腺相關(guān)病毒表達(dá)的模式，進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究[7]。AAV-FGF21病毒的構(gòu)建、純化和病毒滴度鑒定等實(shí)驗(yàn)由武漢維諾賽生物技術(shù)有限公司完成。

3.3肝臟組織切片HE染色 肝組織切片干燥后入，采用二甲苯I和II脫蠟，并通過酒精梯度水化、蘇木素染色、1%鹽酸-乙醇溶液分化、弱氨水返藍(lán)后，再進(jìn)行伊紅染色。然后再進(jìn)行酒精梯度脫水、二甲苯透明、中性樹脂封片，最后進(jìn)行鏡下觀察拍照記錄。

3.4ELISA檢測(cè) 按照廠家提供的說明書操作。

3.5RT-qPCR實(shí)驗(yàn) 采用Trizol試劑提取組織總RNA，NanoDrop超微量分光光度計(jì)測(cè)定總RNA含量。取1.0 μg RNA進(jìn)行一步法RT-PCR，總反應(yīng)體積20.0 μL。逆轉(zhuǎn)錄完成后取1 μL cDNA進(jìn)行qPCR。擴(kuò)增條件為:50 °C逆轉(zhuǎn)錄30 min；95 ℃初始化15 min；94 °C變性1 min、55 ℃ 1 min、72 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。

3.6Western blot實(shí)驗(yàn) 提取小鼠肝臟組織總蛋白，BCA 法測(cè)定總蛋白濃度。10% SDS-PAGE分離，PVDF 膜印跡，10%脫脂奶粉室溫下封閉1 h，加入抗GAPDH 抗體(1 ∶1 000)和抗Srebp-2抗體(1 ∶1 000)，4 ℃孵育過夜。用封閉液稀釋相應(yīng)的經(jīng)辣根過氧化物酶標(biāo)記的II 抗(1 ∶5 000)37 ℃搖床孵育1 h。洗去多余 II 抗，經(jīng)ECL 發(fā)光液發(fā)光、X 光膠片壓片后顯影、定影。分析膠片灰度值，確定樣品中目的蛋白相對(duì)含量。

3.7小鼠肝臟細(xì)胞原代培養(yǎng) 小鼠肝臟細(xì)胞原代培養(yǎng)采用經(jīng)門靜脈酶灌注法進(jìn)行，即通過小鼠門靜脈按照6 mL/min的速度灌注0.05% 膠原酶消化液，當(dāng)整個(gè)肝臟的顏色變白后，停止消化。小心取下整個(gè)肝臟，采用細(xì)胞scraper和鑷子機(jī)械分離肝臟，過100 μm篩網(wǎng)，50×g離心5 min，棄上清，臺(tái)盼藍(lán)染色，查看細(xì)胞存活率。用DMEM-A培養(yǎng)液[DMEM，pH 7.4，添加 25 mmol/L 葡萄糖、2 mmol/L 谷氨酰胺、200 nmol/L (R)-N6-(1-methyl-2-phenylethyl) adenosine、100 mg/L慶大霉素和 25 mmol/L HEPES]于37 ℃和5% CO2的條件下培養(yǎng)。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 Erk1/2失活對(duì)AAV-FGF21抑制HFD喂養(yǎng)小鼠體重增加的影響

體重監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示，HFD喂養(yǎng)4周后給予AAV-FGF21處理能顯著抑制HFD引發(fā)的小鼠體重異常增加(P<0.05)，見圖1A。為了探索Erk1/2對(duì)FGF21生物學(xué)效應(yīng)的影響，小鼠在給予AAV-FGF21處理的同時(shí)，以腹腔注射的方式給予U0126(10 mg·kg-1·d-1)處理。體重監(jiān)測(cè)結(jié)果表明，給予U0126處理后，AAV-FGF21抑制體重增加的效應(yīng)在一定程度上被削弱(P<0.05)，見圖1B。此外，AAV-FGF21顯著降低小鼠肝臟與體重的比值，而同時(shí)給予U0126處理后，小鼠肝臟與體重的比值無明顯變化，見圖1C。這些結(jié)果說明，Erk1/2失活在一定程度上影響FGF21降低體重的生物學(xué)效應(yīng)。

2 Erk1/2失活對(duì)AAV-FGF21調(diào)節(jié)小鼠血脂代謝的影響

AAV-FGF21處理不僅顯著上調(diào)肝臟FGF21的mRNA 表達(dá)水平，而且增加血清FGF21的水平(P<0.05)，但與U0126處理與否無關(guān)，見圖2A、B。

在血脂方面，與對(duì)照組相比，AAV-FGF21處理后，小鼠血清TG和TC水平明顯降低(P<0.05);在U0126處理后，小鼠血清TG和TC水平并無明顯的變化，此外，同時(shí)給予U0126和AAV-FGF21處理后，血清TG和TC水平出現(xiàn)下降的趨勢(shì)，但幅度明顯減小，見圖2C、D。這些結(jié)果表明，Erk1/2 部分介導(dǎo)了FGF21調(diào)節(jié)血脂代謝過程。

3 Erk1/2失活對(duì)AAV-FGF21調(diào)節(jié)小鼠肝臟脂質(zhì)代謝的影響

組織形態(tài)學(xué)HE染色結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，AAV-FGF21處理4周后，肝臟組織的空泡數(shù)量明顯減少；在單純U0126處理組以及同時(shí)U0126和AAV-FGF21處理組中，小鼠肝臟組織的空泡數(shù)量則無明顯變化，見圖3A。

Figure 1.Body weight and liver weight of mice treated with AAV-FGF21 and/or U0126. A: the growth curve of body weight in mice; B: body weight at the end-point; C: the ratio of body weight to liver weight. Mean±SD.n=6.#P<0.05vscontrol group;*P<0.05vsAAV-FGF21 group.

圖1 AAV-FGF21和U0126處理后HFD喂養(yǎng)小鼠體重和肝重的變化情況

Figure 2.Serum triglyceride (TG) and total cholesterol (TC) levels in the mice treated with AAV-FGF21 and/or U0126. A and B: the circulating FGF21 levels and the mRNA levels of hepatic FGF21 in the mice treated with AAV-FGF21 and/or U0126; C: serum TG levels; D: serum TC levels. Mean±SD.n=6.#P<0.05vscontrol group;*P<0.05vsAAV-FGF21 group.

圖2 AAV-FGF21處理小鼠后血脂水平的變化

與組織形態(tài)學(xué)分析結(jié)果一致，肝臟組織脂質(zhì)含量分析結(jié)果也表明，與對(duì)照組相比，AAV-FGF21處理后，肝臟組織TG(liver TG,L-TG)、TC(liver TC,L-TC)和游離脂肪酸(liver free fatty acid,L-FFA)的含量明顯下調(diào)(P<0.05)；而單純U0126處理組以及U0126+AAV-FGF21處理組中L-TG、L-TC和L-FFA含量與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見圖3B～D。

Figure 3.Blockage of Erk1/2 attenuated the effect of AAV-FGF21 on hepatic lipid deposition in the mice. A: representative images of the morphological changes of hepatic tissues evaluated by HE staining (×100); B: liver triglyceride (L-TG) levels; C: liver total cholesterol (L-TC) levels; D: liver free fatty acid (L-FFA) levels. Mean±SD.n=6.#P<0.05vscontrol group;*P<0.05vsAAV-FGF21 group.

圖3 Erk1/2失活對(duì)AAV-FGF21降低小鼠肝臟脂質(zhì)堆積的影響

上述結(jié)果表明，AAV-FGF21處理能顯著降低高脂飲食引發(fā)的肝臟脂質(zhì)堆積，而Erk1/2在此過程中扮演著重要的角色。

4 Erk1/2失活對(duì)AAV-FGF21調(diào)節(jié)小鼠肝臟膽固醇代謝及轉(zhuǎn)化相關(guān)基因表達(dá)的影響

AAV-FGF21處理4周后，小鼠肝臟脂肪酸合成基因乙酰輔酶A羧化酶α(acetyl coenzyme A carbo-xylase alpha，Acaca)的mRNA表達(dá)無明顯的變化，見圖4A。而小鼠肝臟脂肪酸β氧化相關(guān)的乙酰輔酶A羧化酶β(acetyl coenzyme A carboxylase beta，Acacb)的表達(dá)水平則顯著上調(diào)(P<0.05);給予U0126處理后，Acaca的表達(dá)無明顯變化，而Acacb的上調(diào)幅度明顯被抑制(P<0.05)，見圖4B。這些結(jié)果表明AAV-FGF21處理后可能有助于促進(jìn)小鼠肝臟脂質(zhì)氧化代謝，加速脂質(zhì)利用。

在肝臟脂脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控方面，AAV-FGF21處理4周后，肝臟組織中膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控因子腺苷三磷酸結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體G亞家族成員5(ATP-binding cassette transporter subfamily G member 5， ABCG5)和ABCG8的mRNA表達(dá)水平明顯上調(diào)(P<0.05)；而給予U0126處理后，這種趨勢(shì)在一定程度上被抑制(P<0.05)，見圖4C、D。此外，在膽固醇合成和分解代謝方面，給予AAV-FGF21處理后，膽固醇合成主要調(diào)控基因Srebp-2的mRNA表達(dá)水平均明顯下調(diào)，而膽汁酸合成調(diào)節(jié)基因膽固醇7α-羥化酶(cholesterol 7 alpha-hydroxylase，Cyp7a1)的mRNA表達(dá)水平則顯著上升(P<0.05);在給予U0126共同處理后，肝臟Srebp-2和Cyp7a1的表達(dá)水平在一定程度上被顯著抑制(P<0.05)，見圖4E、F。

上述結(jié)果表明，AAV-FGF21處理能顯著加速肝臟脂質(zhì)氧化、分解和轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因的表達(dá)，從而降低肝臟脂質(zhì)堆積狀況；而Erk1/2可能直接或間接參與了這一調(diào)控過程。

5 Erk1/2失活對(duì)AAV-FGF21調(diào)節(jié)HFD引發(fā)小鼠肝臟炎癥的影響

AAV-FGF21處理4周后，肝臟組織中的炎癥因子IL-1β、TNF-α和MCP-1的mRNA表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，而給予U0126處理后，這種下調(diào)的趨勢(shì)在一定程度上被抑制，見圖5。這些結(jié)果表明，AAV-FGF21處理能抑制肝臟組織炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)，而Erk1/2參與了這一調(diào)節(jié)過程。

6 Erk1/2 激酶失活對(duì) FGF21 抗小鼠脂肪肝病變的分子作用機(jī)制

與動(dòng)物結(jié)果一致，重組FGF21蛋白呈現(xiàn)劑量和時(shí)間依賴性的抑制原代培養(yǎng)肝細(xì)胞Srebp-2的mRNA和蛋白的表達(dá)，見圖6A、B。相似的，給予單一劑量(50 μg/L)重組FGF21蛋白進(jìn)行處理，原代培養(yǎng)小鼠肝細(xì)胞Srebp-2的mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯被抑制(P<0.05)；而同時(shí)給予U0126和重組FGF21蛋白處理后，原代培養(yǎng)的小鼠肝細(xì)胞中Srebp-2的mRNA水平的下調(diào)趨勢(shì)明顯被抑制，見圖6C、D。這些結(jié)果提示，Erk1/2信號(hào)在一定程度上介導(dǎo)了FGF21調(diào)節(jié)肝細(xì)胞Srebp-2基因表達(dá)的生物學(xué)效應(yīng)。

Figure 4.Inhibition of Erk1/2 attenuated the effect of FGF21 on the expression of hepatic lipid metabolic genes in the mice. A: Acaca; B: Acacb; C: ABCG5; D: ABCG8; E: Srebp-2; F: Cyp7a1. Mean±SD.n=6.#P<0.05vscontrol group;*P<0.05vsAAV-FGF21 group.

圖4 Erk1/2失活對(duì)AAV-FGF21降低小鼠肝臟脂質(zhì)代謝調(diào)控基因表達(dá)的影響

Figure 5.Inactivation of Erk1/2 blocked the anti-inflammatory effect of FGF21 in the liver tissues of the mice. The mRNA expression levels of TNF-α (A), MCP-1 (B) and IL-1β (C) were showed. Mean±SD.n=6.#P<0.05vscontrol group;*P<0.05vsAAV-FGF21 group.

圖5 Erk1/2失活對(duì)FGF21抑制小鼠肝臟炎癥因子表達(dá)的影響

討 論

FGF21是一個(gè)約210個(gè)氨基酸序列組成的，主要由肝臟細(xì)胞表達(dá)的分泌蛋白[8-10]。不同于傳統(tǒng)的其它FGF家族成員，其主要以內(nèi)分泌荷爾蒙因子的角色參與機(jī)體的物質(zhì)代謝調(diào)控作用[8]。目前研究認(rèn)為，F(xiàn)GF21是一個(gè)重要的調(diào)節(jié)糖脂代謝的激素，并在治療肥胖及糖尿病相關(guān)疾病中有著廣泛的潛力[11]。在禁食狀態(tài)、高脂飲食或低碳水化合物生酮飲食條件下，肝臟中，F(xiàn)GF21在調(diào)節(jié)小鼠肝臟的脂肪酸氧化中起重要作用，可減少脂毒性飲食小鼠肝臟的脂質(zhì)沉積，使其肝功能正?；瑴p少肝臟纖維化和炎癥[11-13]。目前，已有臨床試驗(yàn)顯示聚乙二醇-FGF21可持續(xù)改善非酒精性脂肪性肝炎的肝臟脂肪變、肝臟損傷和纖維化。

絲裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)家族是細(xì)胞內(nèi)的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，主要包括生長(zhǎng)因子引發(fā)的Erk1/2以及壓力應(yīng)激引發(fā)的p38 MAPK和c-Jun氨基末端激酶(c-Jun NH2-terminal kinase，JNK)JNK等家族成員，調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖、存活和炎癥[14]。在諸如肥胖癥，2型糖尿病和非酒精性脂肪肝病的病理生理?xiàng)l件下，MAPKs參與調(diào)控肝臟的脂質(zhì)和葡萄糖代謝[15]。有研究顯示，HepG2細(xì)胞暴露于Erk1/2途徑抑制劑誘導(dǎo)單不飽和脂肪酸和脂肪酸去飽和指數(shù)的增加和多不飽和脂肪酸含量的降低，HepG2細(xì)胞的細(xì)胞脂肪酸組成似乎受到Erk1/2通路的差異調(diào)節(jié)[16]。Erk1/2的激活可通過刺激自噬和自噬相關(guān)蛋白7(auto-phagy-related protein 7，ATG7)依賴性自噬改善瘦素受體缺陷(db/db)小鼠的肝脂肪變性[17]。抑制Erk1/2的活化可上調(diào)二脂?；视椭；D(zhuǎn)移酶2(diglyceride acyltransferase 2，DGAT2)，從而參與酒精性脂肪肝的發(fā)生發(fā)展[18]。由此可見，Erk1/2參與調(diào)控肝臟脂質(zhì)代謝。前面已述，F(xiàn)GF21可通過Erk1/2通路發(fā)揮其生理作用。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，重組人FGF21蛋白處理后顯著上調(diào)Erk1/2活性[19]。那么，F(xiàn)GF21是否可通過調(diào)控Erk1/2，進(jìn)而激活下游相關(guān)靶基因的活性，最終發(fā)揮其調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)代謝的作用，這有待于進(jìn)一步探索。

Figure 6.Inhibition of Erk1/2 blocked the FGF21-induced decrease in Srebp-2 expression in the primarily cultured hepatocytes. A and C: the protein expression of Srebp-2 was determined by Western blot; B and D: the mRNA expression levels were tested by real-time quantitative PCR. Mean±SD.n=5.#P<0.05vscontrol group;*P<0.05vsFGF21 group.

圖6 Erk1/2介導(dǎo)FGF21抑制肝細(xì)胞Srebp-2的表達(dá)

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，AAV-FGF21處理能顯著降低小鼠肝臟脂質(zhì)堆積，抑制膽固醇合成調(diào)控基因表達(dá)，增加脂肪酸氧化、膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)、分解代謝、膽汁酸合成等相關(guān)基因的表達(dá)；然而，在Erk1/2失活后，這些效應(yīng)均在一定程度上被抑制或降低。這些結(jié)果表明，Erk1/2在FGF21調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)代謝過程中扮演著重要的角色。此外，我們的體外研究也進(jìn)一步證實(shí)，重組FGF21能劑量和時(shí)間依賴地抑制膽固醇生成的主要調(diào)控基因Srebp-2的表達(dá)；然而，給予U0126抑制Erk1/2活性后，這些效應(yīng)被顯著抑制。這些結(jié)果表明，Erk1/2介導(dǎo)了FGF21調(diào)節(jié)Srebp-2的表達(dá)生物效應(yīng)。

綜上所述， FGF21具有改善機(jī)體肝臟脂質(zhì)代謝的生物功能，Erk1/2部分介導(dǎo)了FGF21調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)代謝的生物學(xué)效應(yīng)。