劉輝　周羅娜　賀圣凌　王梅?羅林麗

[摘要]多酚氧化酶（PPO）是導(dǎo)致甘薯褐變的關(guān)鍵酶。以4個苦蕎品種（黔苦2015、黔苦2號、黔農(nóng)7014、西農(nóng)9940）為材料，進行室內(nèi)發(fā)芽培養(yǎng)獲得幼苗，收集莖葉，并磷酸鹽緩沖液為提取液獲得4種苦蕎莖葉提取物，研究其對甘薯塊莖PPO的抑制效果。結(jié)果表明，黔農(nóng)7014苦蕎品種的莖葉磷酸鹽提取物的抑制效果最佳，抑制類型為非競爭性可逆過程，抑制常數(shù)（KI =KIS）為33.53 μL。研究結(jié)果可為探尋甘薯PPO的天然抑制劑奠定關(guān)鍵基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞]苦蕎;莖葉;多酚氧化酶;黑美人馬鈴薯;抑制劑

[中圖分類號]TS215[文獻標(biāo)識碼]A

甘薯富含淀粉、糖類、蛋白質(zhì)、維生素、纖維素以及各種氨基酸，同時含有豐富的黏液蛋白，是非常好的營養(yǎng)和保健食品，被譽為“抗癌之王”。然而，甘薯塊莖中的多酚氧化酶，可與多酚類物質(zhì)酶反應(yīng)形成褐變物質(zhì)，嚴(yán)重影響甘薯產(chǎn)品色澤、品質(zhì)，影響甘薯的市場競爭力。研究發(fā)現(xiàn)植物來源的天然提取物對PPO酶促褐變具有顯著的抑制效果，加之天然提取物具有無毒無害的特性，使之成為當(dāng)前褐變抑制劑開發(fā)的熱點。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

甘薯和苦蕎由貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所提供。試劑均為國產(chǎn)分析純。所需儀器包括高速冷凍離心機、低溫真空冷凍干燥器、超微粉碎機、分光光度計，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀等。

1.2 方法

1.2.1 甘薯PPO的提取與純化。甘薯PPO的提取與純化參考彭益強等的方法。

1.2.2 苦蕎莖葉的提取方式。參考劉輝等的方法獲得苦蕎莖葉提取物。

1.2.3 PPO動力學(xué)研究方法。參照林敏等的方法進行PPO動力學(xué)研究。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同苦蕎品種對甘薯PPO酶活力的影響

4種苦蕎莖葉提取物均可顯著抑制甘薯PPO酶活力，酶活力隨提取物濃度的增大而顯著降低（見圖1）。提取物用量在120 μL以內(nèi)，酶活力急劇降低，均超過50%的抑制能力。提取物用量的加大，甘薯PPO酶活力的降低趨勢漸緩，表明苦蕎莖葉提取物對甘薯PPO的抑制類型為可逆性抑制過程。黔苦2015、黔苦2號、黔農(nóng)7014、西農(nóng)9940導(dǎo)致酶活力下降一半所需的抑制劑量（IC50）分別為53.19μL、56.22μL、27.48μL、61.04μL，可見，黔農(nóng)7014磷酸鹽提取物的抑制作用最強。

2.2 黔農(nóng)7014苦蕎莖葉提取物對甘薯PPO抑制類型判斷

在甘薯PPO測活體系中，固定底物濃度為0.5mmol/L，分別加入不同體積的苦蕎莖葉磷酸鹽提取物（30、60、120、240、480μL），加入不同的酶量（10、20、30、40、50μg/L），測定酶催化鄰苯二酚氧化的活力。從圖2可知，增加提取物用量，直線的斜率降低，表明黔農(nóng)7014苦蕎莖葉提取物對甘薯PPO的抑制作用，屬于可逆過程。因此，苦蕎莖葉提取物通過抑制酶活力而導(dǎo)致催化效率的降低，而不是通過降低有效的酶量抑制酶活力。

以Lineweaver-Burk 雙倒數(shù)作圖，得到一組橫軸截距不變的直線（圖3），黔苦7014莖葉提取物作為PPO 抑制劑，不影響米氏常數(shù)，只使最大反應(yīng)速度減小，其抑制類型為非競爭性，抑制劑不改變酶對底物的親和力。以不同濃度抑制劑下測定的直線在縱軸的截距（1/Vm） 對抑制劑濃度作圖為一條直線（圖3內(nèi)插圖），從直線的斜率可以求得抑制常數(shù)?？嗍w莖葉磷酸鹽提取物對甘薯PPO 的抑制常數(shù)（KI =KIS）為33.53μL。

3 結(jié)論

黔農(nóng)7014苦蕎莖葉磷酸鹽提取物對甘薯PPO抑制效果最好，抑制機理非競爭性為可逆反應(yīng)，抑制常數(shù)為33.53 μL。

[參考文獻]

[1] 彭益強，劉鵬，鄧峰，等.源于馬鈴薯的多酚氧化酶活性中心必需基團組成與抑制機理[J].化工進展，2012（02）：406-411.

[2] 劉輝，盧揚，劉嘉，等.苦蕎莖葉提取物對“紅寶石”馬鈴薯多酚氧化酶抑制效果研究[J].保鮮與加工，2017（5）：1-6.

[3] 林敏，邱凌，鐘雪，等.柿葉提取物對馬鈴薯多酚氧化酶的抑制作用[J].廣西農(nóng)業(yè)生物科學(xué)，2008，27（4）：412-416.