江穎穎 鄭 杰 伊 鳴,4,△

（1首都醫(yī)科大學(xué) 北京市神經(jīng)外科研究所，北京100070；2北京大學(xué)神經(jīng)科學(xué)研究所；3北京大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物學(xué)系；4 教育部／國家衛(wèi)生健康委員會神經(jīng)科學(xué)重點實驗室，北京100191）

根據(jù)最新的疼痛定義，疼痛是由實際或潛在的組織損傷所引起的感覺和經(jīng)歷，包括感覺、情緒、認(rèn)知及社會成分[1]。根據(jù)這一定義可知疼痛與認(rèn)知是緊密相關(guān)的。疼痛會導(dǎo)致認(rèn)知受損，而增加非疼痛相關(guān)的認(rèn)知活動會減輕疼痛[2]。目前臨床上提出了一些非藥物治療慢性痛的策略，如認(rèn)知行為療法、音樂療法等，這些療法大多數(shù)是非創(chuàng)傷性的，成本和風(fēng)險低[3]。目前臨床上有超過69%的慢性痛病人接受過非藥物治療，對改善患者生活質(zhì)量有較好效果[4]。因此研究疼痛與認(rèn)知的關(guān)系對研究疼痛機制及治療措施具有很重要的臨床意義。

為了識別外部環(huán)境的細微變化，大腦必須區(qū)分類似的神經(jīng)元活動模式，而這是通過“模式分離(pattern separation)”來實現(xiàn)的。模式分離是指將神經(jīng)回路類似的輸入活動模式轉(zhuǎn)換成更明顯的輸出模式。模式分離在空間記憶活動中起著非常重要的作用[5]。已有行為學(xué)證據(jù)表明，海馬齒狀回被認(rèn)為是“模式分離器(pattern separator)”[6,7]，在模式分離中扮演非常重要的角色。

此外，已有研究表明SNI 神經(jīng)病理性疼痛會導(dǎo)致海馬雙側(cè)齒狀回(dentate gyrus, DG)的新生神經(jīng)元數(shù)目明顯減少[8]。因此我們推測SNI 神經(jīng)病理性疼痛會導(dǎo)致大鼠模式分離障礙，而這種障礙與海馬齒狀回密切相關(guān)。

另一方面，病毒逆行示蹤實驗表明，海馬齒狀回內(nèi)新生神經(jīng)元不僅接受來自海馬內(nèi)部神經(jīng)元（中間神經(jīng)元，苔蘚細胞以及成熟顆粒細胞）投射，而且接受內(nèi)側(cè)隔核膽堿能神經(jīng)元投射[9]，并且齒狀回內(nèi)神經(jīng)元新生受到內(nèi)側(cè)隔核內(nèi)的膽堿能神經(jīng)元調(diào)節(jié)。此外，已有文獻表明，當(dāng)用192 IgG-saporin (SAP)損毀內(nèi)側(cè)隔核膽堿能神經(jīng)元后，齒狀回內(nèi)的新生神經(jīng)元數(shù)目明顯減少[10]。因此我們提出假設(shè)，SNI 神經(jīng)病理性疼痛導(dǎo)致的空間認(rèn)知能力障礙與內(nèi)側(cè)隔核內(nèi)的膽堿能神經(jīng)元密切相關(guān)。

本研究旨在解決SNI 神經(jīng)病理性疼痛導(dǎo)致的模式識別障礙與內(nèi)側(cè)隔核中膽堿能神經(jīng)元的關(guān)系，研究內(nèi)側(cè)隔核內(nèi)的膽堿能神經(jīng)元是為了進一步探討模式識別的調(diào)控機制，為臨床治療治療疼痛提供新的靶點。

方 法

1.實驗動物

成年雄性Sprague-Dawley (SD)大鼠，體重為200 ～240 g，由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物科學(xué)部提供。12 h 晝夜節(jié)律交替，其中8:00 ～20:00 為黑暗環(huán)境。每籠2 ～4 只大鼠，除了限制飲食時間段外，其余時間大鼠自由飲食、飲水。所有的實驗程序都遵循國際疼痛學(xué)會的研究和倫理問題的指導(dǎo)方針[11]，經(jīng)北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部動物保護與使用委員會批準(zhǔn)。在進行實驗前，大鼠由實驗操作者多次撫摸(handling)。所有的行為學(xué)實驗均為雙盲。

2.實驗方法

（1）部分神經(jīng)損傷模型(spared nerve injury,SNI)的建立：用1%戊巴比妥鈉（瑞爾欣德科技有限公司，中國北京）麻醉大鼠，對其左后腿進行備皮消毒，沿垂直于左后腿方向剪開皮膚，之后用鑷子鈍性分離肌肉組織，找到坐骨神經(jīng)三根分支，結(jié)扎剪斷其中較粗的脛神經(jīng)和腓總神經(jīng)，保留細長的腓腸神經(jīng)，并且在結(jié)扎線遠心端剪去約2 mm 的神經(jīng)，以防止剪斷的神經(jīng)重新愈合。之后縫合肌肉及皮膚，用碘酒和酒精消毒傷口以防感染。對照組(sham SNI)組大鼠，除了不剪斷神經(jīng)外，其余操作同SNI[12]。

（2）機械縮足閾值測定：大鼠SNI 神經(jīng)病理性疼痛的測定如參考文獻[13]所述，簡單來說，在測試前三天，將大鼠放入測試板適應(yīng)。正式進行測試時，待大鼠處于安靜狀態(tài)，用不同克數(shù)的von Frey hair（0.41、0.70、1.20、2.00、3.63、5.50、8.50 和15.10 g）(Stoelting, Wood Dale, IL, 美國)刺激大鼠左后足底外側(cè)皮毛交界處。將纖維絲彎曲成S 行，觀察大鼠是否出現(xiàn)包括抬足、舔足、甩足等縮足反應(yīng)。本研究采用的是“up and down”方法進行，具體過程參見文獻[13]。

（3）八臂迷宮實驗：在為期一周的實驗中，所有實驗大鼠均限制飲食，自由飲水。將大鼠體重保持在實驗開始前體重的80%～90%，此舉是為了保證大鼠對八臂迷宮中的食物有探索欲望。大鼠全程自由飲水。在實驗開始前，將大鼠放入迷宮中適應(yīng)半個小時，八臂迷宮所有臂的入口處的門均打開，并且在每個臂的末端都放奶酪小球。八臂迷宮周圍用布簾圍起來，并且布簾上放不同形狀的圖案，作為大鼠識別方向的標(biāo)識。

大鼠進行為期7 天、每天隨機四次的測試。每次測試分為兩步，首先只開放一個固定的臂（見圖1A，B），然后將大鼠放入起始臂，待大鼠進入固定臂，并吃掉奶酪球后，將大鼠取出，用75%醫(yī)用酒精消毒迷宮，排除氣味干擾。這次測試的時間上限為2 min，如果大鼠在2 min 內(nèi)未進入固定臂，則將大鼠指引進入固定臂，并吃掉奶酪球。第二步為隨機開放另一個臂，并在末端放奶酪球，此時迷宮除了起始臂和固定臂（此時未放奶酪球）開放外，多了一個隨機開放的臂，將大鼠再次放入起始臂，記錄大鼠第一次選擇進入的臂。如果選擇隨機開放的臂則為正確，若進入固定臂或者回到起始臂均為錯誤。如果選擇錯誤，則允許大鼠在迷宮中自由探索2 min。根據(jù)隨機臂開放的方向，將模式分離(pattern separation)分為S1、S2、S3、S4 四種模式（見圖1A）。統(tǒng)計兩組大鼠每天的正確率，正確率為正確次數(shù)/總次數(shù)[14,15]。

（4）內(nèi)側(cè)隔核膽堿能神經(jīng)元損毀：首先使用1%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，注射劑量為0.55 ml/100 g。將大鼠頭部備皮消毒，沿正中線剪開皮膚，暴露顱骨，以前囟為原點，前囟前(anterior-posterior, AP) 0.6 mm，向左旁開(medial-lateral, ML) 0 mm，用顱鉆鉆開顱骨直至硬腦膜出現(xiàn)，然后輕挑硬腦膜，暴露腦表面，此過程防止出血及碰觸腦組織。將裝有0.5 μl 濃度為 0.35 μg/μl 的 192 IgG-saporin (SAP)（Advanced Targeting Systems, 美國）或者生理鹽水的微量注射器以上述坐標(biāo)進入腦組織[16]，向下深度為6.8 mm。然后以0.1 μl/min 速度，持續(xù)5 min 微量注射藥物，待藥物注射完后，留針5 min，防止藥物隨針道擴散。最后縫合皮膚，全程無菌操作[17]。

（5）免疫組織化學(xué)：用1%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，待大鼠深度麻醉后，剪開腹部組織，暴露心臟，將針頭經(jīng)心室心房進入主動脈，剪開心耳。首先灌注約400 ml 生理鹽水，以最大速度沖干凈動脈內(nèi)的血液。之后換上300 ml 左右4%多聚甲醛(paraformaldehyde, PFA) 固定組織。前 1/3 的 PFA快速進入動物體內(nèi)，后2/3 的PFA 降慢速度，以便PFA 滲透進入腦組織。灌流完畢，取腦組織并放入PFA 中于4 ℃冰箱中后固定12 h。之后依次換上20%、30%蔗糖溶液對腦組織進行脫水。脫水過后用包埋劑（Leica，德國）將腦組織包埋，并放入-80℃冰箱中迅速冷凍組織。之后在冰凍切片機進行冠狀面切片，厚度為30 μm，將內(nèi)側(cè)隔核腦片保存在防凍液中。

將腦片放入磷酸鹽緩沖液(phosphate-buffered saline, PBS)中漂洗3 × 5 min 后，放入3%雙氧水中，室溫孵育1 h 以滅活腦組織本身的過氧化物酶，此過程注意避光。然后用PBS 漂洗3×5 min，將腦片放入10%羊血清中，室溫封閉打孔1 h。用膽堿能神經(jīng)元標(biāo)志物：乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶(choline acetyltransferase, ChAT) 抗體在4℃冰箱孵育腦片24～36 h，ChAT抗體（AB18736，Abcam，英國）的濃度為1:200。之后用PBS 漂洗3×5 min，之后孵育二抗（中杉金橋二步法免疫組化檢測液），室溫孵育1 ～1.5 h；PBS 漂洗3×5 min 后，用3-二氨基聯(lián)苯胺(diaminobezidin, DAB)染色液（A 液:B 液=1:20）（北京中杉金橋公司）室溫孵育腦片約5 min，根據(jù)腦片著色深淺做出適當(dāng)調(diào)整，然后裱片，將貼有腦片的載玻片放于37 ℃烤箱中烤2 ～3 d，之后進行梯度酒精脫水，封片，放于顯微鏡（Leica 倒置熒光顯微鏡，DMI 4000B）明場模式下觀察或拍照[18,19]。用image J 軟件計數(shù)兩組大鼠內(nèi)側(cè)隔核內(nèi)的膽堿能神經(jīng)元數(shù)目，即ChAT 陽性神經(jīng)元數(shù)目，然后進行統(tǒng)計分析。

3.實驗動物分組與統(tǒng)計學(xué)分析

實驗大鼠分為四組：sham SNI、SNI、假損毀、SAP 損毀，每組7 ～8 只。為保證實驗準(zhǔn)確性，數(shù)據(jù)分析者不清楚實驗分組，使用GraphPad Prism 5.0軟件并采用雙因素方差分析(two-way ANOVA)和非配對t檢驗(un-pairedttest)進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(±SEM)表示，P＜0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1.SNI 神經(jīng)病理性疼痛大鼠模式分離能力降低

根據(jù)已有文獻，SNI 導(dǎo)致的神經(jīng)病理性疼痛在術(shù)后24 h 開始出現(xiàn)，并持續(xù)至少6 個月。本實驗中，在SNI 造模7 d 后進行模式分離實驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn)SNI 組大鼠在四種模式中的正確率均比對照組低（S1: group effect:F(1,6)= 9.26,P＜0.05, time effect:F(6,6)= 2.99,P＞ 0.05, 見圖 1C; S2: group effect:F(1,6)=280,P＜0.001, time effect :F(6,6)= 25.50,P＜0.001,見 圖 1D; S3: group effect:F(1,6)= 33.60,P＜0.01; time effect:F(6,6)= 0.56,P＞ 0.05, 見圖 1E; S4: group effect:F(1,6)= 30.50,P＜0.01, time effect:F(6,6)= 0.12,P＞ 0.05, 見圖1F; two-way ANOVA with Bonferroni' s post-test）。

此外本研究綜合分析了大鼠在低分辨模式(S2)和高分辨(S3、S4)模式中的正確率，發(fā)現(xiàn)不管是在低分辨模式(S2)中，還是在高分辨模式(S3、S4)中，SNI 組大鼠的正確率明顯比對照組低（見圖2A: group effect:F(1,24)= 60.60,P＜0.001; interaction:F(1,24)= 0.01,P＞ 0.05. 見圖 2B: group effect:F(1,24)= 56.99,P＜0.001;interaction:F(1,24)= 0.37,P＞ 0.05, ANOVA with Bonferroni's post-test）。

2.SNI 神經(jīng)病理性疼痛導(dǎo)致內(nèi)側(cè)隔核膽堿能神經(jīng)元數(shù)目減少

圖1 SNI神經(jīng)病理性疼痛導(dǎo)致大鼠模式分離能力降低(±SEM)Fig.1 Decreased pattern separation in neuropathic pain rats with SNI(±SEM)

圖2 SNI 和sham SNI 組大鼠在低分辨模式(S2)和高分辨模式(S3、S4)中的正確率(±SEM)Fig.2 Percent of correct choice in neuropathic pain rats in low discrimination (S2) and high discrimination (S3, S4) model in SNI and sham SNI groups (±SEM)

由于海馬齒狀回在模式識別中扮演非常重要的角色[6,7]，而海馬齒狀回接受來自內(nèi)側(cè)隔核膽堿能神經(jīng)元投射和調(diào)控[9]，因此推測內(nèi)側(cè)隔核膽堿能神經(jīng)元參與SNI 導(dǎo)致的模式識別，接下來檢測了SNI 或sham 術(shù)后28 d，內(nèi)側(cè)隔核膽堿能神經(jīng)元數(shù)目的變化（見圖3）。首先對比了SNI 和sham組大鼠的機械痛閾值，SNI 組大鼠機械痛閾值明顯低 于 sham 組（time effect:F(5,80)=36.56,P＜0.001;group effect:F(1,80)= 1375,P＜0.001; interaction:F(5,80)= 35.95,P＜0.001, two-way ANOVA with Bonferroni' s post-test，見圖3A），表明模型成功建立。在SNI 或sham 術(shù)后28 d 將大鼠灌流取材，對內(nèi)側(cè)隔核膽堿能神經(jīng)元進行DAB 染色，對比兩組大鼠內(nèi)側(cè)隔核內(nèi)的膽堿能神經(jīng)元數(shù)目（見圖3C，D），結(jié)果發(fā)現(xiàn)SNI 導(dǎo)致內(nèi)側(cè)隔核內(nèi)的膽堿能神經(jīng)元數(shù)目明顯減少（t= 4.43,P＜ 0.001, unpaired t test，見圖3B）。這一結(jié)果表明，內(nèi)側(cè)隔核膽堿能神經(jīng)元參與SNI 慢性神經(jīng)病理性疼痛。

3.內(nèi)側(cè)隔核膽堿能神經(jīng)元損毀明顯降低大鼠空間認(rèn)知能力

為了證明內(nèi)側(cè)隔核膽堿能神經(jīng)元是否參與模式識別，首先，使用SAP 特異損毀大鼠內(nèi)側(cè)隔核膽堿能神經(jīng)元，然后采用模式分離中的S4 模式檢測損毀組與對照組的正確率。因為SNI 會導(dǎo)致模式識別(PS)受損，如果在損毀MS 膽堿能神經(jīng)元后進行SNI 手術(shù)再檢測PS，最后出現(xiàn)的PS 受損沒辦法分清是MS 膽堿能神經(jīng)元受損還是SNI 導(dǎo)致的。所以我們選擇MS 膽堿能神經(jīng)元損毀后在正常大鼠中進行PS 實驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，損毀組大鼠在S4 中的正確率明顯低于對照組（time effect:F(6,72)= 20.20,P＜0.001; group effect:F(1,72)= 7.80,P＜0.05; interaction:F(6,72)= 0.51,P＞ 0.05, two-way ANOVA with Bonferroni' s post-test，見圖4A）。實驗結(jié)束后，將大鼠灌流取材，使用DAB 染色檢測內(nèi)側(cè)隔核內(nèi)的膽堿能神經(jīng)元，以此確定損毀是否成功。結(jié)果發(fā)現(xiàn)損毀組大鼠內(nèi)側(cè)隔核內(nèi)膽堿能神經(jīng)元數(shù)目明顯少于對照組（見圖4B，C），說明損毀成功。這些結(jié)果說明內(nèi)側(cè)隔核膽堿能神經(jīng)元參與了模式分離。

圖3 SNI神經(jīng)病理性疼痛導(dǎo)致內(nèi)側(cè)隔核膽堿能神經(jīng)元數(shù)目減少(±SEM)Fig.3 SNI-induced neuropathic pain reduced the number of cholinergic neurons in medial septum (±SEM)

討 論

在處理記憶信息時，海馬中有若干種不同的計算過程，其中一種是模式分離，海馬會用不同的神經(jīng)活動編碼相似的信息，讓相似的信息變得更加不同，并且在不干擾其他記憶表現(xiàn)的情況下準(zhǔn)確形成新的空間記憶[20]。海馬齒狀回(dentate gyrus, DG)的神經(jīng)元新生對模式分離非常關(guān)鍵[21]。已有研究表明在成年大鼠中存在神經(jīng)元新生的只有兩個腦區(qū)：DG 和室管膜下區(qū)(subventricular zone)[22]。關(guān)于DG最重要的理論是其參與模式分離。減少DG 內(nèi)的神經(jīng)元新生會損害動物在模式分離中的表現(xiàn)，而增加DG 神經(jīng)元新生明顯提高模式分離的正確率[5～7]。

疼痛包含感覺、情緒、認(rèn)知和社會成分。神經(jīng)病理性疼痛會導(dǎo)致大腦很多結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，包括丘腦、杏仁核、前扣帶回皮質(zhì)、島葉、前額葉皮質(zhì)海馬等結(jié)構(gòu)[23]。目前已有研究表明慢性神經(jīng)病理性疼痛會導(dǎo)致海馬功能異常，包括海馬體積減小、長時程增強缺失、DG 神經(jīng)元新生降低、細胞凋亡增加等[8]。因此認(rèn)為SNI 神經(jīng)病理性疼痛會導(dǎo)致模式分離障礙。我們的結(jié)果證實了這一點：在四種模式分離中神經(jīng)病理性疼痛大鼠正確率均明顯低于對照組大鼠。

DG 新生神經(jīng)元除了接受來自海馬內(nèi)神經(jīng)元的投射（中間神經(jīng)元、苔蘚細胞、CA3 以及成熟顆粒細胞）外，還接受來自內(nèi)側(cè)隔核(medial septum,MS)的膽堿能神經(jīng)元投射[9]。并且有研究表明用192 IgG-saporin 特異損毀MS 內(nèi)的膽堿能神經(jīng)元會明顯減少DG 神經(jīng)元新生[10]。因此我們推測SNI 神經(jīng)病理性疼痛導(dǎo)致模式分離障礙與MS 內(nèi)的膽堿能神經(jīng)元有關(guān)。我們的結(jié)果也證明了損毀MS 膽堿能神經(jīng)元明顯降低大鼠在模式分離中的正確率。

圖4 損毀內(nèi)側(cè)隔核膽堿能神經(jīng)元降低神經(jīng)病理性疼痛大鼠的模式分離能力 (±SEM)Fig.4 Cholinergic neurons lesion in medial septum decreased the pattern separation in neuropathic pain rats (±SEM)

本實驗首先證明了SNI 導(dǎo)致大鼠模式識別受損，同時表明SNI 會降低內(nèi)側(cè)隔核內(nèi)的膽堿能神經(jīng)元數(shù)目，此外損毀內(nèi)側(cè)隔核膽堿能神經(jīng)元能明顯降低大鼠模式識別。綜上所述，SNI 神經(jīng)病理性疼痛導(dǎo)致大鼠模式分離正確率明顯降低，并且這種表現(xiàn)的降低可能與內(nèi)側(cè)隔核內(nèi)的膽堿能神經(jīng)元相關(guān)。

本實驗存在一定局限性，由于影響模式分離的腦區(qū)以及神經(jīng)元類型很多，為了證實內(nèi)側(cè)隔核膽堿能神經(jīng)元與SNI 神經(jīng)病理性疼痛導(dǎo)致的模式分離障礙有關(guān)，需要進一步采用更精確的實驗方法，比如化學(xué)遺傳、光遺傳以及在體多通道記錄等手段。此外為了更加明確因果關(guān)系，可以在持續(xù)增加內(nèi)側(cè)隔核膽堿能神經(jīng)元活性的基礎(chǔ)上進行SNI 造模，看能否逆轉(zhuǎn)SNI 導(dǎo)致的模式識別正確率降低，這需要進一步證明。