胡 蕾，劉禮輝，楊圓圓，方 偉，林 強(qiáng)，付小哲，梁紅茹，劉山桂，李寧求

(1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部漁用藥物創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省水產(chǎn)動(dòng)物免疫技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510380；2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306；3.廣東省水生動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，廣州 510220)

雜交鱧(Channamaculate♀×C.argus♂)是我國(guó)重要的淡水經(jīng)濟(jì)魚類，具有生長(zhǎng)速度快、抗逆性強(qiáng)、產(chǎn)量高等雜交優(yōu)勢(shì)[1]。雖然雜交鱧抗病能力極強(qiáng)，但是在高密度養(yǎng)殖條件下，養(yǎng)殖水體水質(zhì)較差，導(dǎo)致疾病頻發(fā)，其中內(nèi)臟類結(jié)節(jié)病是近年來(lái)常見疾病之一。該病發(fā)病率高，死亡率大，已給不少養(yǎng)殖場(chǎng)造成重大損失。舒伯特氣單胞菌(Aeromanasschubertii)屬氣單胞菌科(Aeromonadaceae)氣單胞菌屬(Aeromanas)，為革蘭氏陰性桿菌，單極鞭毛，運(yùn)動(dòng)能力強(qiáng)，是引起鱧科魚類內(nèi)臟類結(jié)節(jié)病的主要病原之一。1988年在美國(guó)[2]德克薩斯州首次發(fā)現(xiàn)舒伯特氣單胞菌，其后又在歐洲[3-4]及中國(guó)[5-6]也發(fā)現(xiàn)了大量由舒伯特氣單胞菌引起的食源性疾病的病例。2009年余華等[7]從溫泉魚上分離到舒伯特氣單胞菌，2012年羅霞等[8]相繼報(bào)道了舒伯特氣單胞菌引起的鱧科魚類內(nèi)臟類結(jié)節(jié)病，對(duì)鱧科魚類具有較高的致病力和致死性。目前舒伯特氣單胞菌病的防治主要依靠化學(xué)藥物，但該方法存在藥物殘留、產(chǎn)生耐藥性等弊端，給食品安全帶來(lái)嚴(yán)重隱患。通過(guò)免疫接種預(yù)防魚類疾病的發(fā)生是最為經(jīng)濟(jì)有效的手段[8，18]，但目前未見有舒伯特氣單胞菌疫苗的報(bào)道。舒伯特氣單胞菌在體內(nèi)形成類結(jié)節(jié)，以產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答為主的滅活疫苗效果不佳，而弱毒疫苗除了引發(fā)體液免疫外，亦可產(chǎn)生強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫應(yīng)答，因此研制舒伯特氣單胞菌弱毒疫苗預(yù)防雜交鱧類結(jié)節(jié)病更具優(yōu)勢(shì)。

本研究通過(guò)篩選天然致弱的舒伯特氣單胞菌毒株作為制備弱毒疫苗候選，采用IL-8、IL-1β、補(bǔ)體3(C3)和免疫球蛋白(IgM)等免疫相關(guān)基因表達(dá)及相對(duì)免疫保護(hù)率(relative percentage survival，RPS)等指標(biāo)評(píng)價(jià)了舒伯特氣單胞菌弱毒疫苗引起的雜交鱧免疫應(yīng)答及其免疫保護(hù)效果，為開發(fā)安全、高效的鱧科魚類舒伯特氣單胞菌弱毒疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料方法

1.1 菌株與實(shí)驗(yàn)魚

舒伯特氣單胞菌株OM170701、OM170703、OC170905、OC170908、WL1483由珠江水產(chǎn)研究所魚病室從患病的雜交鱧等分離、鑒定、保存。實(shí)驗(yàn)用雜交鱧、大口黑鱸購(gòu)自廣東順德某養(yǎng)殖場(chǎng)，健康，無(wú)發(fā)病史，鏡檢無(wú)寄生蟲，體質(zhì)量20～140 g，實(shí)驗(yàn)前暫養(yǎng)于500 L藍(lán)色塑料桶中15 d，充氣，每天投喂適當(dāng)?shù)膹V東旺海飼料實(shí)業(yè)有限公司生產(chǎn)的飼料，每天換水1/2，水溫為26～28 ℃。

1.2 舒伯特氣單胞菌弱毒菌株的篩選

1.2.1 菌株的準(zhǔn)備

將保存的OM170701、OM170703、OC170905、OC170908菌種分別接種于固體BHI平板上，28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，挑取單菌落，接種于100 mL BHI液體培養(yǎng)基，28 ℃振蕩160 r/min培養(yǎng)4 h，根據(jù)文獻(xiàn)[8,18]和本實(shí)驗(yàn)前期試驗(yàn)結(jié)果，舒伯特氣單胞菌在1.0×104數(shù)量級(jí)就會(huì)造成魚體的死亡，本實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上提高3個(gè)數(shù)量級(jí)的濃度感染魚體，對(duì)4株菌株對(duì)雜交鱧的毒力進(jìn)行初篩，這個(gè)濃度可以獲得毒性相對(duì)較弱的菌株，因此選用生理鹽水調(diào)整菌液濃度為4.5×107CFU/mL用于攻毒。

1.2.2 攻毒試驗(yàn)

將50尾雜交鱧隨機(jī)分為5組，其中4組為試驗(yàn)組，每組10尾放于200 L塑料桶，分別腹腔注射濃度為4.5×107CFU/mL的OM170701、OM170703、OC170905、OC170908菌懸液，每尾0.1 mL，對(duì)照組腹腔注射等量的生理鹽水。注射后每天換水，連續(xù)觀察7 d，記錄雜交鱧的死亡情況，如有死亡，檢測(cè)死亡的雜交鱧是否是因?yàn)槭娌貧鈫伟鸬摹?/p>

1.3 舒伯特氣單胞菌弱毒株安全性評(píng)價(jià)

1.3.1 舒伯特氣單胞菌弱毒株對(duì)靶動(dòng)物雜交鱧安全性

將120尾雜交鱧隨機(jī)分成4組，每組30尾。其中3組為試驗(yàn)組，分別腹腔注射濃度為4.5×109、4.5×108、4.5×107CFU/mL OM170701菌懸液，每尾0.1 mL，對(duì)照組腹腔注射等量生理鹽水。注射后連續(xù)觀察18 d，記錄試驗(yàn)組死亡情況。

1.3.2 舒伯特氣單胞菌弱毒株對(duì)非靶動(dòng)物大口黑鱸的安全性

根據(jù)獸用生物制品研發(fā)與申報(bào)要求，需對(duì)使用動(dòng)物和非使用對(duì)象動(dòng)物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室安全試驗(yàn)。因?yàn)殡s交鱧和大口黑鱸都同在一個(gè)養(yǎng)殖區(qū)域內(nèi)，因此選大口黑鱸作為非靶動(dòng)物的驗(yàn)證，可以避免弱毒株對(duì)大口黑鱸感染的情況出現(xiàn)，也可避免以后在對(duì)雜交鱧使用該疫苗免疫時(shí)，對(duì)大口黑鱸的養(yǎng)殖帶來(lái)安全隱患。實(shí)驗(yàn)方法同1.3.1。

1.4 疫苗的制備及免疫

將保存的OM170701菌種接種于固體BHI平板上，28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，挑取單菌落，接種于100 mL BHI液體培養(yǎng)基，28 ℃過(guò)夜培養(yǎng)，用生理鹽水稀釋至4.5×107CFU/mL，用于注射免疫。將480尾雜交鱧隨機(jī)分為2組，每組240尾，設(shè)3個(gè)平行，其中免疫組注射濃度為4.5×107CFU/mL OM170701菌液，每尾0.1 mL，對(duì)照組注射等量的生理鹽水。

1.5 菌株OM170701在雜交鱧體內(nèi)的消長(zhǎng)規(guī)律

免疫后第1、2、3、4、5、6、7、14天3個(gè)免疫平行組每組隨機(jī)抽取3尾雜交鱧，取其肝、脾、腎、腸、鰓、心臟、肌肉，腦組織，稱取30 mg，按照天根細(xì)菌基因組DNA試劑盒說(shuō)明書提取DNA。采用劉禮輝等[12]建立的舒伯特氣單胞菌檢測(cè)方法，檢測(cè)菌株OM170701在體內(nèi)的組織分布及消長(zhǎng)規(guī)律。

1.6 免疫相關(guān)基因定量檢測(cè)

1.6.1 RNA的提取及cDNA的合成

免疫后第0、12、24、48、72 h以及第7、14、21、28天3個(gè)免疫平行組每組隨機(jī)抽取3尾雜交鱧，取其肝臟組織，按照天根提取動(dòng)物組織RNA試劑盒說(shuō)明書提取RNA，用TransScript & One-Step gDNA Removal and cDNASynthesis SuperMix(北京全式金)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA第一鏈。

1.6.2 定量PCR檢測(cè)

以cDNA第一鏈為模板，在ABI7500(applied biosystems)實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。反應(yīng)體系和反應(yīng)程序按照試劑盒SYBR Premix EX TapTMⅡ(Tli RNaseH plus)(寶生物工程)說(shuō)明書操作。采用2-ΔΔCt法計(jì)算樣品中IL-8、IL-1β、補(bǔ)體3(C3)、免疫球蛋白(IgM)的相對(duì)表達(dá)量，β-actin為內(nèi)參基因。引物序列見表1。

表1 qPCR所用引物及引物序列Tab.1 Primers and primer sequences used in qPCR

1.7 RPS的測(cè)定

免疫后第28天采用舒伯特氣單胞菌強(qiáng)毒株WL1483注射攻毒，注射濃度為1.5×104CFU/mL，每尾0.1 mL，連續(xù)觀察14 d，記錄魚體死亡情況，對(duì)發(fā)病和死亡個(gè)體進(jìn)行病原的分離和鑒定，并計(jì)算相對(duì)免疫保護(hù)率(relative percentage survival，RPS):

RPS=(1-免疫組死亡率/對(duì)照組死亡率)×100%。

1.8 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)均表示為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X±SD)，采用OringinPro 6.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，并采用t檢驗(yàn)進(jìn)行差異性分析，當(dāng)P<0.05時(shí)表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 舒伯特氣單胞菌弱毒菌株的篩選

舒伯特氣單胞菌攻毒后，OM170701、OM170703、OC170905和OC170908組雜交鱧的死亡率分別是0、20%、70%、100%(圖1)。其中，OC170908組雜交鱧在攻毒后第3天急劇死亡，并在第6天全部死亡，說(shuō)明OC170908對(duì)雜交鱧具有極強(qiáng)的致病力和高致死率。OM170703組和OC170905組的死亡情況在攻毒后的第6天達(dá)到穩(wěn)定，其中OC170905組的死亡率在50% 以上，說(shuō)明OC170905對(duì)雜交鱧的致病力雖然弱于OC170908，但仍具有很強(qiáng)的致病力，OM170703的致死率為20%，且在第3天才出現(xiàn)死亡，所以其致病力較弱。OM170701組雜交鱧無(wú)死亡，說(shuō)明OM170701對(duì)雜交鱧毒性較弱。

圖1 感染不同菌株的各實(shí)驗(yàn)組累計(jì)死亡曲線Fig.1 Cumulative mortality curves of different experimental groups injected with different bacterial strain

2.2 舒伯特氣單胞菌弱毒株安全性評(píng)價(jià)

分別以濃度為4.5×109、4.5×108、4.5×107CFU/mL的OM170701菌液感染靶動(dòng)物雜交鱧與非靶動(dòng)物大口黑鱸，在觀察期內(nèi)均未出現(xiàn)死亡，由此說(shuō)明此菌株對(duì)雜交鱧和大口黑鱸毒性較弱，候選菌株用作弱毒苗制備安全性較好。

2.3 舒伯特氣單胞菌弱毒株在雜交鱧體內(nèi)組織分布及消長(zhǎng)規(guī)律

舒伯特氣單胞菌弱毒株OM170701接種雜交鱧后，在腸、肝臟、肌肉、鰓、脾、腎中均能檢測(cè)到OM170701，而在腦中檢測(cè)不到。在這些組織中，OM170701量均在第2天達(dá)到最大，隨后減少。其中在肝臟中存在的時(shí)間最長(zhǎng)，直到第7天檢測(cè)不到OM170701，在鰓中的存在時(shí)間最短，第4天就檢測(cè)不到OM170701。在腸、腎中存在時(shí)間為5 d，肌肉、脾中存在時(shí)間為4 d。在腸中的量最高，為104.194個(gè)拷貝數(shù)(圖2)。

圖2 弱毒疫苗株OM170701在雜交鱧體內(nèi)組織分布及消長(zhǎng)情況Fig.2 Tissue distribution and growth of attenuated vaccine strain OM170701 in hybrid snakehead

2.4 免疫后雜交鱧細(xì)胞因子IL-8、IL-1β、補(bǔ)體C3的表達(dá)情況

舒伯特氣單胞菌弱毒株OM170701免疫組IL-8、IL-1β、補(bǔ)體C3表達(dá)量均依次升高且高于對(duì)照組表達(dá)量，在免疫后12 h與24 h升高不明顯，48 h相對(duì)表達(dá)量顯著升高，在72 h相對(duì)表達(dá)量達(dá)到最高，分別是對(duì)照組的5.57倍，3.94倍，4.95倍(圖3)。

2.5 免疫后雜交鱧免疫球蛋白IgM基因表達(dá)情況

舒伯特氣單胞菌弱毒株OM170701接種雜交鱧后，第7天至第28天IgM的相對(duì)表達(dá)量依次升高且均高于對(duì)照組的表達(dá)量，第7天至第21天免疫組相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組表達(dá)量高，到第28天免疫組IgM的表達(dá)量顯著高于對(duì)照組的表達(dá)量，是對(duì)照組的17.26倍(圖4)。

圖3 免疫后雜交鱧肝臟內(nèi)非特異性細(xì)胞因子的相對(duì)表達(dá)水平Fig.3 Relative expression level of nonspecific immune genes in liver of immunized hybrid snakehead *表示P<0.05

圖4 免疫后雜交鱧肝臟內(nèi)免疫球蛋白IgM基因的相對(duì)表達(dá)水平Fig.4 Relative expression level of specific immune gene IgM in liver of immunized hybrid snakehead

2.5 RPS的測(cè)定

免疫后第18 天，用舒伯特氣單胞菌強(qiáng)毒株WL1483進(jìn)行活菌攻毒，結(jié)果顯示，對(duì)照組雜交鱧第1天開始出現(xiàn)死亡，而OM170701注射免疫組從第2天開始出現(xiàn)死亡，部分死亡個(gè)體內(nèi)臟(肝、脾、腎等)出現(xiàn)白點(diǎn)，死亡后可從雜交鱧肝、脾、腎等部位分離到舒伯特氣單胞菌。實(shí)驗(yàn)期間免疫組累計(jì)死亡率為17.78%，對(duì)照組累計(jì)死亡率為50.1%(圖5)，該疫苗對(duì)雜交鱧的RPS為65%。

3 討論

國(guó)際上有多種魚類弱毒疫苗開發(fā)成功，其中柱狀黃桿菌減毒活疫苗Aquavac-Col已在美國(guó)批準(zhǔn)上市[13]，大菱鲆遲緩愛德華菌活疫苗獲得國(guó)家新獸藥證書[14]。龐曉茹[15]、Cheng等[16]、Takano等[17]篩選了遲緩愛德華菌天然弱毒株疫苗，付小哲等[13]通過(guò)鏈霉素連續(xù)傳代誘導(dǎo)獲得的約氏黃桿菌減毒株等也在實(shí)驗(yàn)室取得較好的免疫保護(hù)效果。

圖5 舒伯特氣單胞菌強(qiáng)攻毒后免疫組與對(duì)照組累計(jì)死亡率Fig.5 Accumulated mortality of immunization group and control group after challenge

此研究中通過(guò)篩選獲得的天然弱毒株，與羅霞等[8]、劉春等[18]、Liu等[19]分離的舒伯特氣單胞菌強(qiáng)度株比較，對(duì)雜交鱧和大口黑鱸的毒性較弱。通過(guò)注射免疫雜交鱧后，第28 天RPS為65%，表明該舒伯特氣單胞菌弱毒活疫苗具有良好的免疫保護(hù)效果。而付小哲等[13]用約氏黃桿菌減毒株制備疫苗浸泡免疫鱖魚后第 28 天 RPS 為85.9%，造成這種差異的原因可能與鱖體表具有發(fā)達(dá)的黏膜免疫系統(tǒng)有關(guān)。 RPS是評(píng)價(jià)疫苗免疫效果最直接指標(biāo)，不同弱毒株保護(hù)率存在差異可能與種類、魚類品種、免疫途徑等存在密切的關(guān)系[13]。

IL-8是趨化因子家族中的重要成員，它能幫助中性粒細(xì)胞遷移至病原侵入的部位。另外，據(jù)報(bào)道IL-8也能促進(jìn)其他細(xì)胞因子的表達(dá)[17,20]。IL-1β是一種典型的促炎癥因子，由包括巨噬細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞產(chǎn)生，它能促進(jìn)免疫細(xì)胞的增殖并作為早期免疫反應(yīng)的重要信號(hào)[21]。IL-1β表達(dá)水平的變化說(shuō)明了疫苗進(jìn)入魚體后起到了對(duì)免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用[22]。補(bǔ)體由多種具有酶活性的球蛋白組成，不僅是自然免疫的重要組成部分，同時(shí)也在獲得免疫中發(fā)揮作用[23-24]，能夠增強(qiáng)體液和細(xì)胞介導(dǎo)的特異性免疫[25]。其中補(bǔ)體C3(complement 3，C3)是補(bǔ)體系統(tǒng)中含量最高的成分，可同時(shí)參與補(bǔ)體系統(tǒng)的三種激活途徑[26]。張智慧[27]制備了鰻弧菌減毒活疫苗，免疫魚體后，魚體內(nèi)相關(guān)免疫因子IL-8、IL-1β、補(bǔ)體C3的表達(dá)量均為上調(diào)，說(shuō)明鰻弧菌減毒活疫苗能引起魚體的免疫應(yīng)答。在該研究中，疫苗免疫魚體后，在雜交鱧肝臟中IL-8、IL-1β、補(bǔ)體C3的表達(dá)量均為上調(diào)，這與張智慧[27]的研究結(jié)果一致，說(shuō)明該弱毒活疫苗能有效激發(fā)宿主免疫細(xì)胞的趨化作用，能激活先天免疫反應(yīng)，并通過(guò)巨噬細(xì)胞吞噬后激發(fā)宿主的適應(yīng)性免疫應(yīng)答，還能誘導(dǎo)雜交鱧體內(nèi)補(bǔ)體C3含量的增加，從而激活雜交鱧非特異性免疫防御機(jī)制，抵御外來(lái)微生物入侵。

IgM是特異性免疫應(yīng)答中的標(biāo)記基因，是硬骨魚類主要的免疫球蛋白形式[28]?？乖碳C(jī)體后，機(jī)體產(chǎn)生的抗體IgM會(huì)參與初次免疫反應(yīng)[29]。付小哲等[13]通過(guò)制備約氏黃桿菌減毒活疫苗，免疫魚體后，特異性免疫因子IgM的相對(duì)表達(dá)量上調(diào)，說(shuō)明該疫苗能誘導(dǎo)魚體的免疫應(yīng)答。舒伯特氣單胞菌弱毒活疫苗OM170701株免疫雜交鱧后，在免疫后的第28天，IgM表達(dá)水平達(dá)到最高，此結(jié)果與付小哲等[13]的研究結(jié)果一致，說(shuō)明該弱毒疫苗株也可引起雜交鱧特異性免疫應(yīng)答。

綜上所述，舒伯特氣單胞菌弱毒株OM170701注射免疫雜交鱧可誘導(dǎo)雜交鱧相關(guān)免疫因子IL-8、IL-1β、補(bǔ)體C3基因表達(dá)上調(diào)，特異性免疫因子IgM的相對(duì)表達(dá)量上調(diào)，RPS可達(dá)65%，表明該疫苗可有效防治舒伯特氣單胞菌導(dǎo)致的雜交鱧類結(jié)節(jié)病。