朱文慧,宦海珍,李 月,步 營,儀淑敏,勵建榮,李學鵬,*,沈 琳

(1.渤海大學食品科學與工程學院,遼寧省高校重大科技平臺“食品貯藏加工及質(zhì)量安全控制 工程技術(shù)研究中心”,國家魚糜及魚糜制品加工技術(shù)研發(fā)分中心,遼寧錦州 121013; 2.大連東霖食品股份有限公司,遼寧大連 116000)

水產(chǎn)品在凍結(jié)、凍藏、解凍過程中受許多因素(凍結(jié)方式、凍藏溫度及溫度波動、解凍方式等)的影響使肌肉蛋白氧化變性,導致水產(chǎn)品品質(zhì)(質(zhì)構(gòu)、色澤、風味等)劣變給企業(yè)帶來經(jīng)濟損失,同時影響消費者的健康[1-3]。研究表明,氧化是導致水產(chǎn)品品質(zhì)變化的重要因素之一,關(guān)于水產(chǎn)品蛋白氧化的研究已成熱點[4-8]。

秘魯魷魚隸屬頭足綱,柔魚科,是海生軟體動物,在秘魯和智利沿岸及外海資源豐富,資源量達千萬噸。其肉質(zhì)比其他魷魚鮮嫩,營養(yǎng)豐富,是典型的高蛋白低脂肪海產(chǎn)品[9]。秘魯魷魚為遠洋捕撈動物,捕撈上來需要就地凍結(jié),因此,秘魯魷魚的進出口及加工均以凍品為主。本研究組在前期研究發(fā)現(xiàn),秘魯魷魚在解凍過程中伴隨著蛋白質(zhì)氧化[10-11],蛋白氧化不僅會影響產(chǎn)品的滋味、嫩度、色澤、多汁性等感官品質(zhì),還會影響肌肉的組織結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)[12-13]。岳開華等[4]研究發(fā)現(xiàn)海鱸魚肌原纖維蛋白經(jīng)羥自由基氧化后,其結(jié)構(gòu)和功能均發(fā)生顯著變化,且隨著氧化時間的延長和氧化劑濃度的增加,羰基含量和表面疏水性增加,二聚酪氨酸先增加后減少,總巰基含量下降,一些生色氨基酸大量減少。秦軍委等[14]亦發(fā)現(xiàn)在凍藏過程中,羥自由基氧化使烏鱧肌原纖維遭到破壞,蛋白氧化變性,從而導致其保水性降低。

為了明晰蛋白氧化對秘魯魷魚肌肉保水性以及蛋白結(jié)構(gòu)的影響,本研究通過建立羥基自由基氧化體系,探討不同H2O2濃度對秘魯魷魚肌肉保水性及微觀結(jié)構(gòu)的影響,闡明蛋白氧化對肌肉保水性的影響規(guī)律,進一步揭示蛋白氧化對秘魯魷魚肉品質(zhì)影響機制,為其在貯藏加工過程中蛋白氧化控制、提高肌肉保水性提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

凍結(jié)秘魯魷魚(捕撈后立即凍結(jié),貯藏在-20 ℃,貯藏時間少于3個月) 大連東霖食品股份有限公司提供，密封凍藏運回實驗室,快速分割成磚狀,質(zhì)量約300 g(長寬約15 cm×8 cm),置于-40 ℃超低溫冰箱中備用；三羥甲基氨基甲烷(Tris)、2,4-二硝基苯肼(2,4-dinitrophenylhydrazone,DNPH)、乙二胺四乙酸(ethylene diaminetetraacetic acid,EDTA)、三氯乙酸、鹽酸、鹽酸胍(均為分析純) 購自南京圣比奧生物科技公司；蘇木素-伊紅(HE) 購自北京索萊寶科技有限公司。

PHS-3C型雷磁pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司;Testo 106型高精度食品溫度計 德國德圖集團;PL602-L電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;FJ200-SH型實驗室均質(zhì)機 上海標本模型廠;紐邁-NMI-20低場核磁共振儀 上海紐邁電子科技有限公司;SORVALL Stratos型冷凍高速離心機 美國Thermo公司;UV-2550紫外-可見光分光光度計 島津儀器(蘇州)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品處理 實驗以凍結(jié)的秘魯魷魚胴體為研究對象。使用時,將從分裝樣品中隨機選取的秘魯魷魚置于10 ℃環(huán)境中解凍至完全,用濾紙輕輕檫干表面水分,將解凍完全的魷魚切分成2 cm×2 cm×2 cm的正方體,然后置于不同濃度的H2O2溶液(其中,FeCl3濃度為0.01 mmol/L、抗壞血酸濃度為0.1 mmol/L,H2O2濃度分別為1、5、10、50 mmol/L)的氧化體系中(1/4.5,W/V)模擬肌肉氧化,在4 ℃條件下氧化24 h后,最后用1 mmol/L EDTA終止?？瞻讓φ諡閮鼋Y(jié)的秘魯魷魚解凍完全后直接放于未加氧化劑的蒸餾水中4 ℃放置24 h。

1.2.2 魷魚肌原纖維蛋白的提取 依據(jù)李學鵬等[15]的方法并加以修改,將解凍氧化后的秘魯魷魚肉攪碎,加入4倍體積的pH7.2、20 mmol/L的Tris-HCl,5000 r/min均質(zhì)20 s,然后在5000 r/min條件下離心15 min。上述過程反復2次,最后一次沉淀中加入4倍體積的20 mmol/L Tris-HCl-NaCl緩沖液(含0.6 mol/L NaCl,pH=7.2),5000 r/min均質(zhì)20 s,5000 r/min、離心15 min,取上層清液備用,要求整個提取過程在0～4 ℃條件下進行。

1.2.3 羰基含量測定 根據(jù)Oliver等[16]的方法略加修改。取1 mL濃度約為1.0 mg/mL氧化蛋白溶液放入離心管中,每管中加入1 mL 10 mmol/L的2,4-二硝基苯肼(對照組加入2 mol/L HCl,其余操作相同),室溫下暗處靜置1 h,加入4 mL 20%三氯乙酸,10000 r/min,4 ℃離心15 min,棄上清液,用1 mL乙酸乙酯∶乙醇 (V/V=1∶1)洗滌沉淀3次,除去未反應(yīng)試劑,加入3 mL鹽酸胍溶液(6 mol/L,溶于20 mmol/L 磷酸鈉緩沖液,pH6.5),37 ℃下溶解沉淀25 min,10000 r/min,4 ℃離心 5 min,去除不溶性部分。所得溶液于370 nm波長下測定吸光度,摩爾吸光系數(shù)為21000 L/(mol·cm),羰基含量表示為nmol/mg蛋白(myofibrillar protein,MP)。

1.2.4 紫外吸收光譜分析 將肌原纖維蛋白溶液稀釋,在4 ℃條件下,10000×g高速離心15 min。上清液用20 mmol/L Tris-HCl-NaCl緩沖液(含0.6 mol/L NaCl,pH=7.2)進一步稀釋至0.4 mg/mL后,測定樣品在220～360 nm的吸收光譜。

1.2.5 光學顯微鏡觀察秘魯魷魚肌肉微觀結(jié)構(gòu) 將氧化處理后的秘魯魷魚肉切成5 mm×5 mm×5 mm的小塊,-20 ℃冷藏20 min,用冷凍切片機切成8 μm薄片,置于載玻片上,采用蘇木素-伊紅(HE)染色法染色,在光學顯微鏡下放大4倍觀察[17]。

1.2.6 肌原纖維小片化指數(shù)(Myofibrillar flake index,MFI)的測定 根據(jù)Culler等[18]描述的方法并加以修改后進行測定。剪取5 g經(jīng)氧化后的秘魯魷魚肉樣品充分剪切,除去任何可視脂肪和結(jié)締組織,將剪切好的肌肉,在10倍體積的4 ℃的分離介質(zhì)中(分離介質(zhì)含100 mmol/L KCl、20 mmol/L磷酸鉀、0.1 mmol/L EDTA、l mmol/L CaCl2溶液用HCl調(diào)pH7.0),用組織搗碎機搗碎攪勻。勻漿在1000×g離心15 min,然后緩慢倒出上層清液,沉淀又在10倍體積分離介質(zhì)中,用攪捧攪拌制成懸液,在1000×g離心15 min。慢慢倒出上層清液,沉淀在2.5倍體積的分離介質(zhì)中制成懸液，通過150目濾布除去結(jié)締組織和碎片,再加2.5倍體積的分離介質(zhì)來幫助肌原纖維通過篩孔。合并濾液,將濾液用雙縮脲法測蛋白濃度,然后用MFI緩沖液調(diào)整懸浮液蛋白濃度為0.5 mg/mL,在540 nm處測吸光度,將所得結(jié)果乘以200,即為MFI值。

1.2.7 蒸煮損失率測定 稱取一定大小(約2 cm×2 cm×2 cm)的秘魯魷魚樣品,記下其重量,將魷魚放入蒸煮袋中在85 ℃水浴鍋中蒸煮20 min。蒸煮后冷卻至室溫,用吸水紙吸干水分,然后再次稱重量,蒸煮損失率的計算公式如(1)[19]。

蒸煮損失率(%)=[蒸煮前重量(g)-蒸煮后重量(g)]/蒸煮前重量(g)×100

式(1)

1.2.8 離心損失率測定 將解凍好的魷魚肉準確稱其質(zhì)量后用濾紙將肉樣包裹好,放入離心管中,于4 ℃下4000×g,離心10 min,取出樣品,剝?nèi)V紙,稱肉樣重[17]。

離心損失率(%)=[離心前重量(g)-離心后重量(g)]/離心前重量(g)×100

式(2)

1.2.9 低場核磁共振實驗 魷魚樣品解凍后,切成1.5 cm×1.5 cm×2 cm的長方體,轉(zhuǎn)入核磁管,采用Carr-Purcell-Meiboom-Gill(CPMG)脈沖序列,在32 ℃下進行橫向弛豫時間T2的測定。參數(shù)設(shè)定:采樣點數(shù)(TD)為560020,90度脈沖寬度為14,接收譜寬(SW)為200 kHz,采樣重復時間(TR)為2000 ms,重復掃描次數(shù)(NS)為8,半回波時間(τ)為100 μs,回波個數(shù)(Echocnt)為4000。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行方差分析,采用多重比較分析法對各處理組進行差異顯著性分析,P<0.05為差異顯著,P<0.01為差異極顯著。試驗結(jié)果如未特殊說明均最少為3次重復,結(jié)果均表示采用“平均值±標準偏差”。

2 結(jié)果與討論

2.1 蛋白質(zhì)氧化對秘魯魷魚肌原纖維蛋白中羰基含量的影響

蛋白質(zhì)中羰基的形成(醛基和酮基)是蛋白質(zhì)發(fā)生氧化以后的一個顯著變化。羰基可由氨基酸側(cè)鏈(通常為易受自由基攻擊的帶有NH或者NH2的氨基酸殘基)及肽鏈的斷裂產(chǎn)生[20],因此羰基含量一直是反映蛋白質(zhì)氧化程度的重要理化指標。

羥自由基氧化體系對秘魯魷魚肌原纖維蛋白中羰基含量的影響如圖1所示,由圖1可知,隨著H2O2濃度的增加,羰基含量呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢,且與空白相比差異極顯著(P<0.01)。其中空白對照組羰基含量為2.09 nmol/mg MP,當H2O2濃度達到50 mmol/L時,羰基含量增加了53.59%。羰基含量的增加可能是由于羥自由基攻擊了氨基酸側(cè)鏈或肽鏈導致的[21]。在此氧化體系中,隨著H2O2濃度的增加,羥自由基濃度也隨之增加,使得更多的羥基攻擊氨基酸側(cè)鏈或肽鏈,導致羰基含量不斷升高,本研究與彭新顏等[22]的研究結(jié)果一致。

圖1 羥自由基氧化體系對秘魯魷魚肌原纖維蛋白中羰基含量的影響Fig.1 Effect of hydroxyl radical oxidation system on carbonyl content of Dosidicus gigas myofibrillar protein注:圖中不同小寫字母表示差異極顯著(P<0.01), 不同大寫字母表示差異顯著(P<0.05),圖4、圖5同。

2.2 氧化對紫外吸收光譜的影響

紫外吸收光譜可以反映肌原纖維蛋白內(nèi)某些生色氨基酸(色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸)的含量,被廣泛地應(yīng)用于評價氧化引起的蛋白結(jié)構(gòu)變化[20]。羥自由基氧化對秘魯魷魚的紫外吸收光譜的影響如圖2所示,由圖2可以看出,秘魯魷魚肌原纖維蛋白的紫外吸收光譜的特征峰值隨著H2O2濃度增加而下降。這是由于羥基會使肌原纖維蛋白中的色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸等生色氨基酸發(fā)生氧化,使得它們的含量減少,導致秘魯魷魚肌原纖維蛋白的紫外吸收光譜吸收峰值下降。李銀[20]、岳開華等[4]的研究也有相同的結(jié)果,氧化使得肌原纖維蛋白中的酪氨酸含量顯著下降,岳開華等[4]還發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)氧化導致的聚集使得生色氨基酸殘基被包埋,也會導致吸收峰值下降。

圖2 肌原纖維蛋白紫外吸收光譜圖Fig.2 Ultraviolet and visible spectrum of myofibrillar protein

2.3 氧化對秘魯魷魚微觀組織結(jié)構(gòu)的影響

H2O2氧化處理對秘魯魷魚肌肉組織微結(jié)構(gòu)的影響結(jié)果如圖3所示,如圖3可知,未經(jīng)過氧化處理(對照組,0 mmol/L)的秘魯魷魚肌肉組織呈緊密連接的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)且肌纖維束結(jié)構(gòu)完整,縫隙均勻。經(jīng)過不同濃度H2O2氧化處理后,秘魯魷魚肌原纖維蛋白發(fā)生了氧化作用使得骨架蛋白發(fā)生降解,從而導致肌原纖維結(jié)構(gòu)遭到破壞,并且肌肉微觀結(jié)構(gòu)的破壞程度隨著氧化濃度的增加而增加。在H2O2濃度為10、50 mmol/L時,很難在顯微鏡下找到完整的肌纖維結(jié)構(gòu)。由此可知,H2O2氧化處理能夠明顯破壞秘魯魷魚肌肉組織結(jié)構(gòu),而組織結(jié)構(gòu)劣變會降低肌肉的持水性,弱化肌肉與水的結(jié)合能力,從而產(chǎn)生大量的滴水損失,使得水分發(fā)生遷移,最終導致肌肉質(zhì)地軟化和品質(zhì)下降[23,17]。

圖3 羥基自由基氧化體系對秘魯魷魚肌肉微觀組織結(jié)構(gòu)的影響(×4)Fig.3 Effects of hydroxyl radical oxidation system on the muscle microstructure of Dosidicus gigas(×4)注:A. 0 mmol/L H2O2處理組(對照組); B. 1 mmol/L H2O2處理組;C. 5 mmol/L H2O2處理組; D. 10 mmol/L H2O2處理組;E. 50 mmol/L H2O2處理組。

2.4 蛋白質(zhì)氧化對肌原纖維小片化指數(shù)(MFI)的影響

肌原纖維小片化指數(shù)(MFI)反映的是肌原纖維及其骨架蛋白完整度的指標。MFI越大,說明肌原纖維內(nèi)部結(jié)構(gòu)的完整性受到破壞的程度越大[24-25]。羥自由基氧化體系對秘魯魷魚肌原纖維小片化指數(shù)的影響如圖4所示,由圖4可知,經(jīng)過不同氧化濃度處理后的秘魯魷魚肌肉間肌原纖維小片化指數(shù)差異極顯著(P<0.01),且隨著氧化濃度的增加,肌原纖維小片化指數(shù)逐漸增加。在H2O2濃度為50 mmol/L時,肌原纖維小片化指數(shù)達到103,約是對照組(0 mmol/L)的1.5倍。肌原纖維小片化指數(shù)升高說明氧化使得肌原纖維和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的完整性遭到破壞,蛋白質(zhì)變性,肌原纖維間隙變大,暴露于外界的結(jié)構(gòu)接觸氧的機會更多,從而加劇了小片化的速率[14]。光學顯微鏡下秘魯魷魚肌肉微觀組織結(jié)構(gòu)顯示H2O2濃度越高,肌原纖維結(jié)構(gòu)被破壞的越嚴重,與肌原纖維小片化指數(shù)結(jié)果相一致。

圖4 羥自由基氧化體系對秘魯魷魚肌原纖維小片化指數(shù)影響Fig.4 Effect of hydroxyl radical oxidation system on myofibrillar flake index of Dosidicus gigas

2.5 蛋白氧化對秘魯魷魚保水性的影響

蒸煮損失率和離心損失率是衡量蛋白質(zhì)保水性的重要指標。圖5為羥自由基氧化體系對秘魯魷魚肌肉保水性的影響。由圖5可知,氧化后秘魯魷魚肌肉蒸煮損失率隨著氧化濃度的增加逐漸升高,且組間差異不顯著(P>0.05)。這可能是由于蒸煮僅僅使蛋白質(zhì)發(fā)生變性,對蒸煮損失率影響不大有關(guān)。離心損失率與蒸煮損失率具有相同的變化趨勢,但不同氧化濃度間離心損失率差異明顯。這可能是因為蛋白質(zhì)氧化導致肌肉組織結(jié)構(gòu)的完整性遭到破壞,肌原纖維間隙變大,使得存在于肌肉組織間隙的自由水難以被束縛,在受到離心作用時,自由水被排出,最終導致肌肉保水性下降,從而降低魚肉的品質(zhì)。

圖5 羥自由基氧化體系對秘魯魷魚肌肉保水性的影響Fig.5 Effect of hydroxyl radical system on water hold capacity of Dosidicus gigas

2.6 蛋白氧化對秘魯魷魚T2橫向弛豫時間的影響

經(jīng)過氧化處理后的秘魯魷魚水分T2弛豫時間圖譜如圖6所示,由圖可知,弛豫圖譜上顯示4個峰,分別代表秘魯魷魚肌肉中存在的3種狀態(tài)的水,即結(jié)合水、不易流動水和自由水。其中0～40 ms(T21,T22)間有兩個小峰代表結(jié)合水,第一個峰表示強結(jié)合水,第二個峰表示弱結(jié)合水;40～200 ms(T23)的峰為主峰,代表不易流動水;200～1000 ms(T24)間的峰代表自由水。

圖6 秘魯魷魚水分T2弛豫時間圖譜Fig.6 Transverse relaxation time T2 of water in Dosidicus gigas

表1表示的是各峰與橫坐標面積百分比即為各組分水所占百分含量。由表1可知,對于結(jié)合水的含量P21和不易流動水的含量P22而言,各處理組差異不顯著(P>0.05);而自由水含量P23各處理組存在明顯差異,且隨著H2O2濃度的增加,自由水含量逐漸增加。這說明氧化使得蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,從而影響蛋白質(zhì)與水的結(jié)合能力,使得一部分結(jié)合水轉(zhuǎn)化為自由水。

表1 秘魯魷魚水分分布及組成Table 1 Water distribution and compositon of Dosidicus gigas

2.7 蛋白氧化對秘魯魷魚物化特性指標間的相關(guān)性分析

羰基含量、蒸煮損失率、離心損失率、結(jié)合水相對百分含量(P21)、不易流動水相對百分含量(P22)、自由水相對百分含量(P23)、肌原纖維小片化指數(shù)(MFI)之間的相關(guān)性分析如表2所示。由該表可以看出,羰基與離心損失率、P23、MFI呈極顯著正相關(guān)(P<0.01);蒸煮損失率與P21呈顯著正相關(guān)(P<0.05),離心損失率與P22呈顯著負相關(guān)(P<0.05),與P23呈顯著正相關(guān)(P<0.05),與MFI呈極顯著正相關(guān)(P<0.01);P21與P23呈顯著正相關(guān)(P<0.05);P22與MFI呈顯著負相關(guān)(P<0.05);P23與MFI呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)。

表2 指標間相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis between indexes

3 結(jié)論

在羥基自由基氧化體系中,隨著氧化濃度的增加,秘魯魷魚肌原纖維蛋白的羰基含量極顯著增加(P<0.01),一些生色氨基酸減少,導致蛋白的紫外吸收光譜吸收峰值下降。肌肉微觀結(jié)構(gòu)的破壞程度增加,肌纖維間隙增大、結(jié)構(gòu)疏松,并逐步出現(xiàn)肌纖維小片化,肌原纖維小片化指數(shù)增加。肌肉保水性指標結(jié)果顯示,蛋白氧化對肌肉蒸煮損失率影響不大,但顯著影響離心損失率(P<0.05),氧化使得蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,從而影響蛋白質(zhì)與水的結(jié)合能力,使得一部分結(jié)合水轉(zhuǎn)化為自由水。由此可見,蛋白質(zhì)氧化會破壞秘魯魷魚肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu),降低肌肉保水性,進而影響肌肉品質(zhì),說明蛋白結(jié)構(gòu)改變與肉及肉制品的食用品質(zhì)密切相關(guān)。因此秘魯魷魚在后續(xù)的生產(chǎn)加工過程中應(yīng)該抑制蛋白氧化,進而保證產(chǎn)品品質(zhì)。