邵麗麗 馬璟玥 練婷婷 魏世娟 任杰 劉全忠

天津醫(yī)科大學總醫(yī)院皮膚科 天津性傳播疾病研究所300052

沙眼衣原體（Chlamydia trachomatis，Ct）泌尿生殖道感染是近年來國內(nèi)外常見性傳播疾病，危害嚴重，引起一系列的并發(fā)癥和后遺癥，在女性患者中引起慢性輸卵管炎、慢性盆腔炎，不孕等［1］，Ct感染所致的輸卵管性不孕約占10%～20%［2］。多年來一直認為這些并發(fā)癥和后遺癥是由于衣原體生殖道持續(xù)感染所致，但研究顯示，感染后期的輸卵管病變局部組織幾乎檢測不到衣原體，多認為這種病理變化是由于免疫反應所致［3］，但持續(xù)的免疫刺激來源成了疑問。越來越多的研究［4-5］提示，腸道微生態(tài)與機體免疫和疾病有著密切關系，我們設想衣原體是否也存在于腸道微生態(tài)中并起著重要作用。我們應用鼠衣原體（Chlamydia muridarum，C.muridarum）即鼠肺炎衣原體（Mouse pneumonitis，MoPn）感染小鼠生殖道，經(jīng)多部位檢測，觀察鼠衣原體能否從陰道感染傳播至生殖道以外的其他組織器官并長期持續(xù)存在。

材料與方法

一、主要試劑及儀器

AX-70熒光顯微鏡（日本Olympus公司）、組織勻漿儀器（美國Kennesaw Omni公司）、超聲破碎儀（日本SANYO公司）、組織勻漿管（美國KennesawOmni公司）、DNA提取試劑盒（美國Genesee Scientific公司）、異硫氰酸熒光素（FITC）標記的羊抗兔二抗（美國Sigma公司）、孕酮（Depo-provera，美國Pharmacia Upjohn公司）等。

二、實驗動物、菌株、細胞株

實驗動物：5～6周齡雌性C57BL/6J小鼠120只，購于軍事醫(yī)學科學院，分成4組，分籠飼養(yǎng)（每籠5只）并做好標記，所有動物均飼養(yǎng)在本院中心實驗室動物室，溫度為20～24℃，光暗周期12 h下飼養(yǎng)。實驗所使用的鼠衣原體菌株由美國德州大學微生物與免疫學系鐘光明教授提供，本實驗室自行傳代并純化保存有感染能力的原體（elementary bodies，EB）；HeLa細胞株，用于體外培養(yǎng)衣原體，購自美國細胞株保存中心（ATCC，cat#CCL-2.1）。

三、動物分組及處理

實驗小鼠分4組：陰道接種組、灌胃接種組、肛門直腸接種組、眶后靜脈叢接種組，每組均設有蔗糖磷酸谷氨酸鹽緩沖液（SPG）陰性對照組。不同感染組小鼠均在感染后第3、7天及此后每隔7天用拭子取陰道及直腸分泌物，檢測拭子中脫落細胞感染衣原體的數(shù)量。

1.陰道接種組：實驗組35只，陰性對照組5只。感染前5天每只小鼠皮下注射2.5 mg孕酮，同步化小鼠生理周期以促進小鼠對EB的易感性；將-80℃冰箱凍存的EB用SPG緩沖液稀釋后，在實驗組小鼠陰道后穹窿處接種10μl含2×105包涵體形成單位（IFU）EB。對照組小鼠接種同體積的SPG緩沖液。為排除小鼠自食或通過糞口途徑污染胃腸道，每只小鼠均帶上直徑3 cm的頸圈。實驗組于接種后第7、14、28、56、105天分別處死5只小鼠，分離小鼠生殖道（陰道及與宮頸連接處組織、兩側(cè)宮角及卵巢）、胃腸道（直腸、結(jié)腸、盲腸、小腸、胃）及腸外組織器官（心、肝、脾、肺、腎）分段勻漿，分別用免疫熒光法及定量PCR檢測不同時間點不同組織中衣原體活菌量和基因組。另外實驗組在感染第56天及105天各處死5只小鼠，陰性對照組分別處死3只、2只小鼠，分離生殖道及胃腸道組織，迅速拍照后甲醛固定，肉眼及HE染色觀察生殖道輸卵管積水的評分、輸卵管積水的發(fā)生率、炎癥程度及胃腸道組織病理變化。

2.灌胃接種組：實驗組30只，分為低劑量組及高劑量組各15只，陰性對照組5只，低劑量與高劑量組小鼠分別給予200μl含1×104及1×107IFU EB灌胃，對照組小鼠接種同體積SPG緩沖液。實驗組在感染第28、56天，分別處死5只小鼠，分離生殖道、胃腸道及腸外組織，分段勻漿，檢測不同組織中衣原體活菌量和基因組。實驗組及對照組在感染第56天分別處死5只小鼠，分離生殖道、胃腸道組織，拍照后甲醛固定，觀察組織病理變化。

3.肛門直腸接種組：分組同灌胃接種組，低劑量與高劑量組小鼠分別給予2μl含1×104及1×107IFU EB直腸內(nèi)接種，后續(xù)處理同灌胃接種組。

4.眶后靜脈叢接種組：實驗組及陰性對照組各5只。麻醉小鼠，左手固定小鼠頭部，食指按于眼球后使眼球突出，沿內(nèi)眥眼眶后壁刺入，實驗組小鼠接種100μl含2×105IFU EB，對照組接種同體積SPG緩沖液。接種后的第3、5、7、10、14天小鼠尾靜脈取血，檢測血中衣原體活菌量及基因組。感染第56天處死小鼠，生殖道、胃腸道組織甲醛固定，觀察組織病理變化。

四、間接免疫熒光法檢測活菌量

將用拭子取的陰道及直腸分泌物、不同組織分段勻漿、小鼠尾靜脈血，825×g離心5 min后，取50μl上清液接種至已制備的致密單層HeLa細胞，37℃、CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)20～22 h。采用免疫熒光染色檢測標本中活衣原體的數(shù)量，一抗為兔抗鼠肺炎衣原體EB（實驗室自行制備，1∶2 000稀釋），二抗為FITC標記的羊抗兔IgG（綠色熒光，1∶300稀釋），熒光顯微鏡下觀察，計數(shù)標本中衣原體數(shù)量。根據(jù)5個視野下包涵體的平均值及不同的稀釋濃度和放大倍數(shù)計算每個標本中衣原體的IFU，以10為底數(shù)對數(shù)（lg）轉(zhuǎn)換，計算各組在每個時間點的菌量。

五、定量PCR檢測感染后不同時間點血液中及不同組織中衣原體的數(shù)量

按DNA小規(guī)模提取試劑盒說明書提取陰道及直腸分泌物、不同組織的分段勻漿、小鼠尾靜脈血DNA，采用10μl反應體系，95℃變性3 min，95℃擴增15 s，60℃退火1 min，40個循環(huán)。qPCR引物由蘇州金唯智（北京）生物科技有限公司合成，16S rRNA編碼區(qū)域正向引物：5′-CGCCTGAGGAGTAC ACTCGCAGGA-3′，反向引物：5′-CCAACACCTCAC GGCACGAG-3′；探針：5′-CACAAGCAGTGGAGCAT GTGGTTTAA-3′。計算得到基因拷貝數(shù)，計算值以10為底數(shù)對數(shù)（lg）轉(zhuǎn)換，計算各組每個時間點的基因拷貝數(shù)。

六、輸卵管積水評分及生殖道、胃腸道組織病理觀察

輸卵管積水評分標準［6］：0分，無明顯水腫；1分，輸卵管直徑小于卵巢直徑，肉眼不可見，需用放大鏡觀察；2分，有明顯水腫，但輸卵管直徑仍小于卵巢直徑；3分，輸卵管直徑等于卵巢直徑；4分，輸卵管直徑大于卵巢直徑。分離生殖道及胃腸道組織行常規(guī)組織病理檢查，HE染色觀察組織炎癥情況。

七、數(shù)據(jù)統(tǒng)計

結(jié) 果

一、陰道接種組小鼠胃腸道衣原體定植情況

感染后第7天時，檢測5只小鼠的陰道均感染衣原體，在每只小鼠的生殖道、胃腸道及腸外組織中均檢測到活菌和基因組，其中陰道及與宮頸連接處組織即接種處的菌量最高（圖1）；第14天時在每只小鼠的生殖道、胃腸道及腸外組織中亦檢測到活菌和基因組；第28天時，腸外組織器官中均未檢測到活菌，僅在肝臟及脾臟中可檢測到衣原體基因組，生殖道和胃腸道組織仍可檢測到活菌，但滴度較前減少；第56天時，除在胃腸道組織中能檢測到活菌與基因組外，其他組織均未檢測到；第105天時，每只小鼠的胃腸道組織中仍能檢測到活菌與基因組。見圖1。

圖1 小鼠陰道接種鼠衣原體后7～105 d采用免疫熒光及定量PCR檢測衣原體在體內(nèi)的感染分布情況（n=5）

陰道拭子分泌物顯示，鼠衣原體在感染3～14 d時明顯增殖，第21～35天時數(shù)量減少，自第42天時無法檢測到活菌。肛門直腸拭子分泌物顯示，在感染第7天時開始檢測到活菌，至第49天活菌量維持相對平穩(wěn)，從第56天時，檢測到的活菌數(shù)量開始相對減少，但至第105天時仍能檢測到活菌。見圖2。

圖2 小鼠陰道接種鼠衣原體后免疫熒光檢測3～105 d陰道及肛門直腸拭子脫落細胞中衣原體的活菌量（n=5）

二、灌胃接種組、肛門直腸接種組小鼠胃腸道衣原體定植情況

灌胃接種組、肛門直腸接種組小鼠，在接種第28天時，胃腸道均能檢測到衣原體活菌和基因組；第56天時，僅在盲腸、結(jié)腸、直腸中檢測到衣原體活菌，胃、小腸中未檢測到活菌，但仍可檢測到衣原體基因組。兩組小鼠生殖道及腸外組織中均未檢測到活菌與衣原體基因組。見圖3。

肛門直腸拭子分泌物顯示，灌胃接種低劑量（1×104IFU）的衣原體后，每只小鼠在第7天時均在直腸中檢測活菌，之后維持在相對穩(wěn)定的水平；接種高劑量（1×107IFU）衣原體后，在第3天時即有3只小鼠檢測到活菌，至第7天，所有小鼠均檢測到活菌，與低劑量組相比鼠衣原體未在胃腸道中形成爆發(fā)性增長。肛門直腸接種組所有小鼠在第3天時即檢測到活菌，兩劑量組檢測到活菌數(shù)相當。兩種感染途徑均未在陰道拭子分泌物中檢測到活菌。見圖4。

圖3 灌胃接種、肛門直腸接種小鼠衣原體后28、56 d采用免疫熒光及定量PCR檢測衣原體在體內(nèi)的感染分布情況（n=5）

圖4 灌胃接種、肛門直腸接種以高、低劑量小鼠衣原體后免疫熒光檢測3～56 d肛門直腸拭子脫落細胞中衣原體的活菌量（n=5）

三、眶后靜脈叢接種組小鼠胃腸道衣原體定植情況

每只小鼠接種后第3、5、7、10天在血液中檢測到衣原體基因組拷貝數(shù)常用對數(shù)值分別為2.97±0.21、2.44±0.45、3.01±0.35、2.94±0.47，第14天僅有3只小鼠檢測到衣原體基因組拷貝數(shù)常用對數(shù)值為1.00±0.43，所有小鼠在這些時間點未檢測到活菌。至接種后第14天每只小鼠在肛門直腸拭子中檢測到衣原體活菌常用對數(shù)值為4.93±0.19，并持續(xù)存在至第56天（圖5），但陰道拭子一直未檢測到衣原體活菌。

圖5 眶后靜脈叢接種小鼠衣原體后免疫熒光檢測3～56 d肛門直腸拭子脫落細胞中衣原體的活菌量

四、不同途徑接種鼠衣原體后小鼠生殖道及胃腸道的病理變化

以第56天為例，陰道接種組小鼠接種衣原體后，5只小鼠的生殖道形成嚴重的輸卵管積水及慢性炎癥、輸卵管擴張（圖6），小鼠輸卵管積水評分（5.6±2.07），正常對照組未見到明顯異常；胃腸道形態(tài)及長度與正常小鼠相比無明顯差異，小鼠腸道黏膜層及黏膜下層均未見明顯的慢性炎癥細胞浸潤。接種后第105天，生殖道及胃腸道的病理變化與第56天時相似。灌胃接種組、肛門直腸接種組、眼眶后靜脈叢接種組第56天，生殖道及胃腸道均未見到明顯的炎癥病理變化。

圖6 陰道接種組小鼠接種后第56天時生殖道及胃腸道組織病理表現(xiàn)

討 論

傳統(tǒng)觀點認為Ct主要通過性接觸傳播，引起泌尿生殖道炎癥反應。小鼠模型是研究Ct泌尿生殖道感染常用的動物模型。小鼠陰道感染Ct后，病原體主要集中在下生殖道，由于炎癥病變輕微，機體免疫系統(tǒng)能夠很快將其清除，不易引起上生殖道病變［7］，不適合用于致病機制研究。鼠肺炎衣原體是一種Ct生物變種，屬于鼠衣原體屬，其基因組與Ct D血清型有超過90%同源性，基因編碼產(chǎn)物與Ct相似，并且對雌性小鼠生殖道的致病性很強，小鼠陰道感染鼠衣原體后引起的炎癥反應和后遺癥與女性生殖道感染Ct相似［8-9］，故常用來研究沙眼衣原體在人類的致病機制。本實驗用鼠衣原體接種小鼠生殖道和直接灌胃、肛門直腸接種及眶后靜脈叢接種鼠衣原體，來驗證我們的設想。

曾有實驗提示衣原體能夠感染腸道，Dlugosz等［10］用人類腸道內(nèi)分泌細胞系體外培養(yǎng)成功分離出Ct，未驗證人體腸道環(huán)境下分泌細胞中是否存在衣原體。Perry和Hughes［11］發(fā)現(xiàn)，鼠衣原體生殖道感染后14 d能夠在胃腸道檢測到衣原體，僅檢測到21 d，也未明確衣原體在胃腸道的具體分布情況及是否引起病變。本實驗用間接免疫熒光及定量PCR檢測各組小鼠胃腸道鼠衣原體活菌及基因組，發(fā)現(xiàn)鼠衣原體的確可以在胃腸道定植，并長期生存。鼠衣原體自小鼠陰道接種第7天就開始傳播至胃腸道，第14天衣原體增殖變多，第28天、49天衣原體胃腸道生長趨于平穩(wěn)，直至105天，衣原體仍能在胃腸道存活。通過直接灌胃及肛門直腸接種高低兩種劑量（相差1 000倍）的鼠衣原體后，發(fā)現(xiàn)即使降低衣原體的接種量，衣原體仍可在胃腸道長期定植，提示胃腸道是衣原體長期定植場所。同時還發(fā)現(xiàn)生殖道及直腸拭子的檢測結(jié)果與生殖道及胃腸道組織分段檢測衣原體變化趨勢相似，提示檢測陰道及肛門直腸拭子脫落細胞衣原體的活菌量能間接反應生殖道及胃腸道組織中衣原體感染情況。

衣原體是通過何種途徑從生殖道傳播到胃腸道的？本實驗小鼠均帶頸圈，能夠避免小鼠吞食污染了衣原體的分泌物，仍然在胃腸道形成持續(xù)的衣原體感染。早期的流行病學資料發(fā)現(xiàn)在某些患者的口腔、肛門直腸也檢測到沙眼衣原體，一度認為是由口腔/肛交的性行為所致［12］。最近針對南非及加拿大性病門診女性患者的兩項調(diào)查研究顯示，直腸沙眼衣原體感染的檢出率分別為7.1%［13］和10%［14］，這些研究均排除有口交及肛交的性行為，這些研究也提示衣原體從生殖道傳播到胃腸道不是經(jīng)口或者腸道污染所致。本實驗中，陰道接種感染后小鼠的肝、肺、脾等多個器官中均檢測到活的衣原體，推測可能是通過血液傳播所致。為驗證這個的猜測，我們用鼠衣原體眶后靜脈叢接種小鼠，以避免輸入性污染，鼠尾靜脈取血發(fā)現(xiàn)，在接種后的第14天仍然能夠在血中檢測到衣原體基因組，并在胃腸道檢測到衣原體活菌，之后在胃腸道長期定植，整個感染過程中，均未在生殖道中檢測到衣原體活菌，亦提示了胃腸道是衣原體長期定植的場所，這與文獻報道鼠尾靜脈接種鼠衣原體［15］的結(jié)果一致。另外，Reiter綜合征患者的關節(jié)滑膜組織中檢測到Ct DNA［16］，López-Hurtado等［17］在人體血液樣本中也檢測到Ct DNA，進一步證實衣原體能通過血液傳播。

多年來一直認為衣原體感染引起上生殖道的并發(fā)癥和后遺癥是由于衣原體生殖道持續(xù)感染所致。我們的研究顯示，鼠衣原體在生殖道的感染大約在35 d左右被完全清除，而輸卵管積水及纖維化的形成發(fā)生在56 d以后，而此時生殖道中已沒有衣原體活菌存在。Chen等［18］對多個種屬的小鼠實驗均有類似結(jié)果，生殖道衣原體感染的清除時間要明顯早于輸卵管水腫、纖維化的產(chǎn)生。有研究［3］提示，這種病理變化是由免疫病理所致，但在這樣一個長期持續(xù)的過程中，特異的、持續(xù)的免疫刺激來源一直未明，目前成為衣原體免疫病理學亟待解決的問題。

近年來多項研究顯示，腸道微生物菌群對人體健康起著重要作用，與人體有協(xié)同進化的共生關系，賦予人體與之相關的特定功能，包括營養(yǎng)代謝、黏膜屏障結(jié)構(gòu)完整性的維持、免疫調(diào)節(jié)和對抗病原體等。在微生態(tài)失調(diào)的情況下，微生物群的組成和功能發(fā)生改變，從而導致炎癥、免疫激活等病理生理過程的發(fā)生［4-5］。本研究發(fā)現(xiàn)，衣原體能夠在胃腸道長期定植，但不引起胃腸道的病理變化，在感染的后期衣原體更多存儲在下消化道，我們推測，除了衣原體與腸道其他微生物相互制約外，還可能與腸道抗菌肽及固有免疫和適應性免疫建立新的平衡有關。而這個適應性免疫是否對生殖道產(chǎn)生明顯的免疫病理反應，衣原體胃腸道的長期定植是否提供源源不斷免疫刺激，是我們進一步的研究方向。

本研究僅以C57BL/6J品系小鼠為模型，樣本量較少，可能影響結(jié)果，需擴大樣本量及研究其他品系小鼠的感染情況，從而更全面了解衣原體在機體的感染分布情況及衣原體感染的傳播途徑等，為研究衣原體對人類的致病奠定基礎。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突