馬陽陽 王平 胡文婷 徐永平 張小燕 黎釗 虞聞仲 朱蒙燕 許愛娥
1浙江中醫(yī)藥大學,杭州310009;2杭州市第三人民醫(yī)院皮膚科310009;3浙江省義烏市皮膚病醫(yī)院皮膚科322000
泛素化是一種翻譯后修飾,在細胞周期、增殖及凋亡中發(fā)揮重要作用,它將泛素與泛素-蛋白酶體系統(tǒng)結(jié)合,泛素-蛋白酶體系統(tǒng)由3種酶即泛素活化酶、泛素結(jié)合酶2(UBE2)和泛素連接酶組成[1]。作為一種泛素結(jié)合酶,UBE2S又稱E2-EPF UCP,具有高度保守的150個氨基酸核心結(jié)構(gòu),與泛素連接酶后期促進復合物(APC/C)結(jié)合,拉長靶蛋白上的泛素鏈,促使底物降解,其異常調(diào)控參與炎癥因子核因子κB與轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)、促有絲分裂生長因子和缺氧誘導因子(HIF)的信號轉(zhuǎn)導,驅(qū)動多種腫瘤細胞的增殖、遷移和轉(zhuǎn)移[2-3]。既往研究顯示,UBE2S在多種疾病中表達上調(diào),包括宮頸癌、口腔鱗狀細胞癌(OSCC)、乳腺癌及轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌等惡性腫瘤,并與腫瘤生長、G2/M期阻滯密切相關(guān)[3-4]。然而,有關(guān)UBE2S在惡性黑素瘤(MM)中的研究報道極少,其作用機制尚不清楚。我們通過檢測UBE2S在MM組織中的表達,了解其與腫瘤分期(化)的相關(guān)性,并通過研究UBE2S對MM細胞功能及侵襲性的影響,探討其對MM預后評估的價值,為篩選MM分子治療的新靶點提供理論依據(jù)。
黑素瘤細胞株(A375、MUM-2B及MUM-2C)、293T細胞及慢病毒表達載體由上海吉凱公司提供,DMEM培養(yǎng)基(美國Corning公司),胎牛血清(美國Ausbian公司),MM及正常組織芯片+標記點(西安艾麗娜生物科技有限公司,貨號ME2082c),兔抗UBE2S抗體(美國Sigma公司),辣根過氧化物酶標記的兔抗人IgG抗體(美國Sigma公司),兔抗N-鈣黏蛋白抗體(美國CST公司),鼠抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體(美國Santa-Cruz公司),Vulcan fast red chromogen kit2染色液(美國Concord公司),Trizol試劑(上海普飛生物技術(shù)有限公司),M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒及Caspase-Glo?3/7 Assay試劑盒(美國Promega公司),SYBR premix ex tap PCR試劑盒(日本TaKaRa公司),凋亡檢測試劑盒(美國eBioscience公司),碘化丙錠(美國Sigma公司),流式細胞儀(美國Millipore公司),Transwell試劑盒及侵襲檢測試劑盒(美國Corning公司),熒光顯微鏡(上海蔡康光學儀器有限公司)。
1.免疫組化檢測MM組織中UBE2S基因的表達:MM及非瘤組織芯片共208例,包括原發(fā)性MM 128例、轉(zhuǎn)移性MM 64例、非瘤組織16例(瘤旁組織及正常表皮組織各8例)。將組織芯片進行免疫組化檢測,用檸檬酸鈉緩沖液(pH6.0)在微波爐中進行抗原修復20 min,用10%血清封閉30 min;加入一抗(兔抗UBE2S抗體1∶100)孵育過夜,Tris-HCl緩沖鹽溶液(TBS)沖洗;加入二抗(兔抗人IgG抗體)孵育60 min,TBS沖洗。用Vulcan fast red chromogen kit2染色試劑按照說明書染色。染色結(jié)果判定標準:①按染色強度評分,分為0~34個等級;②按染色陽性率評分:陰性為0,1%~25%為1,26%~50%為2,51%~75%為3,76%~100%為4。按染色強度和染色陽性率乘積值分組,≤6分為抗體低表達組,>6分為抗體高表達組。
2.實時定量PCR檢測黑素瘤細胞株中UBE2S mRNA相對表達水平:使用Trizol試劑分別提取A375、MUM-2B及MUM-2C細胞株總RNA,分別取2μg樣本使用M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒按照標準流程將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,使用SYBR premix ex tap PCR試劑盒按說明書擴增目的基因。由上海吉凱基因化學技術(shù)有限公司設(shè)計和合成引物。UBE2S正向引物5′-GTGCTCAAGAGGGACTGGACG-3′,反向引物5′-GCAGACTCGGGGTTAGGGTG-3′,片段大小為92 bp。GAPDH正向引物5′-TGACTTCAAC AGCGACACCCA-3′,反向引物5′-CACCCTGTTGTA GCCAAA-3′,片段大小為121 bp。采用兩步法反應(yīng),條件為95℃30 s;95℃5 s,60℃30 s,共40個循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)參照基因,以2-△△Ct表示UBE2S相對表達水平,其中△Ct=目的基因Ct值-GAPDH基因Ct值,△△Ct=各樣品△Ct值-對照組△Ct值。
3.UBE2S基因shRNA慢病毒感染A375及MUM-2B細胞:用病毒包裝輔助質(zhì)粒(上海吉凱公司)與攜帶目標序列miRNA的GV115質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染293T細胞,48 h后收集細胞培養(yǎng)上清液進行慢病毒的濃縮與純化。將A375及MUM-2B細胞分別分為兩組,干擾組使用含有UBE2S RNA干擾序列(5′-ACATCATCCGCCTGGTGTA-3′)的慢病毒轉(zhuǎn)染,對照組使用含有對照序列(5′-TTCTCCGAACGT GTCACGT-3′)的慢病毒轉(zhuǎn)染,72 h后,熒光顯微鏡檢測綠色熒光蛋白的表達情況,熒光率達70%~80%時收集細胞,實時定量PCR檢測UBE2S mRNA相對表達水平,方法同前。
4.各組細胞中caspase3/7的表達檢測:將經(jīng)過上述處理的A375及MUM-2B細胞計數(shù)并按照1×104細胞/孔加入96孔板中。使用Caspase-Glo?3/7 Assay試劑盒按照說明書檢測細胞中caspase3/7的表達。
5.流式細胞儀檢測細胞凋亡與周期情況:將經(jīng)過上述處理的A375、MUM-2B細胞在6孔板中傳代培養(yǎng)至覆蓋率為80%,胰酶消化,1 300 r/min(離心半徑為20 cm)離心5 min后,向部分細胞中加入10μl膜聯(lián)蛋白V-別藻藍蛋白在室溫下染色15 min,另一部分加入0.7 ml碘化丙錠染色液使上機時細胞通過率為300~800個/s,采用流式細胞儀檢測細胞凋亡與周期情況。
6.Transwell法分析細胞遷移及侵襲能力:將干擾組與對照組A375細胞按8×104/孔接種,分別取細胞懸浮液100μl加入Transwell小室上室,下室加600μl 30%胎牛血清培養(yǎng)基。37℃培養(yǎng)16 h后使用Giemsa染色液染色轉(zhuǎn)移細胞2~3 min后觀察并拍照。每個Transwell小室隨機選取3個200×視野進行細胞計數(shù)。
取侵襲試劑盒上室鋪Matrigel基質(zhì)加入細胞懸浮液500μl,下室加750μl 30%胎牛血清培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng)16 h后染色3~5 min,每個小室隨機選取3個200×視野進行細胞計數(shù)。
7.Western印跡法檢測N-鈣黏蛋白的表達:取干擾組與對照組A375細胞用PBS洗滌,冰上裂解10~15 min后超聲破碎細胞,取上清液用BCA法測定蛋白濃度,經(jīng)濃度標化后進行Western印跡檢測。取20μg總蛋白,經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后,將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上室溫下封閉1 h。加入一抗兔抗N-鈣黏蛋白(1∶500),以鼠抗GAPDH(1∶2 000)為內(nèi)參照,室溫孵育1 h,用TBST洗滌聚偏二氟乙烯膜后加入對應(yīng)的N-鈣黏蛋白標記的兔抗人IgG二抗(1∶2 000)室溫孵育2 h。洗膜后采用Pierce?ECL Western Blotting Substrate試劑盒(美國Thermo公司)進行X光顯影,并按說明書要求進行X線膠片處理。
8.統(tǒng)計學分析:所有實驗重復3次以上。使用SPSS 22.0軟件分析。符合正態(tài)分布的計量資料用±s表示,組間比較采用獨立樣本t檢驗,計數(shù)資料采用卡方檢驗。非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用Mann-WhitneyU檢驗。用Spearman秩相關(guān)系數(shù)評估UBE2S表達與腫瘤分期的相關(guān)性。P<0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。
免疫組化檢測顯示,UBE2S在MM及非瘤組織細胞的細胞質(zhì)中均有表達。192例MM組織中,98例(51.0%)高表達UBE2S;16例非瘤組織中未見高表達,高表達率差異有統(tǒng)計學意義(χ2=11.905,P<0.01)。UBE2S在不同T分期的瘤組織中表達水平差異有統(tǒng)計學意義(χ2=4.110,P=0.044)。Spearman秩相關(guān)分析提示該基因在瘤組織中的表達水平與患者的T分期呈負相關(guān)(斯皮爾曼相關(guān)系數(shù)ρ=-0.210,P=0.043)。見表1、圖1。
表1 泛素結(jié)合酶2S(UBE2S)在惡性黑素瘤組織中的表達水平與臨床資料的相關(guān)性分析(例)
A375、MUM-2B、MUM-2C細 胞 內(nèi)UBE2S mRNA相對表達量分別為5.96±0.12、8.91±0.06、5.25±0.15,表達豐度都較高,不同細胞之間UBE2S mRNA表達差異有統(tǒng)計學意義(F=817.228,P<0.01),以MUM-2B細胞株表達量最高,其后依次為A375、MUM-2C細胞株,選擇A375及MUM-2B細胞株進行shRNA慢病毒感染。
將shRNA轉(zhuǎn)染的4組細胞培養(yǎng)72 h后,隨機選5個視野計算轉(zhuǎn)染效率在80%以上,細胞狀態(tài)正常。實時定量PCR檢測顯示,干擾組及對照組A375細胞UBE2S mRNA相對表達量分別為0.312±0.005、1.001±0.042,兩組間差異有統(tǒng)計學意義(t=-28.052,P=0.001);干擾組及對照組MUM-2B細胞UBE2S mRNA相對表達量分別為0.548±0.083、1.002±0.072,兩組間差異亦有統(tǒng)計學意義(t=-7.188,P=0.002)。
感染3 d后,干擾組與對照組A375細胞caspase3/7活性分別為14 522.7±138.25與7 351.7±693.18,干擾組顯著高于對照組(t=17.572,P<0.01);干擾組較對照組MUM-2B細胞caspase3/7活性亦明顯增加(分別為17 276.3±178.959、12 442.3±290.294,t=24.552,P<0.01)。與對照組A375及MUM-2B細胞相比,干擾組A375及MUM-2B細胞凋亡率顯著增加(均P<0.01)。與對照組A375細胞相比,干擾組細胞G1期細胞比例明顯增多(P<0.01),而S期細胞明顯減少(P<0.01),G2/M期細胞無明顯變化(P>0.05).與對照組MUM-2B相比,干擾組MUM-2B細胞G1期(P<0.01)、G2/M期(P<0.01)比例明顯增多,S期細胞比例明顯減少(P<0.01)。見圖2、表2。
圖3 敲減泛素結(jié)合酶2S基因?qū)375細胞遷移、侵襲的影響(×200)
表2 敲減泛素結(jié)合酶2S基因?qū)375細胞及MUM-2B細胞凋亡率與周期分布的影響(%,±s)
表2 敲減泛素結(jié)合酶2S基因?qū)375細胞及MUM-2B細胞凋亡率與周期分布的影響(%,±s)
注:n=3
組別A375細胞對照組干擾組t A375值P A375值MUM-2B細胞對照組干擾組t MUM-2B值P MUM-2B值凋亡率G1期S期G2/M期4.58±0.15 8.26±0.18 27.236 0.001 59.85±1.48 67.21±0.90 7.365 0.002 31.75±0.67 24.66±1.34-9.190 0.001 8.40±1.99 8.13±0.61-0.227 0.831 4.40±0.13 7.07±0.13 25.374 0.001 36.55±0.19 38.70±0.22 12.676 0.001 45.42±0.55 37.23±0.72-15.718 0.001 18.03±0.58 24.08±0.56 13.045 0.001
見圖3。Transwell實驗顯示,對照組和干擾組A375細胞每200×視野轉(zhuǎn)移細胞數(shù)分別為260±9.3、51±3.7,干擾組A375細胞遷移能力顯著降低(t=-35.727,P<0.05)。侵襲小室實驗顯示,對照組和干擾組A375細胞透過Matrigel基質(zhì)的細胞數(shù)分別為109±0.8、26±0.7,干擾組細胞侵襲能力顯著降低(t=-125.000,P<0.01)。Western印跡檢測顯示,A375細胞敲減UBE2S基因后,N-鈣黏蛋白表達下調(diào)(圖4)。
圖4 敲減泛素結(jié)合酶2S對A375細胞N-鈣黏蛋白表達的影響
與普通免疫組化切片相比,組織芯片技術(shù)可以大規(guī)模、高通量、標準化地在基因組、轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組水平進行研究,在腫瘤相關(guān)基因研究中發(fā)揮重要作用[5]。我們使用MM及非瘤組織芯片進行免疫組化檢測,并且結(jié)合臨床資料進行判讀。本研究表明,UBE2S在MM組織中明顯高表達,而瘤旁組織及正常對照組織低表達,提示UBE2S可能與MM的惡性生物學行為有關(guān),可作為MM的免疫標志之一。UBE2S在OSCC中的表達水平與腫瘤分期呈正相關(guān)[4]。本研究顯示,UBE2S在T1/T2/T3期MM中呈高表達,而T4期表達水平卻明顯下降,提示黑素瘤細胞可能具有不同于其他惡性腫瘤的細胞分化特征,也反映了MM顯著的異質(zhì)性。
本研究結(jié)果顯示,UBE2S在A375、MUM-2B、MUM-2C細胞中表達豐度都為高,以MUM-2B表達量最高,其次為A375、MUM-2C。而且,敲減UBE2S基因后,黑素瘤細胞凋亡水平明顯增高,細胞遷移及侵襲能力顯著降低,證實UBE2S對MM細胞生物學功能的影響。UBE2S過表達被報道與OSCC[4]、腎癌[6]及食管癌[7]的細胞增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移能力上調(diào)有關(guān),但敲減UBE2S基因?qū)m頸癌及乳腺癌細胞增殖無明顯影響[8-9]。Yoshimura等[4]報道敲減OSCC細胞UBE2S基因,可通過促進P21降解抑制G2/M期細胞增殖。而Tedesco等[9]報道在乳腺腫瘤中,UBE2S常與細胞周期G2/M期的基因共同表達。本研究顯示,敲減UBE2S基因的黑素瘤細胞阻滯于G1/S期,進一步表明UBE2S在不同來源腫瘤中的功能差異。
UBE2S參與Von Hippel-Lindau泛素(VHL)的蛋白酶體降解,VHL介導HIF1α的泛素化降解,HIF刺激原癌發(fā)生和促分裂生長因子相關(guān)基因表達[10]。UBE2S與HIF1α在胰腺癌、黏液性結(jié)腸癌、乳腺癌中過度表達,而VHL表達下調(diào)[9-10]。UBE2S在轉(zhuǎn)移性皮膚癌CAKI細胞和人黑素瘤C8161細胞中表達上調(diào),通過HIF1α和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)VHL降解,促進細胞增殖[10]。研究發(fā)現(xiàn),UBE2S可能通過調(diào)節(jié)VHL/HIF1α—TGF-β1通路來誘導上皮細胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)過程[7,11]。EMT是一種由上皮向間充質(zhì)細胞型轉(zhuǎn)變的生物學過程,是腫瘤侵襲過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié),該過程降低腫瘤轉(zhuǎn)移中細胞黏附并促進細胞脫落[12-13]。在此過程中,黏附分子N-鈣黏蛋白表達上調(diào),上皮細胞失去極性,形成有利于惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的遷移、侵襲和抗凋亡特性[13]。本研究顯示,敲減UBE2S基因后,A375細胞中N-鈣黏蛋白表達下調(diào),提示UBE2S可能通過調(diào)控EMT過程中的N-鈣黏蛋白促進MM細胞轉(zhuǎn)移。
綜上所述,我們發(fā)現(xiàn),UBE2S在MM組織中高表達且與患者腫瘤分期呈負相關(guān),敲減UBE2S基因后MM細胞遷移、侵襲和EMT過程受到抑制,細胞凋亡率增高,細胞周期阻滯于G1/S期,提示UBE2S可能作為關(guān)鍵驅(qū)動基因影響MM的發(fā)展和預后,為篩選MM分子治療的靶點提供了部分理論基礎(chǔ),但具體機制和應(yīng)用價值尚需進一步研究。
利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突