雷文波 何蓓 聶倩 文雅婷 趙鈺琦 李忠玉

南華大學(xué)衡陽醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)研究所 特殊病原體防控湖南省重點實驗室，湖南衡陽421001

沙眼衣原體（Ct）是一種嚴(yán)格細(xì)胞內(nèi)寄生的原核細(xì)胞型微生物，抑制宿主細(xì)胞凋亡是Ct完成細(xì)胞內(nèi)生長發(fā)育的必要條件［1-2］。線粒體是細(xì)胞凋亡調(diào)控的活動中心，Bcl-2蛋白家族在線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。Ct通過多種機(jī)制調(diào)控Bcl-2蛋白家族的表達(dá)進(jìn)而調(diào)節(jié)線粒體功能抑制宿主細(xì)胞凋亡［3-5］：Sharma等［3］研究發(fā)現(xiàn)，缺氧誘導(dǎo)因子1α通過上調(diào)Bcl-2抗凋亡家族蛋白Mcl-1抑制Ct感染的細(xì)胞凋亡；Rajalingam等［4］發(fā)現(xiàn)Ct通過激活Raf/MEK/ERK和PI3K/AKT信號通路，穩(wěn)定和上調(diào)Mcl-1蛋白表達(dá)水平，從而保護(hù)Ct感染的細(xì)胞免受凋亡刺激因子引起的凋亡。

pORF5是Ct質(zhì)粒編碼的一種分泌性蛋白［6］，本課題組前期研究證實，pORF5能促進(jìn)宿主細(xì)胞高遷移率族蛋白1（HMGB1）表達(dá)上調(diào)［7］，HMGB1是一種高度保守的核內(nèi)非組蛋白，在調(diào)控細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用［8-9］。為探討pORF5質(zhì)粒促進(jìn)HMGB1表達(dá)對細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制，我們用pORF5質(zhì)粒蛋白刺激HMGB1 shRNA干擾的HeLa細(xì)胞，通過對線粒體膜電位、細(xì)胞色素c（Cyt c）的釋放以及Bcl-2、Bax、胱天蛋白酶3（caspase-3）等凋亡相關(guān)分子的檢測，綜合分析pORF5質(zhì)粒蛋白抗凋亡的分子機(jī)制，為Ct感染性疾病的防治提供實驗依據(jù)。

材料與方法

一、主要實驗試劑與細(xì)胞

兔抗Bcl-2、Bax和caspase-3多克隆抗體產(chǎn)自美國Cell Signaling Technology公司；兔抗Cyt c多克隆抗體產(chǎn)自美國Abcam公司；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體、Cy3標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔抗體產(chǎn)自美國Proteintech公司；JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒來自上海碧云天公司；凋亡誘導(dǎo)劑碳酰氰基-對-氯苯腙（CCCP）為美國Sigma公司產(chǎn)品；HeLa細(xì)胞株、HMGB1干擾的HeLa細(xì)胞（shHMGB1-HeLa）和對照RNA干擾的HeLa細(xì)胞（對照RNA-HeLa）為本研究所保存［10］。

二、細(xì)胞培養(yǎng)與分組

用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在37℃、5%CO2的環(huán)境中培養(yǎng)HeLa細(xì)胞。當(dāng)HeLa細(xì)胞處于對數(shù)生長期時，將其分成2組，一組用10μmol/L CCCP處理30 min作為對照組，另一組為pORF5與CCCP共處理組，即用10 mg/L pORF5蛋白（本課題組通過原核表達(dá)制備保存）刺激18 h后，再用10μmol/L CCCP處理30 min。為了分析HMGB1是否參與pORF5質(zhì)粒蛋白的抗凋亡作用，部分實驗中用pORF5質(zhì)粒蛋白和CCCP共刺激shHMGB1-HeLa和對照RNA-HeLa細(xì)胞，刺激方法同上。

三、間接免疫熒光檢測Cyt c釋放情況

取生長狀態(tài)良好的HeLa細(xì)胞、shHMGB1-HeLa細(xì)胞和對照RNA-HeLa細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化后制成細(xì)胞懸液，將細(xì)胞密度調(diào)整為5×105個/ml后接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，過夜培養(yǎng)，待生長至融合度約80%時，按照上述分組方法處理細(xì)胞后，去除細(xì)胞培養(yǎng)基，PBS洗滌細(xì)胞，依次經(jīng)4%多聚甲醛固定30 min、0.5%Triton X-100透膜10 min、血清封閉30 min，再加入1∶1 000稀釋的兔抗Cyt c抗體孵育2 h后，加入Cy3標(biāo)記的羊抗兔熒光二抗孵育2 h，加入4′，6-二脒基-2-苯基吲哚染色1 h，封片后熒光顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)Cyt c的分布情況。

四、JC-1熒光染色檢測線粒體膜電位

用PBS洗滌經(jīng)CCCP單獨(dú)或與pORF5共處理的HeLa細(xì)胞、shHMGB1-HeLa細(xì)胞和對照RNAHeLa細(xì)胞后，加入1 ml JC-1染色工作液，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃避光孵育20 min，用JC-1染色緩沖液洗滌3次，熒光顯微鏡觀察結(jié)果，根據(jù)紅色與綠色熒光強(qiáng)度比率來判斷線粒體膜電位變化。

五、Western印跡檢測凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

收集經(jīng)上述處理的HeLa細(xì)胞、shHMGB1-HeLa細(xì)胞、對照RNA-HeLa細(xì)胞并用RIPA裂解液裂解細(xì)胞，離心收集蛋白，BCA法測定蛋白濃度。取30μg蛋白加入上樣緩沖液，混合均勻后煮沸5 min，將樣本經(jīng)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分析后轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上，5%脫脂牛奶封閉2 h，分別以兔抗Bcl-2、Bax和caspase-3抗體作為一抗，辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔抗體作為二抗進(jìn)行Western印跡檢測，用ECL試劑顯影，以目的蛋白與GAPDH蛋白的灰度值之比表示蛋白表達(dá)水平。

六、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、pORF5質(zhì)粒蛋白拮抗CCCP誘導(dǎo)的線粒體膜電位下降

見圖1。CCCP處理后HeLa細(xì)胞線粒體膜電位較低，紅/綠熒光強(qiáng)度比率為0.4±0.1；而CCCP與pORF5質(zhì)粒蛋白共處理后，線粒體維持較高的膜電位，細(xì)胞主要發(fā)出紅色熒光，紅/綠熒光強(qiáng)度比率為1.7±0.3，顯著高于對照組（t=6.95，P＜0.01）。

圖1 JC-1熒光探針分析pORF5對HeLa細(xì)胞線粒體膜電位的影響

二、pORF5質(zhì)粒蛋白對凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與對照組比較，共處理組HeLa細(xì)胞Bcl-2蛋白的表達(dá)水平增加（5.3±0.6）倍（t=8.62，P＜0.01），Bax平均表達(dá)水平降低79%±10%（t=9.23，P＜0.01），caspase-3活化片段P17平均含量減少75%±8%（t=4.26，P＜0.05）。見圖2。

三、間接免疫熒光法檢測Cyt c釋放情況

對照組HeLa細(xì)胞胞質(zhì)Cyt c呈均勻彌散紅色熒光，而pORF5質(zhì)粒蛋白處理組Cyt c呈點狀分布（圖3）。

四、pORF5質(zhì)粒蛋白通過上調(diào)HMGB1的表達(dá)抑制細(xì)胞凋亡

經(jīng)pORF5質(zhì)粒蛋白和CCCP共處理后，JC-1熒光探針檢測顯示，對照RNA-HeLa細(xì)胞存在大量紅色熒光，紅/綠熒光強(qiáng)度比率為1.2±0.2；而shHMGB1-HeLa細(xì)胞表現(xiàn)出去極化的線粒體膜電位，紅色熒光信號明顯減少，綠色熒光信號增強(qiáng)，紅/綠熒光強(qiáng)度比率為0.3±0.1，顯著低于對照RNAHeLa細(xì)胞（t=11.23，P＜0.01）。見圖4。

圖4 JC-1熒光探針分析HMGB1對shHMGB1-HeLa和對照RNA-HeLa細(xì)胞線粒體膜電位的影響

Western印跡結(jié)果顯示，shHMGB1-HeLa細(xì)胞中Bax平均表達(dá)水平較對照RNA-HeLa細(xì)胞增加（1.2±0.2）倍（t=13.06，P＜0.01），Bcl-2平均表達(dá)水平較對照RNA-HeLa細(xì)胞降低56%±7%（t=7.19，P＜0.05）（圖5）。間接免疫熒光法顯示，與對照RNA-HeLa細(xì)胞比較，shHMGB1-HeLa細(xì)胞中Cyt c從線粒體釋放量增加，見圖6。

討 論

Ct的生長繁殖需要宿主細(xì)胞提供生存環(huán)境及營養(yǎng)物質(zhì)，為順利完成在細(xì)胞內(nèi)的發(fā)育周期，Ct通過多種機(jī)制調(diào)控宿主細(xì)胞［1-5］。線粒體膜電位變化是細(xì)胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)過程中最早發(fā)生的事件，也是細(xì)胞凋亡發(fā)生的一個重要步驟。Ct pORF5具有抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)炎癥反應(yīng)等多方面功能［11-13］。為進(jìn)一步分析pORF5抗凋亡分子機(jī)制，我們用pORF5蛋白和凋亡誘導(dǎo)劑CCCP聯(lián)合處理細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)pORF5能拮抗CCCP誘導(dǎo)的線粒體膜電位下降，初步證實pORF5可通過保護(hù)線粒體功能抵抗凋亡誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

圖5 HMGB1對shHMGB1-HeLa和對照RNA-HeLa細(xì)胞Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響

圖6 間接免疫熒光技術(shù)檢測HMGB1對HeLa細(xì)胞細(xì)胞色素c（Cyt c）釋放的影響

Bcl-2家族蛋白可通過調(diào)控線粒體結(jié)構(gòu)與功能的穩(wěn)定性調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。當(dāng)細(xì)胞受到凋亡誘導(dǎo)因子刺激后，促凋亡蛋白Bax和Bak被激活，并在線粒體外膜上發(fā)生寡聚化，Bax/Bak復(fù)合體與線粒體上的電壓依賴性離子通道相互作用，致線粒體通透性增加，促進(jìn)Cyt c從線粒體上釋放，釋放的Cyt c激活caspase-3，使無活性的caspase-3前體裂解為有活性的P17和P15兩個亞單位，從而啟動細(xì)胞凋亡，但抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xL可阻斷Bax/Bak激活的通道抑制細(xì)胞凋亡［14］。本實驗顯示，pORF5能降低Bax和活化caspase-3的表達(dá)，促進(jìn)Bcl-2蛋白的表達(dá)，并能顯著抑制Cyt c釋放。提示pORF5質(zhì)粒蛋白通過上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2、下調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，抑制線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑從而發(fā)揮抗凋亡作用。

HMGB1是一種DNA結(jié)合蛋白，具有調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄，參與DNA重組修復(fù)和復(fù)制等作用［15-16］；在細(xì)胞損傷和炎癥反應(yīng)時，HMGB1可分泌到細(xì)胞外，介導(dǎo)炎癥和細(xì)胞增殖、凋亡抑制等多種生物學(xué)功能［8-9，17］。前期研究發(fā)現(xiàn)，pORF5質(zhì)粒蛋白能上調(diào)宿主細(xì)胞HMGB1的表達(dá)［7］，本研究中我們用RNA干擾技術(shù)干擾HMGB1表達(dá)后，HeLa細(xì)胞線粒體膜電位顯著降低，細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax的表達(dá)水平增加，而抑制細(xì)胞凋亡的Bcl-2表達(dá)水平降低，Cytc從線粒體釋放量增加，提示HMGB1在pORF5質(zhì)粒蛋白抗凋亡作用過程中發(fā)揮重要作用。

綜上，我們通過pORF5質(zhì)粒蛋白體外刺激HeLa細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)pORF5可調(diào)控Bcl-2和Bax等凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，并抵抗CCCP誘導(dǎo)的線粒體膜電位下降和Cyt c釋放，初步證實pORF5可抵抗線粒體途徑介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡；并發(fā)現(xiàn)HMGB1敲低能顯著抑制pORF5質(zhì)粒蛋白抗凋亡能力，證實pORF5通過HMGB1調(diào)控宿主細(xì)胞凋亡。促進(jìn)HMGB1表達(dá)進(jìn)而調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞死亡信號通路可能是有助于Ct建立對自身生長發(fā)育有利環(huán)境的一個重要生物學(xué)事件。本研究可豐富Ct抗凋亡分子機(jī)制，為Ct感染性疾病的預(yù)防和治療提供實驗依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突