宋志強,朱臻宇，劉 悅，柴逸峰

(海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院,上海 200433)

白血病是造血干細(xì)胞在各個分化階段由于分化阻滯、凋亡障礙并克隆增生引起的血液系統(tǒng)惡性腫瘤性疾病，根據(jù)白血病細(xì)胞類型和成熟程度，可將白血病分為4種類型：急性髓細(xì)胞性白血病(acute myeloid leukemia，AML)、慢性髓細(xì)胞性白血病(chronic myeloid leukemia，CML)、急性淋巴性白血病(acute lymphoid leukemia，ALL)和慢性淋巴性白血病(chronic lymphoid leukemia，CLL)[1]。在中國，白血病發(fā)病率為3/10萬～4/10萬，是兒童中最常見的惡性腫瘤，約占所有惡性腫瘤的30%[2]。致死率在惡性腫瘤中分別排第6位(男性)和第8位(女性)，在兒童中則位于首位。

目前，白血病的診斷主要依賴于血液和骨髓檢測，以獲得白血病的形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)和細(xì)胞遺傳學(xué)信息。然而，在白血病早期和緩解期，簡單的血液檢查并不能發(fā)現(xiàn)白血病。所以，白血病的早期診斷主要依靠骨髓穿刺獲得細(xì)胞形態(tài)學(xué)和免疫表型等信息[3]。但這一侵入性的檢查方式給患者(特別是兒童)帶來了極大的身體創(chuàng)傷和心理創(chuàng)傷。同時，由于白血病的隱匿性、非特異性和復(fù)雜性[4]，許多白血病患者并沒有得到早期診斷，以致錯過了早期治療的時機。因此，有必要尋找潛在的生物標(biāo)志物用于白血病的早期預(yù)警和診斷。近年來，隨著白血病化療效果的提升，白血病患者的5年生存率達(dá)到了54%，1～4歲兒童ALL患者的生存率更是高達(dá)95%[5-6]。但是，停止治療后，約有20%的患者復(fù)發(fā)[7]，耐藥是其中的一個重要原因。因此，一方面，需要探索耐藥機制，克服耐藥難題，另一方面，應(yīng)當(dāng)開發(fā)新藥并研究藥效機制。雖然目前已有許多關(guān)于白血病危險因素的研究[8-9]，但其發(fā)病機制尚不完全清楚，因此需要運用新的方法加以探索。

內(nèi)源性小分子代謝物可以很好地反映機體的代謝狀況，已被廣泛用于多種疾病的發(fā)病機制、診斷方法和藥效機制研究[10-11]。白血病患者由于代謝重編程，其內(nèi)源性小分子代謝物也會發(fā)生變化，因此，可以通過檢測內(nèi)源性小分子代謝物的變化探索白血病的發(fā)病機制、診斷方法和藥效機制，這無疑為白血病研究提供了一個新的視角。

代謝組學(xué)是繼基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)后,于20世紀(jì)90年代中期興起的一門學(xué)科，其通過探究機體在生理或病理情況下產(chǎn)生的差異性內(nèi)源小分子代謝物研究不同疾病的發(fā)病機制和規(guī)律，并依此提供疾病治療的新策略[12]。代謝組學(xué)研究的對象是相對分子質(zhì)量<1 000的內(nèi)源性代謝物，通過對它們實時動態(tài)的定性或定量分析，可以從整體角度更直觀地了解機體的功能變化，并與臨床癥狀相聯(lián)系[13]。總之，代謝組學(xué)能夠?qū)⒏咄俊⒏叻直媛实姆治黾夹g(shù)與生物信息學(xué)相整合[14]，高效、全面、無差別地尋找內(nèi)源性小分子代謝物。本文主要綜述代謝組學(xué)在白血病發(fā)病機制、診斷方法和藥效機制中的研究進(jìn)展。

1 代謝組學(xué)

根據(jù)分析目的不同，代謝組學(xué)可分為靶向代謝組學(xué)[15]、非靶向代謝組學(xué)[16]和偽靶向代謝組學(xué)[17]。靶向代謝組學(xué)用于發(fā)現(xiàn)特定的代謝物，非靶向代謝組學(xué)用于盡可能多地發(fā)現(xiàn)代謝物，偽靶向代謝組學(xué)則結(jié)合了兩者的優(yōu)點，擁有更好的重復(fù)性和更大的線性范圍。目前，代謝組學(xué)廣泛使用的分析方法有質(zhì)譜(MS)與核磁共振技術(shù)(NMR)[18]。同時，MS常與氣相色譜(GC)[19]、液相色譜(LC)[20]、毛細(xì)管電泳(CE)[21]等技術(shù)聯(lián)用。幾種技術(shù)之間各有優(yōu)勢和適用范圍。MS擁有高靈敏度、高特異度和高選擇性的特點，但同時有樣品處理過程復(fù)雜、受基質(zhì)效應(yīng)和離子化程度的影響等不足。NMR能夠?qū)悠穼崿F(xiàn)無創(chuàng)、無偏向的檢測且樣品前處理簡單，但靈敏度和特異性低，常需要大樣本量分析。而色譜和電泳技術(shù)雖然定性能力不足，卻具有高通量和高分離度的特點[22]。為了實現(xiàn)代謝組學(xué)全面、高效、高通量的優(yōu)勢，常將多種技術(shù)進(jìn)行聯(lián)用，這也是今后代謝組學(xué)發(fā)展的重要趨勢。通過分析技術(shù)獲得代謝物數(shù)據(jù)信息后，需要對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，通常使用單變量和多變量的統(tǒng)計分析方法獲得差異代謝物。單變量分析方法常用的有參數(shù)檢驗與非參數(shù)檢驗，多變量分析包含主成分分析(PCA)、偏最小二乘法(PLS-DA)與正交偏最小二乘法(OPLS-DA)。其中，PCA又稱為非監(jiān)督學(xué)習(xí)方法，PLS-DA與OPLS-DA被稱為監(jiān)督學(xué)習(xí)方法。運用這些分析方法，可以很好地對代謝輪廓進(jìn)行分析。近年來，本課題組利用代謝組學(xué)對疾病進(jìn)行研究已經(jīng)取得了一些研究成果。Liu等[23]運用GC/MS與LC/MS探究藍(lán)萼甲素對肝癌細(xì)胞的作用機制，發(fā)現(xiàn)用藍(lán)萼甲素治療后，癌細(xì)胞的葡萄糖、脯氨酸、乳酸鹽等內(nèi)源性小分子代謝物發(fā)生變化，藍(lán)萼甲素可能通過嘌呤、嘧啶、鞘脂和氨基酸代謝發(fā)生藥效作用。Wu等[24]利用 UHPLC-QTOF/MS對嚴(yán)重尿毒癥皮膚瘙癢和輕微尿毒癥皮膚瘙癢患者的血清進(jìn)行了代謝組學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)差異主要是溶血性磷脂酰膽堿、苯乙酸、亞?；撬岬葍?nèi)源性小分子代謝物，主要涉及磷脂代謝等代謝通路，說明磷脂代謝在尿毒癥皮膚瘙癢中具有重要的調(diào)節(jié)作用。

2 內(nèi)源性小分子代謝物在白血病發(fā)病機制中的研究

Mayer等[25]用蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)探究衰老導(dǎo)致慢性B淋巴細(xì)胞性白血病(B-CLL)的分子機制。通過年輕人、老年人的正常B淋巴細(xì)胞與B-CLL細(xì)胞的對比發(fā)現(xiàn)，衰老可以使細(xì)胞的活性氧含量顯著增高，而與線粒體氧化應(yīng)激相關(guān)的蛋白含量也明顯提高。與正常B淋巴細(xì)胞相比，B-CLL的谷氨酰胺消耗增加，脂肪酸的β氧化增強。為了驗證以上發(fā)現(xiàn)，Mayer等進(jìn)一步運用LC-MS對4例老年B-CLL患者和5例健康志愿者的B淋巴細(xì)胞進(jìn)行靶向代謝組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)谷氨酸和谷氨酰胺含量降低，谷氨酰胺的分解代謝物丙氨酸含量增高，這證明B-CLL細(xì)胞谷氨酰胺分解增強，與上述研究相一致。同時，在癌細(xì)胞中，谷氨酰胺分解與蛋白質(zhì)、脂肪酸合成及活性氧產(chǎn)生有關(guān)[26]。這些與谷氨酰胺相關(guān)的內(nèi)源小分子代謝物變化說明衰老導(dǎo)致的線粒體氧化應(yīng)激和代謝重編程與B-CLL的發(fā)生密切相關(guān)。

Agathocleous等[27]運用LC-MS對小鼠骨髓來源的CD150+CD48-LSK造血干細(xì)胞(HSCs)、CD150-CD48-LSK多功能祖細(xì)胞(MPPs)與多種功能受限的造血祖細(xì)胞進(jìn)行代謝組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)維生素C含量在功能受限的造血祖細(xì)胞中降低，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)維生素C水平降低加速了白血病的發(fā)生，而維生素C在造血干細(xì)胞的累積則可抑制白血病的發(fā)生。這說明內(nèi)源性小分子代謝物維生素C在白血病的發(fā)生中具有重要作用。

3 內(nèi)源性小分子代謝物在白血病早期診斷中的研究

癌細(xì)胞的生長需要大量葡萄糖提供能量，而且即使在氧供充足的情況下依然選擇糖酵解的方式供能，被稱為Warburg效應(yīng)[28]。一方面，白血病細(xì)胞可以通過增強糖酵解促進(jìn)其他生物大分子的合成[29]；另一方面，糖酵解產(chǎn)生的能量遠(yuǎn)低于糖的有氧氧化，所以白血病細(xì)胞需要通過增強糖異生滿足對糖的需求。在代謝應(yīng)激的情況下，白血病細(xì)胞發(fā)生代謝的重編程，從而導(dǎo)致代謝物種類或含量的改變，因此，用代謝組學(xué)分析小分子代謝物的變化有利于白血病的早期診斷。

Musharraf等[30]將氣相色譜與三重四極桿質(zhì)譜技術(shù)(GC-QQQ-MS)聯(lián)用，對72例ALL患者、64例AML患者、50例再生障礙性貧血(APA)患者和76例健康志愿者血清進(jìn)行了代謝組學(xué)分析。運用方差分析(ANOVA)從檢測到的1425個代謝物中發(fā)現(xiàn)了27種顯著差異代謝物(與健康組相比，P≤0.001且變化倍數(shù)>3)，白血病患者的軟脂酸、硬脂酸等代謝物含量下降，花生酸、油酸等代謝物含量升高，并運用PLS-DA 建立了一個基于這27種代謝物的APA、 ALL、AML與健康患者的區(qū)分模型，模型的敏感度和特異性分別是91.42% 與90.76%。說明這些脂肪酸代謝中的內(nèi)源性小分子代謝物可以很好地用于急性白血病的早期診斷。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，ALL組與其他3組的代謝物差異最大，而APA與AML組的差異最小，這從另一個角度說明APA可以發(fā)展為AML[31]。

Yang等[32]應(yīng)用氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC-MS)對26例新發(fā)CML患者，26例經(jīng)酪氨酸激酶抑制劑(TKI)治療好轉(zhuǎn)的CML患者和26例健康志愿者的血清進(jìn)行了代謝組學(xué)研究。經(jīng)過t檢驗和PLS-DA等方法發(fā)現(xiàn)代謝特征并成功發(fā)現(xiàn)了6種CML患者與健康志愿者之間的顯著差異物，分別是CML血清中降低的肉豆蔻酸、甘油，升高的肌醇、半乳糖、乳酸、甘氨酸(VIP>1，P<0.05，AUC>0.7)。并且這些差異代謝物在經(jīng)TKI治療后均有所回調(diào)。PLS-DA預(yù)測模型的可解釋性(R2X=30.3%,R2Y=86.1%)與可預(yù)測性(Q2=0.748)說明了該模型的可靠性。它們之間的代謝差異主要發(fā)生在半乳糖代謝、丙酮酸代謝、甘油酯代謝、甘氨酸/絲氨酸/蘇氨酸代謝中。這6種內(nèi)源性小分子代謝物可以作為CML早期診斷的生物標(biāo)志物。

Chen等[33]應(yīng)用氣相色譜-飛行時間質(zhì)譜(GC-TOF-MS)對400例新發(fā)AML患者和446例健康志愿者的血清進(jìn)行了代謝組學(xué)研究，經(jīng)過Wilcoxon秩和檢驗和OPLS-DA等模式識別方法研究發(fā)現(xiàn)，與健康志愿者相比，AML患者的血清中3-磷酸甘油、乳酸、檸檬酸含量降低，丙酮酸、2-氧化戊二酸和2-羥戊二酸水平升高。Chen等進(jìn)一步用這6個代謝標(biāo)志物構(gòu)建了AML的預(yù)后風(fēng)險評估(PRS)體系，PRS評分低的白血病患者生存率低。通過比較PRS評分低與PRS評分高的白血病患者AML原始細(xì)胞的基因表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)在PRS評分低的患者中糖酵解與三羧酸循環(huán)的基因表達(dá)水平顯著增加。同時，體外實驗結(jié)果表明糖酵解增強會降低白血病細(xì)胞對抗白血病藥物阿糖胞苷的敏感性，而抑制糖酵解則可以抑制AML的細(xì)胞增殖并增強阿糖胞苷的作用。綜上，利用這6種顯著差異代謝物可以對AML進(jìn)行早期診斷和預(yù)后分析，還可以考慮將糖酵解抑制劑與化療藥合用治療AML。

Wang等[34]應(yīng)用氫譜核磁共振(1H-NMR)對183例新發(fā)AML患者和232例健康志愿者的血清進(jìn)行了代謝組學(xué)研究。將AML患者按照外周血或骨髓白血病細(xì)胞的核型分為58例低危、119例中危和6例高危AML患者，并與健康志愿者的血清進(jìn)行對比。經(jīng)過ANOVA與OPLS-DA等模式識別方法發(fā)現(xiàn)代謝特征并成功建立了不僅能夠區(qū)分健康志愿者與患者，還能區(qū)分低危與中危AML患者的模型。AML患者血清中苯丙氨酸、葡萄糖等小分子代謝物含量升高，膽堿、高密度脂蛋白等含量下降。與低危組患者比較，中危組患者血清中異亮氨酸、谷氨酸、膽堿和高密度脂肪酸等代謝物含量上升，而低密度脂肪酸和極低密度脂肪酸含量下降?；?H-NMR 的代謝組學(xué)方法檢測到的小分子代謝物可以用于白血病的早期診斷和病情嚴(yán)重程度的判斷。

綜上，由于白血病細(xì)胞的代謝重編程，可以利用代謝組學(xué)發(fā)現(xiàn)白血病的內(nèi)源性小分子代謝物，從而實現(xiàn)白血病的早期診斷，現(xiàn)將以上研究總結(jié)，見表1。

表1 內(nèi)源性小分子差異代謝物在白血病早期診斷中的應(yīng)用舉例

4 內(nèi)源性小分子代謝物在白血病藥效機制中的研究

Zhang等[35]運用HPLC-MS進(jìn)行雷公藤紅素治療急性早幼粒白血病(APL)的機制研究，通過對照組與不同濃度雷公藤紅素干預(yù)的APL 細(xì)胞HL-60的細(xì)胞代謝組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，尿苷是對照組與治療組的顯著代謝差異物，且隨著雷公藤紅素濃度的增高，尿苷含量呈下降趨勢。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，尿苷可以抑制細(xì)胞凋亡，尿苷的缺乏可以促進(jìn)雷公藤紅素誘導(dǎo)的線粒體凋亡。因此，雷公藤紅素可以通過降低尿苷含量發(fā)揮促進(jìn)HL-60凋亡的作用。

二甲雙胍常用作治療2型糖尿病，近年來研究表明，二甲雙胍可以通過抑制線粒體復(fù)合體Ⅰ使得一磷酸腺苷(AMP)水平升高，進(jìn)一步影響能量代謝，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長[36-37]。Scotland等[38]用液相色譜-線性離子阱/靜電場軌道阱組合式高分辨質(zhì)譜(LC-LTQ Orbitrap MS)對AML細(xì)胞內(nèi)代謝物進(jìn)行了代謝組學(xué)研究。發(fā)現(xiàn)使用二甲雙胍后，糖酵解的上游代謝產(chǎn)物(6-磷酸葡萄糖、6-磷酸果糖、1，6-二磷酸果糖)、磷酸戊糖途徑的氧化產(chǎn)物和肉堿含量下降，乙酰肉堿和嘌呤增加。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍在抑制線粒體復(fù)合體Ⅰ電子轉(zhuǎn)運的同時，能夠通過增強糖酵解與脂肪酸代謝抑制白血病細(xì)胞的增殖。這些內(nèi)源性小分子代謝物為白血病藥效機制研究提供了一個新的視角。

苯扎貝特(BEZ)在臨床上常用于治療高血脂癥[39]，Southam等[40]利用13C標(biāo)記的葡萄糖與直接進(jìn)樣傅立葉變換離子回旋共振(FT-ICR)質(zhì)譜技術(shù)來測量AML細(xì)胞系和伯基特淋巴瘤細(xì)胞系中脂質(zhì)組代謝與脂質(zhì)合成的變化，從而研究BEZ 和醋酸甲羥孕酮(MPA)合用治療白血病和淋巴瘤的機制，研究發(fā)現(xiàn)其可以通過減少硬脂酰輔酶A去飽和酶1(SCD1)含量和單鏈不飽和脂肪酸的合成發(fā)揮抗癌作用。這是臨床上首次報道靶點是SCD1的治療白血病和淋巴瘤的藥物。

St?ubert等[41]利用RNA測序、非靶向代謝組學(xué)方法和同位素標(biāo)記質(zhì)譜分析技術(shù)對過量表達(dá)P-糖蛋白的急性T淋巴細(xì)胞白血病耐柔紅霉素機制進(jìn)行了細(xì)胞代謝組學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)耐藥白血病細(xì)胞泛酸的吸收能力下降，對糖分的需求增加，更多地依靠糖酵解和三羧酸循環(huán)供能，脂肪酸氧化和谷氨酰胺分解降低。這項研究促進(jìn)了急性T淋巴細(xì)胞白血病耐藥的機制研究。

5 討論

目前，代謝組學(xué)主要通過色譜、質(zhì)譜與核磁共振技術(shù)以及它們之間的聯(lián)合使用檢測出白血病的代謝物，然后經(jīng)后續(xù)的模式識別方法和統(tǒng)計分析尋找出顯著性內(nèi)源小分子代謝物，進(jìn)一步找出相關(guān)代謝通路，從而實現(xiàn)對白血病的發(fā)病機制、診斷和藥效機制的研究。在白血病發(fā)病機制研究方面，通過代謝組學(xué)技術(shù)與其他分子生物學(xué)技術(shù)合用，揭示了氧化應(yīng)激和維生素C在白血病發(fā)病機制中的重要作用。從現(xiàn)有的研究可以看出，白血病患者的代謝重編程主要涉及脂肪酸代謝、重要氨基酸代謝和糖酵解與糖異生過程，其中的內(nèi)源性小分子代謝物可以輔助白血病的早期診斷和病情判斷。另外，內(nèi)源性小分子代謝物還可以用于探索雷公藤紅素、二甲雙胍與BEZ對白血病的藥效機制研究，白血病對柔紅霉素的耐藥機制也逐漸清晰。由于代謝組學(xué)分析的樣本通常是血液和細(xì)胞，因此避免了因骨穿這一侵入性檢查方式造成的心理和身體創(chuàng)傷，以一種微創(chuàng)的方式實現(xiàn)白血病的早期診斷和機制研究是代謝組學(xué)的一大優(yōu)勢。同時，相對于基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)，代謝組學(xué)檢測的是基因、蛋白等綜合因素作用下的最終代謝物變化，比其他組學(xué)更能綜合、全面地反映白血病患者的生物狀態(tài)。代謝物種類也遠(yuǎn)少于基因與蛋白的數(shù)目，研究相對簡單。

隨著代謝組學(xué)的發(fā)展，代謝組學(xué)越來越多地與基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等相結(jié)合，利用各組學(xué)之間的優(yōu)勢共同探討白血病的發(fā)生發(fā)展。同時，代謝組學(xué)技術(shù)也常與RNA測序、同位素標(biāo)記等分子生物學(xué)技術(shù)一起使用，利于對白血病進(jìn)行深層次的研究，找出更有意義的顯著的差異代謝物，促進(jìn)白血病發(fā)病機制、早期診斷、藥效機制等方面研究的發(fā)展。這種多組學(xué)、多技術(shù)合用的研究方式，也是代謝組學(xué)未來發(fā)展的一個重要趨勢。

雖然利用代謝組學(xué)在白血病研究方面取得了一些成就，但仍存在一些待改進(jìn)之處：①由于代謝組學(xué)起步較晚，代謝組學(xué)數(shù)據(jù)庫仍需要進(jìn)一步完善，代謝組學(xué)的數(shù)據(jù)處理和分析方法需要進(jìn)一步發(fā)展，這樣更有利于準(zhǔn)確分析代謝通路，探究白血病發(fā)生機制。②目前雖然已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了白血病中的多種差異代謝物，但是不同的文獻(xiàn)中發(fā)現(xiàn)的潛在標(biāo)志物及涉及的代謝通路差異較大，仍需整合多方面的資源信息構(gòu)建全面的白血病代謝網(wǎng)絡(luò)。③目前的研究樣本大多以血液或細(xì)胞為分析對象，如果能夠?qū)⒛X脊液與尿液等更多的生物樣本一同綜合分析，將能夠更好的表征由白血病引起的代謝變化。④雖然應(yīng)用代謝組學(xué)發(fā)現(xiàn)了多種與白血病密切相關(guān)的內(nèi)源性小分子代謝物，但缺乏臨床大樣本研究驗證其可靠性，與實際運用還有一定的差距。