曾棋平，蔡小輝，吳坤林，楊麗娜，曹毅祥，陳錦珊

(中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九○九醫(yī)院/廈門大學(xué)附屬東南醫(yī)院制劑科，福建 漳州,363000)

中藥制劑具有高度的復(fù)雜性，通過多成分、多途徑、多靶點發(fā)揮藥效作用。中藥的整體藥效是制劑中所含的“藥效物質(zhì)成分群”綜合作用的結(jié)果[1-3]。當(dāng)前，在眾多的中藥質(zhì)量控制方法中，指紋圖譜切實可行且被國內(nèi)外廣泛認(rèn)可。然而，藥效活性成分并不一定是指紋圖譜所體現(xiàn)的化學(xué)成分，含量高并不等于活性高。因此，單純的指紋圖譜還不能準(zhǔn)確全面評價中藥的成分與藥效之間的相關(guān)信息，存在一定的局限性[4]。近年來，譜效關(guān)系學(xué)已成為中藥研究的新領(lǐng)域[5-6]。中藥譜效關(guān)系就是以中醫(yī)藥理論研究為基礎(chǔ)，通過指紋圖譜與藥效之間的相互關(guān)系揭示中藥所含化學(xué)成分與藥效之間的相關(guān)性，最終確定相應(yīng)的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，使構(gòu)建的指紋圖譜用于中藥質(zhì)量控制更具有針對性。

復(fù)方首烏藤合劑為廈門大學(xué)附屬東南醫(yī)院特色制劑，主要由首烏藤、合歡皮、五味子、蔓荊子、續(xù)斷、川芎、菟絲子、煅牡蠣八味藥材組成，具有清心安神、滋陰清肝、活血行氣、祛風(fēng)止痛等功效，臨床上用于治療神經(jīng)衰弱性失眠[7-9]。雖該方臨床功效確切，但其整體復(fù)方的藥效成分群以及配伍的現(xiàn)代科學(xué)依據(jù)仍未闡明。本實驗研究復(fù)方首烏藤合劑的指紋圖譜與抗失眠作用，采用正交投影偏最小二乘法(orthogonal partial least square，OPLS)對兩者進行相關(guān)性分析，旨在尋找對抗失眠貢獻(xiàn)較大的藥效成分群，初步闡明該復(fù)方配伍的科學(xué)依據(jù)，以便更好地對其進行質(zhì)量控制。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1200型高效液相色譜儀(DAD檢測器，美國Agilent公司)；BT224S型電子分析天平(精度：0.1 mg，德國賽多利斯集團)；PHS-3C型pH計(杭州雷磁分析儀器廠)；RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；H1650R高速冷凍離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司)；680型酶標(biāo)測試儀(美國BIO-RAD公司)。

1.2 藥物與試劑

對照品：五味子醇甲(批號：110857-201513，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.9%)、綠原酸(批號：110753-200413，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.9%)、鹽酸川芎嗪(批號：817-200104，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.9%)，均購自中國食品藥品檢定研究院；二苯乙烯苷(批號：GZDD-0506，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%)、合歡皮木脂素苷(批號：GZDD-0817，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%)、阿魏酸(批號：GZDD-0022，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99%)、川續(xù)斷皂苷Ⅵ(批號：GZDD-0006，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%)，均購自貴州迪大生物科技有限責(zé)任公司。藥材：首烏藤PolygonimultifloriCaulis(PMC，批號：20150828，產(chǎn)地：湖北)為蓼科植物何首烏PolygonummultiflorumThunb.的干燥藤莖，合歡皮AlbiziaeCortex(AC，批號：20170214，產(chǎn)地：湖北)為豆科植物合歡AlbiziajulibrissinDurazz.的干燥樹皮，菟絲子Cuscutaesemen(CS，批號：20160320，產(chǎn)地：內(nèi)蒙)為旋花科植物南方菟絲子CuscutaaustralisR.Br.或菟絲子CuscutachinensisLam.的干燥成熟種子，牡蠣(煅)Ostreaeconcha(OC，批號：20150605，產(chǎn)地：浙江)為牡蠣科動物長牡蠣OstreagigasThunberg大連灣牡蠣OstreatalienwhanensisCrosse或近江牡蠣OstrearivularisGould的貝殼，蔓荊子Viticisfructus(VF，批號：20150102，產(chǎn)地：江西)為馬鞭草科植物單葉蔓荊VitextrifoliaL.var.simplicifoliaCham.或蔓荊VitextrifoliaL.的干燥成熟果實，續(xù)斷Dipsaciradix(DR，批號：20161107，產(chǎn)地：四川)為川續(xù)斷科植物川續(xù)斷DipsacusasperWall.ex Henry的干燥根，均購自福建尤溪仙錦藥業(yè)有限公司；五味子SchisandraechinensisFructus(SCF，批號：201702374，產(chǎn)地：遼寧)為木蘭科植物五味子Schisandrachinensis(Turcz.) Baill.的干燥成熟果實，川芎Chuanxiongrhizoma(CR，批號：201703358，產(chǎn)地：四川)為傘形科植物川芎LigusticumchuanxiongHort.的干燥根莖，均購自樟樹市慶仁中藥飲片有限公司；DL-4-氯苯丙氨酸[批號：A13323，阿法埃莎(中國)化學(xué)有限公司]；0.9%氯化鈉注射液(100 ml/袋，自制)；碳酸氫鈉(批號：180425，上海虹光化工廠)；地西泮片(規(guī)格：2.5 mg，上海信誼藥廠有限公司)；聚山梨酯-80(批號：180801，四川金山制藥有限公司)，羧甲基纖維素鈉(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)；大鼠5-羥色胺試劑盒(上海極威生物科技有限公司)；乙腈、磷酸為色譜純，其余試劑為分析純，水為純化水。

1.3 實驗動物

SPF級雄性SD大鼠，72只，體重(180±20)g，購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司，動物使用許可證號：SCXK(滬)2012-0002。

2 方法與結(jié)果

2.1 混合對照品溶液的制備

取鹽酸川芎嗪、綠原酸、阿魏酸、二苯乙烯苷、合歡皮木脂素苷、川續(xù)斷皂苷Ⅵ、五味子醇甲對照品適量，精密稱定，加甲醇制成混合對照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備

稱取首烏藤18.75 g、合歡皮12.5 g、五味子4.17 g、蔓荊子 4.17 g、續(xù)斷12.5 g、川芎7.5 g、菟絲子12.5 g、煅牡蠣9.44 g，按表1的設(shè)計進行回流提取，提取溶劑為水，最終均加水制成100 ml，搖勻，即得樣品溶液。精密量取樣品溶液5 ml，置10 ml量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得，分別標(biāo)記為S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8和S9。

表1 復(fù)方首烏藤合劑樣品制備工藝的正交試驗分析

2.3 指紋圖譜的建立

2.3.1色譜條件

色譜柱：Agilent C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈-0.1%磷酸溶液，梯度洗脫：0～10 min，2%～3%乙腈；10～35 min，3%～9%乙腈；35～50 min，9%～13%乙腈；50～65 min，13%～18%乙腈；65～85 min，18%～25%乙腈；85～100 min，25%～35%乙腈；100～107 min，35%～65%乙腈；107～118 min，65%～90%乙腈；118～120 min，90%～2%乙腈；流速：1.0 ml/min；檢測波長：210 nm；柱溫：25 ℃；進樣量：10 μl。

2.3.2方法學(xué)考察

取“2.2”項下供試品溶液(S5)，按“2.3.1”項下條件連續(xù)進樣6次，記錄色譜圖，結(jié)果各色譜峰相對保留時間和峰面積的RSD均<1.0%，表明儀器精密度良好。取“2.2”項下同一供試品溶液(S5)，分別于制備后0、2、4、6、8、12、24 h按“2.3.1”項下條件進樣，記錄色譜圖，結(jié)果各色譜峰相對保留時間和峰面積的RSD均<3%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。從同一提取液(S5)中按“2.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.3.1”項下條件測定，結(jié)果各色譜峰相對保留時間和峰面積的RSD均<5%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.3指紋圖譜的建立及色譜峰的確定

采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012年版)軟件，以表1中S5樣品的色譜圖為參照譜，時間窗口設(shè)為0.5 min，選擇各圖譜中均含有且峰形相對好的色譜峰進行多點校正，運用平均數(shù)法生成對照圖譜。結(jié)果從9張圖譜中篩選了21個特征峰(X0～X20)作為研究對象(圖1)，復(fù)方首烏藤藥材指紋圖譜色譜峰匹配數(shù)據(jù)見表2。

圖1 復(fù)方首烏藤合劑的HPLC指紋譜及其對照指紋譜(R)

峰面積樣品組S1S2S3S4S5S6S7S8S9X05487.588985.559962.618966.26469.327462.19780.638794.18794.1X12875.512855.395281.474577.354457.532936.374036.423439.973439.97X2896.651145.691240.841242.88832.75943.851121.931020.251020.25X31457.252623.12713.52281.191516.642254.123437.722444.992444.99

(續(xù)表2)

2.4 酶聯(lián)免疫吸附法測定大鼠海馬體5-HT的含量

2.4.1DL-4-氯苯丙氨酸混懸液的制備

處方：DL-4-氯苯丙氨酸(PCPA)15 g，聚山梨酯80 2.0 g，羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)3.0 g，0.9%氯化鈉注射液(pH7～8)加到500 ml。

制法：量取0.9%氯化鈉注射液500 ml于燒杯中，緩慢滴加5%碳酸氫鈉溶液，用pH計調(diào)節(jié)pH在7～8之間，加入CMC-Na，攪拌均勻，繼續(xù)加入處方量的PCPA和聚山梨酯-80，超聲15 min，于攪拌狀態(tài)下分裝于耐高溫的玻璃瓶內(nèi)，蓋塞軋口密封，100℃流通蒸汽滅菌30 min。

2.4.2供試品溶液的制備

取“2.2”項下的9組復(fù)方首烏藤合劑各100 ml，分別濃縮至約80 ml，即得濃度(含生藥量)為1.0 g/ml的供試品溶液，于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4.3地西泮溶液的制備

取地西泮片劑10片，研磨成粉末，加純化水適量，充分?jǐn)嚢枋谷芙猓D(zhuǎn)移至100 ml量瓶中，加純化水稀釋至刻度，即得濃度為0.25 mg/ml的陽性對照液。

2.4.4動物分組、造模及給藥

將72只SPF級SD大鼠，隨機分為12組，分別為正常組、模型組、陽性對照組、9批復(fù)方首烏藤合劑組，每組6只。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，除了正常組外，對其余各組大鼠進行腹腔注射PCPA(300 mg/kg)制作失眠模型，每日1次，連續(xù)2 d，在第1次腹腔注射PCPA的48 h后，大鼠出現(xiàn)白晝萎靡不振、食欲降低。而夜間活動頻繁、興奮性增高、易激惹且攻擊性增強，對外界的聲光等刺激異常敏感。此外，大鼠尾部多處出現(xiàn)撕咬痕跡且破損出血，晝夜節(jié)律紊亂，表明造模成功。于第10天進行灌胃給藥，正常組和模型組給予適量的生理鹽水，陽性對照組和不同批次的復(fù)方首烏藤組給藥量分別為4.2 ml/kg和6.8 ml/kg，每天給藥1次，連續(xù)7 d。

2.4.5海馬體取材和含量測定

將大鼠放入裝有浸潤乙醚(乙醚量為1～1.5 ml)棉球的標(biāo)本缸內(nèi)，觀察大鼠情況，待大鼠進入麻醉期后，處死，固定于自制的手術(shù)木板置于解剖盤中，開胸暴露并游離出心臟，經(jīng)左心室插入灌流針并固定，切開右心耳，先灌注無菌生理鹽水(4℃)，直到肝和肺臟顏色轉(zhuǎn)白及右心房流出液澄清，再灌注4%多聚甲醛(4℃)，斷頭取腦，沖凈血液后，在冰上分離出各組大鼠的海馬組織，并稱重，將組織進行勻漿，于高速冷凍離心機離心(5 000×g)10 min，取上層清液，置于-80℃冰箱中保存，備用。采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)進行5-羥色胺(5-HT)的測定，實驗步驟按照試劑盒具體要求進行操作，用酶聯(lián)免疫檢測儀在吸收波長450 nm處測得光密度(OD)值，復(fù)方首烏藤合劑鎮(zhèn)靜催眠藥效值為各組大鼠海馬體中5-HT的含量，結(jié)果見表3。

表3 各組失眠大鼠海馬體中的5-HT含量

*P<0.05，與模型組比較

2.5 譜效關(guān)系的偏最小二乘回歸分析

2.5.1偏最小二乘回歸方程的建立

以標(biāo)準(zhǔn)化處理的指紋圖譜中各特征峰峰面積為自變量X，以各組失眠大鼠海馬體中的5-HT含量水平為因變量Y，采用SIMCA-P 14.1軟件對其進行OPLS回歸分析，結(jié)果見圖2，得方程：

Y=0.064 0X0+0.086 7X1+0.052 4X2-0.025 3X3-0.051 6X4-0.078 6X5+0.038 4X6+0.094 5X7+ 0.066 0X8- 0.018 3X9+ 0.066 1X10-0.067 8X11+0.050 8X12-0.124 5X13+0.010 4X14-0.061 4X15-0.077 4X16-0.032 8X17-0.101 0X18+0.001 3X19+0.019 0X20

式中,系數(shù)越大表明該自變量對藥效影響越大，并且系數(shù)為正值說明其與藥效呈正相關(guān)，負(fù)數(shù)則表示與藥效呈負(fù)相關(guān)。

2.5.2變量投影重要性分析

變量投影重要性(variable importance in projection，VIP)是反映自變量對因變量解釋能力的1個重要指標(biāo)，其值越大說明該自變量對因變量的解釋能力越強。一般認(rèn)為，當(dāng)VIP值>1時，自變量在解釋因變量時具有顯著重要性，VIP分析結(jié)果見圖3。OPLS回歸分析結(jié)果表明X1、X4、X5、X8、X9、X10、X12、X13、X14、X15、X16和X18的VIP值均>1，排序為X8>X16>X12>X5>X18>X1>X9>X15>X4>X10>X13>X14，其中X1、X10、X12、X14與5-HT含量水平呈正相關(guān)，而X1、X10、X12的VIP值較大，當(dāng)它們含量增加時，復(fù)方首烏藤合劑提高5-HT水平的能力則會顯著增強；X4、X5、X8、X9、X13、X15、X16、X18與5-HT水平呈負(fù)相關(guān)，X8、X16、X5、X18的回歸系數(shù)和VIP絕對值均較大，當(dāng)它們含量增加時，復(fù)方首烏藤合劑提高5-HT水平的能力則會減弱。

圖2 復(fù)方首烏藤合劑抗失眠譜效相關(guān)性的PLSR模型回歸系數(shù)

圖3 各特征峰對復(fù)方首烏藤合劑抗失眠活性的VIP貢獻(xiàn)

2.5.3色譜峰的成分鑒定

采用已有對照品進行HPLC分析，匹配出X4為鹽酸川芎嗪，X8為綠原酸，X11為阿魏酸，X12為二苯乙烯苷，X13為合歡皮木脂素苷，X17為川續(xù)斷皂苷Ⅵ，X19為五味子醇甲，見圖4。

圖4 混合對照品的HPLC圖 X4.鹽酸川芎嗪；X8.綠原酸；X11.阿魏酸；X12.二苯乙烯苷；X13.合歡皮木脂素苷；X17.川續(xù)斷皂苷Ⅵ；X19.五味子醇甲

3 討論

中藥組分復(fù)雜，其療效的發(fā)揮為多成分、多靶點、多途徑協(xié)調(diào)作用的結(jié)果，單一或幾個化學(xué)成分的定量檢測難以全面評價中藥質(zhì)量的優(yōu)劣。譜效關(guān)系研究實際上是數(shù)學(xué)相關(guān)分析與藥學(xué)的一個交叉應(yīng)用，如何進行譜效關(guān)系研究尚未有統(tǒng)一的認(rèn)識和適用模式。分析方法主要有最小二乘法分析、灰色關(guān)聯(lián)度分析、聚類分析等[10-12]。本試驗采用的正交投影偏最小二乘法是一種改進的偏最小二乘法，能有效去除預(yù)測矩陣中與因變量無關(guān)的信息，改善了模型的解釋性和真實性[13]。研究結(jié)果顯示，復(fù)方首烏藤合劑抗失眠作用中有12個成分較為重要，也解釋了該合劑抗失眠作用并非某一具體成分的藥效，而是多成分協(xié)同起效的結(jié)果。

本實驗選用乙腈-0.1%磷酸溶液作為流動相，采用梯度洗脫方式，所得的HPLC圖譜基線平穩(wěn)，共有色譜峰數(shù)目較多，各主要成分峰分離度較好。采用DAD檢測器在190～400 nm范圍內(nèi)進行全波長掃描，發(fā)現(xiàn)波長在210 nm時色譜峰數(shù)量較多，整體圖譜較為勻稱，因此將210 nm作為檢測波長。

由于5-HT是一種重要的中樞神經(jīng)遞質(zhì)，參與多種行為情緒活動尤其是睡眠的調(diào)節(jié)，大鼠腹腔注射PCPA后，可選擇性地阻斷腦內(nèi)5-HT的合成。PCPA誘導(dǎo)的大鼠失眠模型具有造模時間短、經(jīng)濟、簡便易行、造模成功率高、病變典型、重復(fù)性高等優(yōu)點，是國內(nèi)外較為公認(rèn)的失眠模型[14]。因PCPA溶解度差，直接采用弱堿性生理鹽水(pH7～8)溶解會導(dǎo)致混懸液易沉降、注射劑量不準(zhǔn)確、堵塞注射器等問題。本研究在參考相關(guān)文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上[15]，通過添加聚山梨酯-80和CMC-Na等助懸劑，配制的PCPA混懸液微粒大小均勻、沉降速度慢，具有良好的再分散性。

中藥指紋圖譜可以反映藥材多種化學(xué)成分的整體性差異，而生物評價既關(guān)聯(lián)臨床功效又關(guān)聯(lián)機制。因此，將化學(xué)指紋圖譜與生物活性評價相結(jié)合，構(gòu)建基于化學(xué)指紋圖譜與藥效的綜合評控模式有利于對中藥制劑進行更合理的評控[16]。通過基于譜效相關(guān)性的研究，課題組發(fā)現(xiàn)復(fù)方首烏藤合劑中的3個成分對其抗失眠作用貢獻(xiàn)度較高，初步探討了其抗失眠的物質(zhì)基礎(chǔ)。然而，通過對照品匹配，僅指認(rèn)出7個色譜峰，與活性顯著相關(guān)的色譜峰指認(rèn)出1個(二苯乙烯苷)，在后續(xù)研究中，將通過Q-TOF或LC-MS/MS等研究手段對未知色譜峰進行結(jié)構(gòu)鑒定，以進一步明確復(fù)方首烏藤合劑中與抗失眠活性相關(guān)的活性成分。